一种生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

摘要

本发明公开了一种生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于：以黄芪甲苷为底物，通过菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834发酵，制得环黄芪醇。本发明以微生物发酵技术降解黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇，工艺简单易行、成本低，最终环黄芪醇的转化率达到60％以上、纯度高达95％以上，转化专一性较高；整个工艺过程在常温、常压下进行，所要求的设备条件低，适用于大批量生产。

说明书

技术领域

本发明公开了一种生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，属于医药化工领域。

背景技术

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。它始载于《神农本草经》，至今已有400多年的药用历史，目前仍为中医临床治疗最常用的药物之一。皂苷类化合物是黄芪属植物中最重要的一种活性成分，其中所含有的皂苷类化合物从结构上主要为环阿屯烷型的四环三萜类皂苷。环黄芪醇是黄芪皂苷的苷元部分，分子式为C₃₀H₅₀O₅、相对分子量为490.71。其在植株中含量极少，约占干重的0.1％，是黄芪甲苷在肠道内代谢的主要产物，虽然含量很低但是具有很好的生物学活性：促进神经细胞增值，促进伤口愈合，抗衰老等。尤其是环黄芪醇作为已知的唯一天然端粒酶激活剂在抗衰老，增强机体免疫力等方面具有不可替代的作用，具有广阔的市场前景。

传统的方法是直接从黄芪中提取环黄芪醇，但受制于黄芪中较低的含量，产率较低且成本较高，因此选择与环黄芪醇结构相似且含量较高的黄芪甲苷转化生产是一种可行的生产工艺。由于两者的差别只在于是否存在糖基修饰，目前国内的生产工艺均是利用各种方法打开糖苷键转化生产环黄芪醇。由于结构的不稳定性，一般的水解反应会产生大量的副产物黄芪醇，其破坏原有的环结构，造成分离的困难。

目前国内关于环黄芪醇相关生产方法报道很少，中国发明专利CN104817610A和中国发明专利CN103880910A依据化学原理直接酸水解糖苷键或者经过氧化还原破坏糖环结构再水解糖苷键，通过一系列步骤可以得到环黄芪醇，但是反应过程要求条件较高，工艺较为繁琐，这限制了大规模生产应用。

犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，属于真菌门、接合菌亚门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科。广泛分布于土壤、酒曲和粪便中，空气中常有它们的孢子存在，易污染其他微生物的纯培养物。犁头霉属被广泛的用于生物转化的研究，例如蓝色犁头霉Absdia orchidis由于具有C₁₁β-羟基化作用已用于氢化可的松的生产。

以微生物发酵技术制备环黄芪醇的方法尚未见报导。

发明内容

本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供一种高效、低成本、简单且产品纯度高的环黄芪醇制备方法，所要解决的技术问题是通过生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇。

本发明解决技术问题，采用如下技术方案：

本发明生物转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特点在于：以黄芪甲苷为底物，通过菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834发酵，制得环黄芪醇。具体包括如下步骤：

(1)种子培养

在锥形瓶中配制PDB培养基，然后接入菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834发酵，在摇床温度25～35℃、摇床转速150～200r/min的条件下培养3天，获得种子一级培养基；

(2)转化培养

将步骤(1)所获得的种子一级培养基按10％的接种量接入150mL改良PDB培养基中，在摇床温度25～35℃、摇床转速150～200r/min的条件下培养3天，然后加入25～50mg黄芪甲苷底物，继续培养6天，获得发酵液；

(3)纯化

将步骤(2)所得发酵液与萃取剂乙酸乙酯等体积混合后在室温下萃取三次、每次10min，所得萃取液真空浓缩至干，获得萃取物；

将萃取物溶解至甲醇中，再按照与萃取物质量比1:1的用量加入还原剂NaBH₄,常温反应10min，所得反应液分离、提纯，即获得目标产物环黄芪醇。

其中，所述改良PDB培养基的组成为：土豆浸出液300g/L，KH₂PO₄>4·H₂O1.5g/L，V_b>2PO₄>4·H₂O>b>

所述黄芪甲苷底物的纯度为50％～100％。

步骤(3)中分离、提纯的步骤为：在反应液中加入体积不少于反应液体积的水，40℃减压浓缩去甲醇，然后加入等体积的乙酸乙酯，静置分层；取有机相浓缩至干后以甲醇溶解，通过硅胶层析柱纯化，干燥，即获得目标产物。柱层析使用硅胶正相柱。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

该方法以微生物发酵技术降解黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇。该制备工艺简单易行、成本低，整个操作过程在常温、常压下进行，适用于大批量生产。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明以微生物发酵技术降解黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇，工艺简单易行、成本低，最终环黄芪醇的转化率达到60％以上、纯度高达95％以上，转化专一性较高；

2、本发明的整个工艺过程在常温、常压下进行，所要求的设备条件低，适用于大批量生产，有效解决了目前生产中原材料限制、提取率低等问题。

附图说明

图1为实施例1所得产物的色谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：

(1)种子培养

在锥形瓶中配制PDB培养基，然后接入菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，获得种子一级培养基；

(2)转化培养

将步骤(1)所获得的种子一级培养基按10％的接种量接入150mL改良PDB培养基中，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，然后加入50mg黄芪甲苷底物(黄芪甲苷含34.5mg)，继续培养6天，获得发酵液；

将步骤(2)所得发酵液与萃取剂乙酸乙酯等体积混合后在室温下萃取三次、每次10min，所得萃取液真空浓缩至干，获得萃取物；

将萃取物按10mg/mL的质量体积比溶解至甲醇中，再按照与萃取物质量比1:1的用量加入还原剂NaBH₄，常温反应10min，获得反应液；

在反应液中加入等体积的水，40℃浓缩去甲醇，然后加入等体积的乙酸乙酯，静置分层；取有机相浓缩至干后以甲醇溶解，通过硅胶层析柱纯化，干燥，即获得目标产物环黄芪醇。

经检测，产物纯度为95.5％、反应转化率61.5％。

纯度鉴定：将本实施例得到的环黄芪醇样品用高效液相色谱仪检测纯度，色谱条件：色谱柱为分析柱Hypersil GOLD column(4.6mm×150mm,5μm,Thermo Scientific)；柱温30℃；流动相：0min～13min甲醇：水＝75：25，13min～20min甲醇：水＝85：15，20min～30min甲醇100％；流速：1mL/min；上样量为10μL，ELSD漂移管温度120℃，ELSD气流量2.1L/min。检测出此样品的环黄芪醇纯度为95.5％，色谱图如图1所示。

实施例2

本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：

(1)种子培养

在锥形瓶中配制PDB培养基，然后接入菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834发酵，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，获得种子一级培养基；

(2)转化培养

将步骤(1)所获得的种子一级培养基按5％的接种量接入150mL改良PDB培养基中，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，然后加入50mg黄芪甲苷底物(黄芪甲苷含34.5mg)，继续培养6天，获得发酵液；

(3)纯化

将步骤(2)所得发酵液与萃取剂乙酸乙酯等体积混合后在室温下萃取三次、每次10min，所得萃取液真空浓缩至干，获得萃取物；

将萃取物按10mg/mL的质量体积比溶解至甲醇中，再按照与萃取物质量1:1的用量加入还原剂NaBH₄，常温反应10min，获得反应液；

在反应液中加入等体积的水，40℃浓缩去甲醇，然后加入等体积的乙酸乙酯，静置分层；取有机相浓缩至干后以甲醇溶解，通过硅胶层析柱纯化，干燥，即获得目标产物环黄芪醇。

经检测，产物纯度为95.1％、反应转化率27.7％。

实施例3

本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：

(1)种子培养

在锥形瓶中配制PDB培养基，然后接入菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，获得种子一级培养基；

(2)转化培养

将步骤(1)所获得的种子一级培养基按10％的接种量接入150mL普通PDB培养基中，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，然后加入50mg黄芪甲苷底物(黄芪甲苷含34.5mg)，继续培养6天，获得发酵液；

(3)纯化

将步骤(2)所得发酵液与萃取剂乙酸乙酯等体积混合后在室温下萃取三次、每次10min，所得萃取液真空浓缩至干，获得萃取物；

将萃取物按10mg/mL的质量体积比溶解至甲醇中，再按照与萃取物质量比1:1的用量加入还原剂NaBH₄,常温反应10min，获得反应液；

在反应液中加入等体积的水，40℃浓缩去甲醇，然后加入等体积的乙酸乙酯，静置分层；取有机相浓缩至干后以甲醇溶解，通过硅胶层析柱纯化，干燥，即获得目标产物环黄芪醇。

经检测，产物纯度为95.1％、反应转化率44.8％。

实施例4

本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：

(1)种子培养

在锥形瓶中配制PDB培养基，然后接入菌种犁头霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，获得种子一级培养基；

(2)转化培养

将步骤(1)所获得的种子一级培养基按10％的接种量接入150mL改良PDB培养基中，在摇床温度30℃、摇床转速180r/min的条件下培养3天，然后加入50mg黄芪甲苷底物(黄芪甲苷含34.5mg)，继续培养2天，获得发酵液；

(3)纯化

将步骤(2)所得发酵液与萃取剂乙酸乙酯等体积混合后在室温下萃取三次、每次10min，所得萃取液真空浓缩至干，获得萃取物；

将萃取物按10mg/mL的质量体积比溶解至甲醇中，再按照与萃取物质量比1:1的用量加入还原剂NaBH₄,常温反应10min，获得反应液；

在反应液中加入等体积的水，40℃浓缩去甲醇，然后加入等体积的乙酸乙酯，静置分层；取有机相浓缩至干后以甲醇溶解，通过硅胶层析柱纯化，干燥，即获得目标产物环黄芪醇。

经检测，产物纯度为96.4％、反应转化率34.0％。