一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法

摘要

本发明涉及一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β‑法呢烯的方法，其特征在于采用以下步骤：A：收割成熟新鲜糖高粱压榨制得糖高粱汁；B:对糖高粱汁进行浓缩；C：将糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣混合均匀，得糖高粱和甘蔗废渣混合液；D：以糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母为菌种，制备摇瓶菌种；E：将摇瓶菌种接种到种子培养基中进行培养；G：将种子培养液接入发酵培养基中发酵30‑50 h，向发酵液中加入絮凝剂，沉淀后虹吸得上清液。本发明所用原料成本低，所得上清液中β‑法呢烯含量高，利于降低植物来源角鲨烷的制备成本。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法。

背景技术

β-法呢烯，又名金合欢烯，是具有15个碳的直链烯烃。β-法呢烯可以作为柴油和特殊化学品的前体，也是重要香料成分前体，进一步合成后的产品，可应用于化妆品、香精香料、高分子、润滑油、柴油、喷气燃料等领域。目前，β-法呢烯主要通过橙花叔醇在各种酸性催化剂作用下经脱水的合成方法制备，存在异构体较多导致分离工艺复杂，生产成本高昂。

生物科技的发展，为定向制备高纯度的β-法呢烯提供了低成本、可再生、可持续发展的途径。美国Amyris率先使用生物法制备β-法呢烯，成为代表美国工业生物技术的先锋，美国Amyris工厂设在巴西，使用当地盛产的甘蔗汁浓缩后作为底物。相比于巴西，中国甘蔗的成本较高，主要为食用或制糖，用于生产β-法呢烯成本太高。因此如果使用经济作物的废弃部分，用于生产β-法呢烯，可以大大降低生产成本，符合中国国情。

糖高粱，俗名“甜芦粟”，属禾本科高粱属，是粒用高粱的一种。糖高粱形状同高粱类似，叶青灰色，茎杆中有含糖汁液。糖高粱对土壤和气候要求不严格，分布广泛，是糖料作物之一，也可用作饲料、酿酒等用途。中国各地均有出产。它同普通高粱一样，每亩地能结出150-500 kg的粮食。糖高粱的茎秆含有糖分，其单产可达每亩5000-10000 kg。糖高粱因为茎秆甜度不够，通常晒干后被作为燃料或作为动物饲料处理。

甘蔗在我国福建、广东、海南、广西、四川、云南等南方热带地区种植，主要用于直接食用和制造蔗糖的原料。甘蔗茎秆富含糖分，其单产可达每亩4000-6000 kg。榨糖后的甘蔗废渣一般晒干后用于燃料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，该方法成本低、原料来源广，利于环保。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，其特征在于采用以下步骤：

A：收割成熟新鲜糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为20%-25%的糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以1~3：1的质量比混合均匀，得糖高粱和甘蔗废渣混合液；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为菌种，摇床转速50-200 r/min，培养12-48 h得到摇瓶菌种；

E：按以下质量比配制种子培养基：5-10%葡萄糖，0.1-0.3%NaNO₃，0.05-0.15%K₂HPO₄，0.05-0.15%KH₂PO₄，0.01-0.1%MgSO₄，0.01-0.1%FeSO₄，0.01-0.1%ZnSO₄，0.01-0.05%MnSO₄，余量为水；

F：将摇瓶菌种按2-10%的体积分数比接种到种子培养基中，100-300 r/min的范围内振荡培养12-24 h，得种子培养液；

G：按以下质量比配制发酵培养基：10-20%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.1-0.3%NaNO₃，0.05-0.15%K₂HPO₄，0.05-0.15%KH₂PO₄，0.01-0.1%MgSO₄，0.01-0.1%FeSO₄，0.01-0.1%ZnSO₄，0.01-0.05%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数5-20%的接种量将步骤F所得种子培养液接入步骤G制备的发酵培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量100-400 ml/min，温度37℃，搅拌转速200-400 r/min，用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至5~7，发酵30-50 h后停止发酵，向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH =5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸得上清液。

本发明以廉价易得的糖高粱秆和甘蔗废渣为原料，采用该方法发酵完成后，所得上清液中β-法呢烯含量达516 mg/L-750 mg/L。此外，本发明所述的一种发酵制备β-法呢烯的方法工艺条件简单、温和、无有毒溶剂残留，可实现工业化和清洁生产。

采用该方法发酵完成后的上清液中，β-法呢烯含量达516 mg/L-750 mg/L，将上清液中β-法呢烯提纯后，所得β-法呢烯可以直接作为柴油、特殊化学品、香料前体，尤其是制备植物来源角鲨烷，便于下游产品的生产和制造。

本发明将糖高粱茎杆和甘蔗废渣作为生产β-法呢烯的原料，具有来源丰富、成本低廉、原料易得、可再生的优势；所得上清液中β-法呢烯含量高，利于降低植物来源角鲨烷的制备成本。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：

一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，采用以下步骤制备：

A：从糖高粱种植地收割成熟糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为20%糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以1：1的质量比混合均匀；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为菌种，摇床转速80 r/min，培养18 h得到摇瓶菌种；

E：种子培养基组成为葡萄糖3%，NaNO_{3>0.1%；K2HPO4>0.05%；KH2PO4>0.1%；MgSO4>4>4>4}>

F：将摇瓶菌种按4%的体积分数比接种到种子培养基中，100 r/min的范围内振荡培养15 h，得种子培养液；

G：发酵培养基组成为10%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.1%NaNO₃，0.05%K₂HPO₄，0.1%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄，0.01%FeSO₄，0.01%ZnSO₄，0.01%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数6%的接种量将步骤(F)中培养好的种子培养液接入步骤（G）制备的培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量100 ml/min，温度37℃，搅拌转速200 r/min，用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至5，发酵20 h后停止发酵。向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH 5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸出上清液，上清液中β-法呢烯含量达556 mg/L。

实施例2：

一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，采用以下步骤制备：

A：从糖高粱种植地收割成熟糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为22%糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以2：1的质量比混合均匀；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为菌种，摇床转速100 r/min，培养20 h得到摇瓶菌种；

E：种子培养基组成为葡萄糖5%，NaNO_{3>0.15%；K2HPO4>0.1%；KH2PO4>0.15%；MgSO4>4>4>4}>

F：将摇瓶菌种按6%的体积分数比接种到种子培养基中，200 r/min的范围内振荡培养18 h，得种子培养液；

G：发酵培养基组成为12%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.15%NaNO₃，0.1%K₂HPO₄，0.15%KH₂PO₄，0.03%MgSO₄，0.03%FeSO₄，0.03%ZnSO₄，0.03%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数8%的接种量将步骤(F)中培养好的种子培养液接入步骤（G）制备的培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量200 ml/min，温度37℃，搅拌转速300 r/min，用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至6，发酵30 h后停止发酵。向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH 5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸出上清液，上清液中β-法呢烯含量达614 mg/L。

实施例3：

一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，采用以下步骤制备：

A：从糖高粱种植地收割成熟糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为23%糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以3：1的质量比混合均匀；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为菌种，摇床转速150 r/min，培养30 h得到摇瓶菌种；

E：种子培养基组成为葡萄糖8%，NaNO_{3>0.2%；K2HPO4>0.1%；KH2PO4>0.15%；MgSO4>4>4>4}>

F：将摇瓶菌种按8%的体积分数比接种到种子培养基中，300 r/min的范围内振荡培养24 h，得种子培养液；

G：发酵培养基组成为15%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.2%NaNO3，0.1%K₂HPO₄，0.15%KH₂PO₄，0.05%MgSO₄，0.05%FeSO₄，0.05%ZnSO₄，0.05%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数15%的接种量将步骤(F)中培养好的种子培养液接入步骤（G）制备的培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量300 ml/min，温度37℃，搅拌转速400 r/min，用NaOH溶液控制pH 6，发酵40 h后停止发酵。向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH 5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸出上清液，上清液中β-法呢烯含量达698 mg/L。

实施例4：

一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，采用以下步骤制备：

A：从糖高粱种植地收割成熟糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为21%糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以3：1的质量比混合均匀；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为菌种，摇床转速200 r/min，培养36 h得到摇瓶菌种；

E：种子培养基组成为葡萄糖10%，NaNO_{3>0.3%；K2HPO4>0.1%；KH2PO4>0.15%；MgSO4>4>4>4}>

F：将摇瓶菌种按10%的体积分数比接种到种子培养基中，300 r/min的范围内振荡培养24 h，得种子培养液；

G：发酵培养基组成为20%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.3%NaNO3，0.1%K₂HPO₄，0.15%KH₂PO₄，0.08%MgSO₄，0.08%FeSO₄，0.08%ZnSO₄，0.08%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数20%的接种量将步骤(F)中培养好的种子培养液接入步骤（G）制备的培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量400 ml/min，温度37℃，搅拌转速400 r/min，用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至5，发酵50 h后停止发酵。向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH 5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸出上清液，上清液中β-法呢烯含量达730 mg/L。

实施例5：

一种利用糖高粱秆和甘蔗废渣发酵制备β-法呢烯的方法，采用以下步骤制备：

A：从糖高粱种植地收割成熟糖高粱，去除高粱穗、根和叶子，再清洗去除糖高粱秆上的灰尘和泥土，入压榨机进行压榨制得糖高粱汁；

B：将步骤A所得糖高粱汁进行过滤、蒸发、浓缩，得水份含量为25%糖高粱汁浓缩液；

C：将步骤B所得糖高粱汁浓缩液与制糖厂生产的副产物甘蔗废渣以1：1的质量比混合均匀；

D：称取适量步骤C所得糖高粱和甘蔗废渣混合液作为发酵的碳源，以保藏编号为CICC No. 32475的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为菌种，摇床转速200 r/min，培养40 h得到摇瓶菌种；

E：种子培养基组成为葡萄糖7%，NaNO_{3>0.1%；K2HPO4>0.05%；KH2PO4>0.1%；MgSO4>4>4>4}>

F：将摇瓶菌种按6%的体积分数比接种到种子培养基中，200 r/min的范围内振荡培养24 h，得种子培养液；

G：发酵培养基组成为18%糖高粱和甘蔗废渣混合液，0.1%NaNO3，0.05%K₂HPO₄，0.1%KH₂PO₄，0.06%MgSO₄，0.06%FeSO₄，0.06%ZnSO₄，0.03%MnSO₄，余量为水；

H：按体积分数20%的接种量将步骤(F)中培养好的种子培养液接入步骤（G）制备的培养基中，通入空气维持微氧条件，通气量300 ml/min，温度37℃，搅拌转速350 r/min，用3~5 mol/L NaOH溶液调节pH至5.5，发酵45 h后停止发酵。向发酵液中加入0.75 g/L絮凝剂壳聚糖和0.125 g/L助絮凝剂海藻酸钠，调节体系pH 5，搅拌15 min，静置1 h后，虹吸出上清液，上清液中β-法呢烯含量达640 mg/L。