玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦氮素利用效率中的应用

摘要

本发明公开了玉米C

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麦氮素利用效率中的应用。

背景技术

氮是植物生长发育所必需的第一大矿质营养元素。氮肥作为最重要的农业生产投入品之一，为农作物产量的大幅度提高做出了重要贡献。自上世纪七十年代以来，我国化肥施用量迅速增加，目前已成为世界上化肥消费第一大国，其中氮肥占化肥消费比重的60％左右，每年氮肥用量占全世界氮肥用量的35％以上。化肥的施用量已十分惊人，已显现出对环境、农业生产力、生产效益和农产品安全十分不利的严峻态势。发达国家规定的化肥施用量安全上限是225公斤/公顷，我国已制定的生态县标准为250公斤/公顷，但目前我国化肥实际平均施用量已超过440公斤/公顷。目前，世界发达国家氮肥的平均利用率为40％-60％，我国却仅为30％-35％。化肥的大量施用已造成了严重的环境污染，我国每年有120万吨氮流入江河，50万吨氮渗透到地下水中，这些氮主要来自于农业，而农业中有50％来自于化肥，另外还有300万吨氮由土壤直接进入大气。同时过量的施用化肥还造成农业生产成本上升和能源消耗的增加，农产品安全问题也日趋严峻。肥料减施已列为国家“十三五”发展规划和国家中长期发展规划，同时也列为科技部“十三五”提前启动的重大专项。今年1月农业部通过《化肥使用量零增长行动方案》，力争到2020年，主要农作物化肥施用量实现零增长。

小麦是世界上种植最广的粮食作物之一，其总产量居三大主产作物第二位。因此，大力提高小麦氮素营养效率、节约资源、保护环境、避免或减轻大气和地下水的污染，已成为我国当前实现农业可持续发展的迫切任务之一。氮肥高效利用小麦新品种的培育是解决这一迫切问题的重要技术途径。

早在1971年Wilson和Haydock就研究了包括C₃和C₄植物的21种牧草中氮磷对生长的效应，发现C₄植物生长优于C₃植物，特别是在氮磷都不足的情况下，C₄植物表现了其优越性。

C₄植物在碳代谢的生化途径和叶片解剖结构上与C₃植物相比有着明显差异，碳代谢途径与氮代谢是相联系的，诸多实验证据表明C₄植物的氮素利用率高于C₃植物。比较C₃植物(Festuca>4植物(Panicum>3-C₄中间型植物(Panicum>4植物的光合速率明显高于后两者。何新华和李明启(1995)证实供给NO₃^-作为氮源，玉米比大麦更能有效的转运NO₃^-，在低浓度NO₃^-条件下表现更明显，还指出NO₃^-和/或蛋白质的积累与NR活性无关。

通过有性杂交的方法难以使C₃植物获得C₄植物特性，随着分子生物学技术特别是重组DNA技术的快速发展，为使C₄途径关键酶基因在C₃植物中表达提供了契机。PEPC、PPDK和RuBisco三个酶为C₄途径主要的限速酶(Matsuoka>4途径关键酶基因转化到C₃植物(小麦、水稻、马铃薯、拟南芥等)已有多例的研究报道。

C₃植物中pepc为非光合型，对光合作用影响较小，但在其它代谢过程中起着重要的作用。如参与碳骨架的回补作用，补充TCA循环中因氨基酸合成损失的碳骨架；调节气孔运动；重新固定所释放的CO₂；参与豆科植物的固氮作用等(Melzer>3植物中存在C₄途径酶基因，较C₄植物中同工酶的活性低很多。

外源PEPC在C₃植物高表达存在两种可能的代谢途径：一是PEPC在胞质溶胶中催化HCO₃^-和PEP反应产生OAA；OAA经转运到叶绿体在NADP-MDH作用下产生Mal；Mal经苹果酸酶(NADP-ME)催化下产生丙酮酸(Pyr)，并释放出CO₂进入Calvin循环，进行光合碳同化作用；Pyr在PPDK催化下产生PEP，经转运至胞质溶胶中；二是PEPC催化PEP与HCO₃^-产生OAA，OAA经NAD-MDH作用下产生Mal；OAA与Mal由胞质溶胶转运至线粒体中，进入TCA循环，从而增强呼吸作用和为氨基酸的合成提供丰富的碳骨架。

pepc与初级氮代谢基因的表达是相联系的，pepc的过表达使C₃植物叶片可溶性蛋白含量、有机酸和氨基酸含量发生改变。在转入蓝藻pepc的豆科植物中，发现PEPC的回补作用增强，子叶中代谢物流向发生改变，使淀粉和糖类更多流向有机酸和游离氨基酸，籽粒中蛋白含量也增加了15-25％，进一步分析特异表达的PEPC使种子的库容增大而提高蛋白含量，种子的成熟度有所改变，认为增加的有机酸和氨基酸激活了更广泛的氮代谢途径(Radchuk>4型pepc水稻中高水平活性的PEPC增强了碳素流向TCA循环并为氨基酸的合成提供前体，从而提高转基因植株的氮素利用水平，显著降低C/N值(Agarie>4型pepc转入到水稻中，发现PEPC酶活提高的同时可溶性蛋白含量提高了12％(Ku>4型pepc拟南芥，种子干重和总蛋白含量提高了30％(Leboutei>

长期以来，国内外开展玉米C₄型高光效基因导入小麦的主要技术途径为通过同室筛选、细胞融合和远缘杂交等方法，但一直未获得突破性进展。其主要原因为玉米、高粱、甘蔗等C₄作物与小麦等C₃作物存在着物种间的生殖隔离。

发明内容

本发明的一个目的是提供C₄型植物的pepc或其编码基因或表达该编码基因的重组载体的用途。

本发明提供了C₄型植物的pepc或其编码基因或表达该编码基因的重组载体在如下1)-10)中至少一种中的应用：

1)促进C₃型植物对氮的吸收；

2)提高C₃型植物各器官的含氮量；

3)促进C₃型植物根系生长；

4)提高C₃型植物根系长度；

5)增加C₃型植物根系表面积；

6)提高C₃型植物产量；

7)提高C3型植物的有效穗数；

8)提高C₃型植物的穗粒数；

9)提高C₃型植物的千粒重；

10)提高C₃型植物的亩产。

上述应用中，所述应用均在氮胁迫下进行。

上述应用中，所述氮胁迫为高氮胁迫或低氮胁迫；

或，所述提高C₃型植物各器官的含氮量为提高C₃型植物在生育期地上部分含氮量；

或，所述提高C₃型植物产量体现在提高有效穗数、穗粒数、千粒重和/或亩产。

上述应用中，所述C₃型植物为单子叶植物或双子叶植物，

或，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明另一个目的是提供C₄型植物的pepc或其编码基因或表达该编码基因的重组载体的另一个用途。

本发明提供了C₄型植物的pepc或其编码基因或表达该编码基因的重组载体在培育具有如下1)-9)中至少一种特征的C₃型植物中的应用：

1)对氮的吸收增加；

2)各器官的含氮量增加；

3)根系生长增加；

4)根系长度增加；

5)根系表面积增加；

6)产量增加；

7)有效穗数增加；

8)穗粒数增加；

9)千粒重增加；

10)亩产增加。

上述重组载体为将玉米C₄型pepc基因插入pCAMBIA3301载体的BglⅡ和PmlⅠ酶切位点间得到的载体。

上述应用中，所述C₃型植物为单子叶植物或双子叶植物，

和/或，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明第三个目的是提供一种培育氮吸收高效、根系生长快和/或产量高的C₃型转基因植物方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：为将C₄型植物的pepc的编码基因导入C₃型目的植物中，得到C₃型转基因植物；

所述C₃型转基因植物具有如下1-10)中至少一种特征：

1)所述C₃型转基因植物对氮的吸收能力大于所述C₃型目的植物；

2)所述C₃型转基因植物各器官的含氮量大于所述C₃型目的植物；

3)所述C₃型转基因植物根系生长大于所述C₃型目的植物；

4)所述C₃型转基因植物根系长度大于所述C₃型目的植物；

5)所述C₃型转基因植物根系表面积大于所述C₃型目的植物；

6)所述C₃型转基因植物产量大于所述C₃型目的植物；

7)所述C₃型转基因植物有效穗数大于所述C₃型目的植物；

8)所述C₃型转基因植物穗粒数大于所述C₃型目的植物；

9)所述C₃型转基因植物千粒重大于所述C₃型目的植物；

10)所述C₃型转基因植物亩产大于所述C₃型目的植物。

上述方法中，所述导入通过转基因方式实现，

和/或，所述转基因方式具体为基因枪。

上述方法中，所述C₃型转基因植物具有如下1-10)中至少一种特征均在氮胁迫下体现；

或，所述氮胁迫为高氮胁迫或低氮胁迫；

或，所述提高C₃型植物各器官的含氮量为提高C₃型植物在生育期地上部分含氮量；

或，所述提高C₃型植物产量体现在提高有效穗数、穗粒数、千粒重和/或亩产。

上述方法中，所述C₃型植物为单子叶植物或双子叶植物，

和/或，所述单子叶植物具体为小麦。

本发明利用的转基因技术可以打破物种之间的生殖隔离，实现基因在不同物种中的交流，因此已成为解决农作物重要性状遗传改良瓶颈问题的主要技术途径。

除本发明所描述的基因枪介导法以外，还可以通过农杆菌介导法、花粉管通道法等转化方法导入C₃植物。

本发明的实验证明，本发明利用基因枪介导法将玉米C₄型pepc基因导入普通小麦周麦19，创制出了可稳定遗传与表达，氮素吸收利用效率较受体对照显著提高的转基因小麦材料，为利用该基因改良小麦等C₃作物的养分吸收利用效率，选育高产优质节本高效转基因小麦新品种提供了材料和技术支撑。

附图说明

图1为不同氮水平下转基因小麦和对照的根系表面积。

图2为不同氮水平下转基因小麦和对照的总根长。

图3为高氮条件下转基因小麦和对照的各器官氮含量。

图4为低氮条件下转基因小麦和对照的各器官氮含量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、pepc基因在提高小麦氮素利用效率中的应用

一、转pepc小麦的获得

1、基因枪将高光效pepc基因导入周麦19

1)表达pepc基因的载体

表达pepc基因的载体p3301-pepc为将玉米C₄型pepc基因(核苷酸序列为序列1，编码的蛋白的氨基酸序列为序列插入pCAMBIA3301载体(购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品编号为MCV039)的BglⅡ和PmlⅠ酶切位点间得到的载体。

2)受体幼胚的制备

以小麦品种周麦19(由河南省农业科学院小麦研究所分子育种研究室提供)的幼胚为受体材料。取开花后12d的穗中部、大小一致的未成熟种子，用70％的酒精表面消毒1min，无菌水冲洗3次后用0.1％的HgCl₂消毒10min，无菌水冲洗3次。无菌条件下剥出幼胚(1mm左右)，于MS诱导培养基(MS+2mg/L>

3)基因枪转化

将载体p3301-pepc利用基因枪轰击(载体用量：1μg/枪；金粉用量：250μg/枪；靶距：9cm；轰击压力：1100psi；轰击次数：1次)受体幼胚，将轰击后的受体幼胚在高渗培养基上继续处理16h，转至愈伤诱导培养基。培养2周后转至草丁膦抗性筛选再生培养基(1/2MS+0.5mg/L NAA+2.0mg/L KT+0.4％琼脂+3％蔗糖+4％PPT，pH6.2)，连续筛选2代，每代2周，经过筛选的抗性苗转至生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+0.4％琼脂+3％蔗糖，pH6.5)中，至再生苗根系较健壮时，即可进行炼苗1-2天。生根、壮苗后移入花盆中，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株326株。

2、PCR验证

提取上述1获得的所有再生植株的基因组DNA，根据已克隆的pepc基因序列设计了一对特异性引物PC1:5'-CGCCCTTCCATACAGTCTCA-3'和PC2:5'-CATCTCGCTTCCGTGCTTAG-3'，扩增程序为94℃4分钟；94℃30秒，58℃50秒，72℃50秒，38个循环；72℃10分钟，目的片段长度为800bp。利用该引物对再生植株进行PCR检测，以鉴定阳性植株。

PCR反应体系为：10-50ng/ul基因组模板；10μM的PC1和PC2各0.5μl；2.5μl10×Reaction Buffer；4μl dNTP mix(2.5mM)；0.5μl Taq酶，加水至25μl。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。有121株可以扩增出800bp的目的条带，鉴定为阳性植株，命名为转pepc小麦。

将转pepc小麦T0代播种、检测、培育直到得到能稳定遗传表达的T4代转pepc小麦株系08T1-47，以下用转pepc小麦08T1-47进行功能验证试验。

二、转pepc小麦的特性研究

对转pepc小麦株系08T1-47和对照周麦19的饱满均一的种子用0.5％H₂O₂消毒浸种24h，然后用自来水冲洗干净，播于垫有滤纸培养皿中，保持滤纸湿润，培养2周，得到2周龄幼苗；

将各株系2周龄幼苗分别移栽于10L浓度为5mM高氮培养液和10L浓度为0.25mM低氮培养液中，每个株系种植18颗苗，得到高氮处理后转pepc小麦08T1-47、高氮处理后周麦19、低氮处理后转pepc小麦08T1-47和低氮处理后周麦19。

上述10L浓度为5mM高氮培养液为将高氮大量元素培养液母液和高氮微量元素培养液母液混匀，用水补足体积得到；

上述高氮大量元素培养液母液由120mM Ca(NO₃)₂.4H₂O水溶液，160mM>3水溶液，50mM(NH₄)₂.SO₄水溶液，100mM>2PO₄水溶液，100mM>4.7H₂O水溶液和50mM>

上述高氮微量元素培养液母液由5mM Fe-EDTA水溶液，46.25mM>3BO₃水溶液，9.145mM>2.4H₂O水溶液，0.3204mM>4.5H₂O水溶液，0.2565mM>2MoO₄水溶液和0.7651mM>4.7H₂O水溶液各10ml混匀得到。

上述10L浓度为0.25mM低氮培养液为将低氮大量元素培养液母液和低氮微量元素培养液母液混匀，用水补足体积得到。

上述低氮大量元素培养液母液由6mM Ca(NO₃)₂.4H₂O水溶液，114mM>2水溶液，8mM>3水溶液，76mM>2SO₄水溶液，2.5mM(NH₄)₂.SO₄水溶液，100mM>2PO₄水溶液，100mM>4.7H₂O水溶液和50mM>

低氮微量元素培养液母液由5mM Fe-EDTA水溶液，46.25mM>3BO₃水溶液，9.145mMMnCl₂.4H₂O水溶液，0.3204mM>4.5H₂O水溶液，0.2565mM>2MoO₄水溶液和0.7651mMZnSO₄.7H₂O水溶液各100ml混匀得到。

1、根系特性研究

取上述处理后生长一致高氮处理后转pepc小麦08T1-47、高氮处理后周麦19、低氮处理后转pepc小麦08T1-47和低氮处理后周麦19分别定植于泡沫板(规格为6×12孔/箱)上，每孔留苗一株。生长间条件温度设为白天18℃，晚上8.5℃；光照条件为白天14h，晚上10h)。每三天更换一次营养液，每天测定PH值，并调节营养液的PH于5.6-6.2之间。植株培养四周后进行取样，并做各项指标的测定。利用根系扫描仪对根系形态进行扫描，再使用DT-SCAN软件进行根表面积和总根长的分析。实验重复3次，结果取平均值。

结果如图1所示，在高氮(浓度为5mM)处理后，转pepc小麦08T1-47的根系表面积比对照周麦19提高了33.97％；在低氮(浓度为0.25mM)处理后，08T1-47的根系表面积比对照提高了54.20％，均达显著水平。

在高氮(浓度为5mM)处理后，转pepc小麦08T1-47的总根长比对照周麦19提高了27.79％，在低氮(浓度为0.25mM)处理后，08T1-47的总根长比对照提高了41.85％％，均达显著水平(图2)。

2、各器官氮含量

采用Vario MICRO cube元素分析仪测定高氮处理后转pepc小麦08T1-47、高氮处理后周麦19、低氮处理后转pepc小麦08T1-47和低氮处理后周麦19各器官的含氮率。

计算植株特定器官氮含量＝特定器官干物质重×该器官含氮率；

植株地上部氮含量＝地上部各器官氮含量之和。

实验重复3次，结果取平均值。

结果如图3所示，高氮处理后转pepc小麦08T1-47的叶片、茎鞘、根系、地上部、整株的含氮量分别比受体提高了6.15％、16.67％、15.79％、8.72％、10.00％，其中转pepc小麦08T1-47整株的含氮量比受体显著提高(图3)；

低氮处理后转pepc小麦08T1-47的叶片、茎鞘、根系、地上部、整株的含氮量分别比受体提高了16.22％、42.31％、56.00％、19.57％、25.15％，且均达到显著性差异(图4)。

说明转pepc小麦08T1-47具有较强的氮素吸收能力。

3、氮效率评价研究

上述转pepc小麦08T1-47、高氮处理后周麦19、低氮处理后转pepc小麦08T1-47、和低氮处理后周麦19在生育期的拔节期、开花期、成熟期取地上部样，按不同器官分开，在105℃下杀青0.5h，70℃烘干至恒重，称重后粉碎，用于后续氮含量测定。各小区在成熟期单收测产、考种。采用Vario MICRO cube元素分析仪测定含氮率。

含氮率结果如表1所示，

表1为不同氮处理转pepc小麦和对照在不同生育时期地上部和籽粒含氮率

注：*为P＜0.05

上述结果表明，随小麦生长发育时期的进程，地上部含氮率逐渐降低。在同一生育时期，随肥力升高地上部含氮率越高。在拔节期，高氮条件下转基因品系08T1-47含氮率明显高于对照周麦19，比对照提高了1.07％；低氮条件下，08T1-47比对照周麦19提高了12.23％。在开花期，高氮条件下，08T1-47比对照周麦19提高了1.42％；低氮条件下08T1-47比对照周麦19提高了30.00％，达到显著性水平。在成熟期，高氮条件下08T1-47比对照周麦19提高了4.43％；低氮条件下08T1-47比对照周麦19提高了15.23％，达显著性水平。转基因小麦在各个生育期中，低氮水平下含氮率比对照提高的幅度高于高氮水平，说明转基因小麦在低氮水平能保持较高的地上部含氮率。

4、产量

检测转pepc小麦08T1-47、高氮处理后周麦19、低氮处理后转pepc小麦08T1-47和低氮处理后周麦19的产量，结果如表2所示。

表2为不同氮处理转基因小麦和对照产量性状分析

从上述可以看出，高氮条件下，转基因小麦品系08T1-47产量比对照周麦19提高了1.61％；低氮条件下，转基因小麦品系08T1-47产量比对照周麦19提高了9.62％，这是由于转基因小麦品系08T1-47的穗粒数和千粒重明显高于对照周麦19(见表2)。

以上结果表明转pepc小麦品系08T1-47氮素吸收利用效率明显高于周麦19，因此，玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入小麦后，可明显提高转基因小麦植株的氮素吸收利用效率。