利用实时定量PCR快速鉴定棉花黄萎病抗性的方法

摘要

本发明涉及棉花黄萎病抗性鉴定领域，具体涉及利用实时定量PCR快速鉴定棉花黄萎病抗性的方法。所述方法包括以下步骤：1)棉花幼苗的培养及接菌；2)棉苗根部组织DNA的提取；3)实施定量(Q‑PCR)分析；4)棉花品种抗病性评价。本发明的方法能够更加快速、准确、高效的鉴定品种的抗病性，在抗病品种分子辅助选择中有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及棉花黄萎病抗性鉴定领域，具体涉及利用实时定量PCR快速鉴定棉花黄萎病抗性的方法。

背景技术

棉花黄萎病(Verticillium wilt)是影响我国棉花生产的主要病害，严重影响着棉花产量和品质，是一种一旦侵染就难于防治的维管束病害，因此被称为“棉花的癌症”。在我国，由黄萎病造成的产量损失为15～30％，年经济损失约为12亿元人民币。有效控制黄萎病危害是棉花高产、稳产的关键，种植抗病品种是控制其危害的最经济有效措施，而选育抗病品种的核心是准确评价品种的抗病性。

棉花品种抗黄萎病性鉴定方法分为成株期鉴定方法和苗期鉴定方法。由于棉花黄萎病是一种成株期病害，发生危害期为棉花的现蕾初期到收获期，且不同品种对黄萎病的抗性与生育期相关，采用成株期鉴定能更真实反应棉花品种的抗黄萎病性。目前，成株期鉴定一般采用重病田或人工病圃，重病田鉴定由于不能控制病原菌的数量、发病不均匀等问题，只能用于育种材料的初筛，人工病圃成株期鉴定方法是对品种进行把关鉴定最可靠方法，并于2009年发布实施了国家标准GB/T22101.5-2009。苗期鉴定主要是通过菌液浇根、蘸根，针刺等方法接菌，与成株期鉴定相比，鉴定周期大大地缩短了，比较容易掌握、重复性也较好。但也存在以下不足：(1)反映的是苗期的抗性，且人为伤根，很难达到对品种抗性综合评价的目的。(2)需要严格的环境条件，且技术环节不易掌握。如：需控制适宜的温湿度、抗病和感病对照、接种时期、接种浓度和接种量、调查时期等。(3)耗费人力和物力，鉴定周期偏长。如：需要对土壤或基质进行灭菌、制作营养钵、培养病原菌等，仍需40天左右的鉴定周期。

鉴于棉花黄萎病发病周期长，在成株期和苗期鉴定棉花黄萎病抗性耗时较长，受环境影响大，为了满足研究者的不同需求，有必要摸索棉花抗性快速鉴定的方法。棉花根部是黄萎病菌侵入寄主的第一道屏障，感抗品种的根部分泌物对黄萎病菌生殖生长和孢子萌发影响不同，前者起促进作用，后者则呈现抑制作用。由于不同抗性棉花品种根系分泌物的差异，或许会引起病原菌在根部定殖量的差异。目前很多研究结果已经证明荧光定量PCR技术能够有效地区分抗性水平不同的植物寄主，并不用单纯通过植株外部病症严重程度进行评价。

为了建立快速、准确、高效鉴定品种的抗病性，本发明旨在通过用摸索黄萎病菌接种水培棉苗的最佳取样时间，结合荧光定量PCR技术，探讨棉苗根部病菌定殖量和抗性之间的关系，为棉花品系抗性快速鉴定提供一种新方法。

发明内容

本发明的发明人为了建立一种更加快速、准确、高效鉴定棉花品种抗病性的方法，提出并完成本发明。

根据本发明的利用实时定量PCR快速鉴定棉花黄萎病抗性的方法包括步骤：

(1)待鉴定棉花品种幼苗的培养及接菌

将经过消毒处理的种子，播种于蛭石和沙土体积比为6:4的基质中，待两片子叶长成时移栽到装有棉花营养液的水培盆中，采用定量浸根法接种棉花黄萎病病菌；

(2)棉苗根部病菌定殖量检测

取接菌1天后的待鉴定棉花品种的根，提取棉花根部基因组DNA，以特异性引物Vdβt-F:AACAACAGTCCGATGGATAATTC，Vdβt-R:GTACCGGGCTCGAGATC进行荧光定量PCR反应；

(3)棉花品种抗黄萎病性评价

依据棉花根部DNA中黄萎病菌的DNA含量评价棉花品种抗黄萎病性，评价标准为：0-1pg>-1之间为抗性品种，1-2pg>-1之间的是耐病品种，大于2pg>-1的为感病品种。

根据本发明的具体实施方式，所述鉴定棉花品种抗病性的方法包括步骤：

(1)待鉴定棉花品种幼苗的培养及接菌

将经过消毒处理的种子，播种于蛭石和沙土(V:V＝6:4)基质中，待两片子叶长成时小心移栽到装有棉花营养液的水培盆中，用软海绵包裹棉苗茎部，插入预先搭好的微孔泡沫塑料洞孔中，每个品种20棵苗。一周更新一次植物营养液，保证氧气充足，棉苗生长良好。

采用定量浸根法，具体操作为，将水培苗取出，放在装有孢子悬浮液(孢子浓度为1×10⁷/mL，)的大烧杯内静置40分钟，保证所有根系均在液面以下，将接完菌的棉苗重新放入植物营养液中，继续培养。

(2)棉苗根部病菌定殖量检测

取接菌1天后各棉花品种的根，采用改进的CTAB法提取棉花根部基因组DNA。以计特异引物(Vdβt-F:AACAACAGTCCGATGGATAATTC，Vd βt-R:GTACCGGGCTCGAGATC)，对不同棉花品种的根部基因组DNA在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。

(3)棉花品种抗黄萎病性评价

以CT值为纵坐标，DNA样品浓度的对数值为横坐标作图，绘制DNA标准曲线及计算回归方程，依据棉花根部DNA中黄萎病菌的DNA含量来评价棉花品种抗黄萎病性，评价标准为：0-1pg>-1之间为抗性品种，1-2pg>-1之间的是耐病品种，大于2pg>-1的为感病品种。

根据本发明的方法具有以下特点：

1.营养均衡，根系发育整齐，采用蛭石和沙土(V:V＝6:4)为基质进行育苗，之后转移到装有棉花营养液的水培盆中，便于水、肥管理，营养均匀，棉苗生长整齐一致，根系发育良好。

2.定量浸根，接菌充分、均匀，本发明采用浸根接菌的方法，具体操作为，在棉花一片真叶平展时，取出水培苗，将整个根系全部浸泡在孢子悬浮液(浓度为1×10⁷/mL)中，静置40分钟，保证所有根系均在液面以下，接菌量充分、均匀。

3.受环境影响小，准确性高，棉花黄萎病的发生受环境影响较大，尤其是温度，温度过高或过低，棉苗都不会发病。因此，传统的苗期鉴定，多在温室进行，需要严格的环境条件，且技术环节不易掌握。本发明主要是鉴定寄主组织内定殖的病原菌量，在棉花品种接种后1天没表现出任何发病症状的时候就可以进行。这使得该技术克服了传统病级评价方法中受环境影响大、准确性不高等缺陷。

4.鉴定周期短，可快速鉴定棉花材料或品种的抗病性，传统的温室培养，一般接种病原菌7天左右开始发病，15-20天达到鉴定要求(感病对照冀棉11病情指数在40.0～66.7)，鉴定周期为40天左右。本发明通过荧光定量PCR技术能够在棉花品种表现出明显发病症状前定量鉴定寄主组织内定殖的病原菌，从而判断棉花品种的抗病性，整个鉴定周期约为15天左右(包括基质育苗4-5天，水培至一片真叶5-7天，接菌后1天，取样、提取DNA，采用Q-PCR鉴定2-3天)，大大的缩短了鉴定周期。

附图说明

图1水培棉花幼苗根部定量浸根接菌现场

图2利用Q-PCR快速鉴定棉花黄萎病抗性中绘制的标准曲线

具体实施方式

实施例1

1.棉苗培育

所用的棉花种子均经硫酸脱绒，并经3％的H₂O₂表面消毒10min，再用55～60℃温水浸泡30分钟，然后加入凉水，浸泡12h后，凉干备播。

采用蛭石和沙土为基质，体积比为6:4，播种清水过夜浸泡的棉花光子，洒水保湿，待两片子叶长成时小心移栽到装有棉花营养液的水培盆中，用软海绵包裹棉苗茎部，插入预先搭好的微孔泡沫塑料洞孔中，每个品种20棵苗。一周更新一次植物营养液，保证氧气充足，棉苗生长良好。

2.病原菌培养及接菌

将在PDA培养基上纯化好的大丽轮枝菌(VD076)，接种2mm2菌饼于Czapek液体培养基(NaNO₃，2.00g；K₂HPO₄，1.00g；KCI，0.50g；MgSO₄·7H₂O，0.50g；FeSO₄，0.01g；蔗糖30.00g；用水定容至1000ml)中，置于25℃摇床振荡，140r/min暗培养约6天，用4层纱布过滤菌液，弃掉菌丝，用无菌水将棉花黄萎病菌孢子浓度调整至1×10⁷/mL，在棉花一片真叶平展时接菌。采用蘸根法，具体操作为，将水培苗取出，放在装有孢子悬浮液的大烧杯内静置40分钟，保证所有根系均在液面以下，将接完菌的棉苗重新放入植物营养液中，继续培养。

3.棉花品种根部DNA的提取

取接菌后各棉花品种的根，用流动的自来水冲洗干净，再用灭菌蒸馏水冲洗一遍，吸水纸充分吸干水份，剪成小段，锡箔纸包裹，液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。采用CTAB法提取棉花根部基因组DNA。

4.棉花根部黄萎病菌的定量检测

设计特异引物(Vdβt-F:AACAACAGTCCGATGGATAATTC，Vdβt-R:GTACCGGGCTCGAGATC)，对不同棉花品种的根部基因组DNA在Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪中进行荧光定量PCR反应。

6.标准曲线的制作

以梯度稀释的大丽轮枝菌基因组DNA(10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3ng/ul)为模板，在Bio-Rad>

7.最佳取样时间的确定

以感病品种冀棉11、耐病品种鲁21、抗病品种中植棉2号为供试品种，分别在接菌后的第1天、2天、3天、4天、5天、6天和第7天取各棉花品种的根，提取DNA，并稀释成100ngμL^–1。进行Q-PCR分析，结果表明感病、耐病和抗病的代表品种根部的黄萎病菌菌量呈现出一致的趋势，也就是感病代表品种冀棉11根部的病菌含量最高，其次是耐病代表品种鲁棉研21，带菌量最少的是中植棉2号。分析不同取样时间三个品种的带菌量的差异显著性，结果显示在接菌后第一天感病品种冀棉11根部黄萎病菌含量较高，达到3pg>-1以上，抗病品种中植棉2号根部黄萎病菌含量较低(小于1pg>-1)，耐病品种鲁棉研21根部黄萎病菌含量介于两者之间。

7.棉花品种抗黄萎病性评价标准

以常用的15个抗、感、耐黄萎病品种为参考，以接菌后各棉花品种的根部DNA溶液(稀释成100ngμL^–1。)作为模板，用实时定量PCR仪进行荧光定量PCR扩增，每个浓度重复3次，背景分别为灭菌去离子水和100ng棉花根DNA。以CT值为纵坐标，DNA样品浓度的对数值为横坐标作图，绘制DNA标准曲线及计算回归方程，计算棉花根部病原菌的定殖量。结果表明接种病原菌1天后(VD076)菌株在不同抗性品种根部的定殖量有明显的差异，抗病品种中植棉2号和创0712定殖量为0.4pg>-1和0.3pg>-1，明显低于感病品种和耐病品种，感病品种冀棉11和新陆早7号的定殖量为5.0pg>-1和4.0pg>-1，耐病品种在1-1.5pg>-1之间，与病情指数相吻合(表1)。由此，本发明依据棉花根部DNA中黄萎病菌的DNA含量来评价棉花品种抗黄萎病性。并划定评价标准为：0-1pg>-1之间为抗性品种，1-2pg>-1之间的是耐病品种，大于2pg>-1的为感病品种。

表1常用棉花品种的病情指数与根部病原菌DNA含量对照表

2015年按照本发明的黄萎病评价方法，对32个品种(品系)进行了抗病性分析，同时在田间采用病情指数的方法进行对照比较，其中，中植棉2号和冀11分别为抗、感病对照。结果表明棉花品种根部病原菌的含量的变化趋势与病情指数的变化趋势是一致的，同时抗病品种根部病原菌的定殖量均小于1pg>-1，感病品种的根部病原菌的定殖量均大于2pgng^-1，耐病品种多介于两者之间。

表2,30个品种的病情指数与真菌DNA的含量对照表