一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用

摘要

本发明公开了一种耐碱性α‑淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用，属于酶工程领域。本发明采用基因工程技术将来源于碱性芽孢杆菌(Bacillus sp.LS‑04)的耐碱性α‑淀粉酶基因克隆入pPIC9k质粒，以P.pastoris为表达宿主细胞，经甲醇诱导重组耐碱性α‑淀粉酶表达活力达到3120U/mL。本发明的耐碱性α‑淀粉酶在pH8.0–11.0范围内对淀粉均变现出良好的催化活性，可被应用于纺织退浆或洗涤助剂等领域。

说明书

技术领域

本发明属于酶工程和基因工程技术领域，具体涉及一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

淀粉酶是一类以淀粉、长链糊精和糖原等葡聚糖为底物的一类酶的总称，按产生底物异构类型的不同可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种；按淀粉水解方式的不同还可以内切型、外切型、脱枝和转移等4个种类。α-淀粉酶即为内切型淀粉酶的一种，其水解产物通常为短链糊精、寡糖和葡萄糖，在食品、制药、酒精、有机酸以及饲料和洗涤行业具有广泛应用。

普通α-淀粉酶的作用pH范围较窄，一般在pH5.0–8.0之间，而在该pH范围之外的理化条件下催化活力急剧下降而无法满足工艺使用需求。通常采取的措施是改变加工工艺，分段处理，以满足淀粉酶的使用条件，这样处理的结果是能源消耗大，费时费力且为环保处理带来压力。因此，随着行业发展的细化和不同加工处理领域条件的限制，对淀粉酶催化性质、性能的要求也越来越高，而传统的普通α-淀粉酶更是无法满足各应用领域的需求，从而产生了对特殊淀粉酶如耐酸性淀粉酶、耐碱性淀粉酶或低温淀粉酶的巨大需求。其中，耐碱性α-淀粉酶是指一类可以在碱性环境中(pH9.0–11.0)对淀粉产生水解作用的一类淀粉酶，在洗涤和纺织退浆等特殊的碱性处理工艺环境中对提高洗涤效率、改进退浆工艺等具有重要应用和巨大需求。在2005年和2008年丹麦Novozymes公司前后推出了碱性α-淀粉酶产品并在纺织退浆和洗涤剂中取得了较好应用效果。我国的中国科学院微生物所、武汉大学和江南大学等科研院校亦相继对碱性α-淀粉酶进行了大量研究，但截止目前我国在该酶的生产领域尚属空白，因此碱性α-淀粉酶已成为我国当前酶制剂行业亟待开发的品种之一。

自1971年日本研究者Horikoshi首次报道碱性α-淀粉酶以来，关于碱性α-淀粉酶的研究报道陆续增多并主要集中在产生菌种的筛选、培养和酶的分离纯化和性质研究。碱性α-淀粉酶的产生菌株通常是一类嗜碱微生物，该类微生物通常是一类酶表达量极低的原始野生菌株，通过传统诱变选育很难得到满足工业化生产需求的生产菌株。近年来随着基因工程和蛋白质工程技术的发展而逐渐在碱性α-淀粉酶的基因克隆、异源表达和酶分子改造等方面加大了研究力度，同时也是目前快速对碱性α-淀粉酶基因进行克隆、改造和高效表达一条重要途径。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种耐碱性α-淀粉酶及其基因工程菌的构建方法和应用，目的是使耐碱性α-淀粉酶具有异源高效表达性。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种耐碱性α-淀粉酶，所述耐碱性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码耐碱性α-淀粉酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种含有权利要求1所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌。

所述耐碱性α-淀粉酶的基因工程菌的构建方法，所述构件方法包括如下步骤：

步骤一，克隆耐碱性α-淀粉酶的基因到重组表达质粒载体；

步骤二，将重组表达质粒载体转化到宿主细胞中。

所述重组表达质粒载体为pPIC9k质粒。

所述宿主细胞为P.pastoris GS115。

步骤一所述克隆耐碱性α-淀粉酶的基因的制备方法为：以碱性芽孢杆菌染色体DNA为模板，以简并引物AlamyF1和AlamyR1为扩增引物，扩增引物序列分别如SEQ ID NO.3和如SEQ ID NO.4所示，通过PCR扩增方法得到耐碱性α-淀粉酶基因，将该基因与克隆载体相连得到重组质粒，并使用氯化钙转化法导入大肠杆菌，之后进行抽提重组质粒。优选的是，以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)基因组DNA为模板并利用简并引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增得到耐碱性α-淀粉酶全部编码基因，将该基因与克隆载体pMD19-simple相连接获得重组质粒pMD-Alamy04并使用氯化钙转化法导入大肠杆菌(E.coli)JM109，抽提重组质粒并测序获得该基因的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列信息。

所述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)为本发明人在研究中筛选获得并发现具有耐碱性α-淀粉酶分泌能力的菌株，并已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11899，保藏日期2015年12月22日，保藏地点：中国科学院微生物研究所。该嗜碱芽孢杆菌的相关保藏证明已于2016年4月6日提交专利申请时提交，其申请的专利号为201610207503.5。

所述简并引物是通过对GenBank中公布的部分碱性α-淀粉酶基因序列进行比对和分析而设计得到的。

本发明中从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐碱性α-淀粉酶基因具有以下特征：

(1)核苷酸数目为1545bp；

(2)GC(G+C)含量为49.6％；

(3)与NCBI中以公布的Exiguobacterium sp.AT1b全基因组序列(GenBank登录号:CP001615.1)中的一段序列(1378199bp–1379741bp)的相似度最高(96％)，但仍有4％的核苷酸序列信息的差异，表明本发明中获得的一种耐碱性α-淀粉酶是一条未报道的新基因。

本发明中从嗜碱芽孢杆菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐碱性α-淀粉酶具有以下特征

(1)所含氨基酸数目为514个；

(2)蛋白质分子量MW＝57.3KDa；

(3)蛋白质氨基端1-28个氨基酸为信号肽序列；

(4)蛋白质成熟肽等电点pI＝6.58；

(5)酶的反应温度为30–70℃，优选反应温度为40–60℃；

(6)酶的反应pH为8.0–11.0，优选反应pH为9.0–10.0；

(7)酶在50℃、pH9.0条件下的半衰期为90min；

步骤一所述克隆耐碱性α-淀粉酶的基因到重组表达质粒载体的方法为：通过耐碱性α-淀粉酶成熟肽编码基因设计引物对，以所述重组质粒为模板进行PCR扩增，使用限制性核酸内切酶对PCR产物进行双酶切并与同等双酶切的表达质粒连接、转化获得重组表达质粒载体。优选的是，以耐碱性α-淀粉酶成熟肽编码基因为基础设计一对引物，引物对的序列如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6所示，以重组质粒pMD-Alamy04为模板进行PCR扩增，使用限制性核酸内切酶EcoRI和NotI对PCR产物进行双酶切并与同等双酶切的表达型质粒pPIC9k相连接，转化E.coli JM109，获得重组质粒pPIC9k-Alamy04，抽提该重组质粒并使用限制性核酸内切酶SalI进行线性化酶切，胶回收酶切产物并通过电穿孔法导入宿主菌P.pastoris GS115感受态细胞,再利用营养缺陷型平板和淀粉检测平板筛选获得具有耐碱性α-淀粉酶表达能力的基因工程菌，即携带耐碱性α-淀粉酶基因的重组酵母。

所述P.pastoris GS115感受态细胞，其制备方法为：接种P.pastoris GS115单菌落于装有15mL YEPD培养基的三角瓶(250mL)中，于30℃、200rpm培养16h后取0.5mL培养基接种至装有50mL新鲜YEPD培养基的三角瓶(250mL)中，继续在相同的条件下培养12h后于4℃下离心收集细胞并用40mL冰水预冷的无菌双蒸水洗涤两次，然后使用20mL冰水预冷的1mol/L山梨醇溶液洗涤一次，再使用0.2mL 1mol/L山梨醇溶液重悬细胞，即制得酵母的感受态细胞。

所述电穿孔法，其操作步骤为：取10μL线性化重组质粒与80μL酵母感受态细胞均匀混合后转移至冰预冷的电机杯(0.2cm)中，置于冰上放置5min后利用电穿孔仪进行电击(电场强度设定为7500V/cm)，电击结束后立即加入1mL冰水预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀后取0.5mL液体涂布于营养缺陷型平板。

所述YEPD培养基配方为：每L含有酵母膏10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g。

所述营养缺陷型平板为MD平板，配方为：每L含有酵母氮基3.4g，硫酸铵10g，生物素0.4mg，葡萄糖20g，琼脂粉15g。

所述淀粉检测平板配方为：每L含有酵母氮基3.4g，硫酸铵10g，生物素0.4mg，甲醇5g，可溶性淀粉5g，琼脂粉15g。

所述构建方法得到的工程菌在耐碱性α-淀粉酶生产中的应用。

A、种子摇瓶培养

挑取重组酵母在淀粉检测平板中划线培养36–48h后，接种一个单菌落至15–20mL液态YEPD培养基，于30℃、200rpm条件下培养20–28h后离心收集菌体并将菌体全部转移至25–35mL BMGY培养基，继续在30℃、200rpm条件下培养12–20h后作为种子液备用。

所述BMGY培养基配方为：每L含有酵母膏10g，蛋白胨20g，酵母氮基3.4g，硫酸铵10g，生物素0.4mg，甘油10g，磷酸钾缓冲液(1mol/L，pH6.0)100mL。

所述摇瓶均为250mL三角瓶。

B、液态摇瓶发酵

离心收取上述25–30mL种子液中菌体并全部转移至35–45mL BMMY培养基，于30℃、200rpm条件下培养，每隔12–24h向摇瓶中补加0.2–0.4mL甲醇，同时吸取1mL发酵液并离心收取上清，进行耐碱性α-淀粉酶活力测定。

所述BMMY培养基配方为：每L含有酵母膏10g，蛋白胨20g，酵母氮基3.4g，硫酸铵10g，生物素0.4mg，甲醇5mL，磷酸钾缓冲液(1mol/L，pH6.0)100mL。

所述摇瓶均为250mL三角瓶。

所述耐碱性α-淀粉酶活力测定方法为：

a、采用水杨苷法测定：准确吸取适当稀释的酶液0.5mL，加入1mL1％可溶性淀粉溶液(溶于pH9.5的甘氨酸–氢氧化钠缓冲液)及0.5mL pH9.5的甘氨酸–氢氧化钠缓冲液，于40℃保温30min后加入3mLDNS试剂沸水浴10min，冷却后加水稀释至25mL，测定520nm处吸光值。

b、碱性淀粉酶活力定义为：在上述反应条件下，每小时水解1％的可溶性淀粉生成1mg还原糖所需的淀粉酶的量为一个酶活力单位(U)。

本发明有益效果是:

1、本发明的耐碱性α-淀粉酶基因与NCBI中以公布的Exiguobacterium sp.AT1b全基因组序列(GenBank登录号:CP001615.1)中的一段序列(1378199bp–1379741bp)的相似度最高(96％)，但仍有4％的核苷酸序列信息的差异，表明本发明中获得的一种耐碱性α-淀粉酶是一条未报道的新基因；

2、本发明的基因工程菌利用酵母α-Factor信号肽引导获得了耐碱性α-淀粉酶成熟肽的细胞外高效分泌表达。

3、本发明的耐碱性α-淀粉酶在pH8.0–11.0范围内对淀粉均变现出良好的催化活性，可被应用于纺织退浆或洗涤助剂等领域。

4、本发明的耐碱性α-淀粉酶具有良好的耐碱性能，在pH11.0条件下发挥最大催化活力的50％以上。

附图说明

下面对本说明书附图所表达的内容及图中的标记作简要说明：

图1是本发明的重组质粒pPIC-Alamy04物理图谱；

图2是本发明的耐碱性α-淀粉酶不同温度与相对酶活力的关系图；

图3是本发明的耐碱性α-淀粉酶不同pH与相对酶活力的关系图；

图4是本发明的耐碱性α-淀粉酶不同时间、温度与相对酶活力的关系图。

具体实施方式

下面对照附图，通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1

耐碱性α-淀粉酶基因克隆：

具体包括：

A、碱性芽孢杆菌(Bacillus sp.)LS-04染色体DNA提取

使用SDS抽提法，具体步骤如下：

将碱性芽孢杆菌在液体培养基(每L培养基含有：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，KH₂PO₄>2CO₃调节pH至9.5)中培养12h后，离心收集取3mL菌体并使用0.25mL20mg/mL溶菌酶溶液重选细胞；于37℃水浴中放置30min后加入55μL>

B、耐碱性α-淀粉酶基因扩增和序列测定

以碱性芽孢杆菌(Bacillus sp.)LS-04染色体DNA为模板，以简并引物AlamyF1(5ˊ-CGATGTTYAAGAARCGACAAGGMATT-3ˊ)和AlamyR1(5ˊ-TATTATTGNTGTGTRTAGATGGAA-3ˊ)为扩增引物，使用PCR方法扩增得到耐碱性α-淀粉酶基因片段。

PCR扩增体系(50μL)如下：

PCR产物经胶回收纯化后取7μL，加入1μL T4DNA连接酶、1μL T4DNA连接酶缓冲液和1μL载体pMD-simple，于16℃下反应4h后通过氯化钙转化法导入E.coli JM109感受态细胞，使用抗性LB平板筛选阳性转化子并获得重组质粒pMD-Alamy04；抽提重组质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定的耐碱性α-淀粉酶基因序列为SEQ ID NO.1。

所述抗性LB平板配方为每L培养基含有：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，氨苄青霉素100mg。

C、耐碱性α-淀粉酶基因编码多肽链分析

将耐碱性α-淀粉酶基因序列(SEQ ID NO.1)导入生物信息学分析软件DNAMAN进行蛋白质翻译分析，获得其所编码多肽链的氨基酸序列：SEQ ID NO.2。

实施例2

耐碱性α-淀粉酶基因工程菌的构建：

具体包括：

A、不含信号肽编码序列耐碱性α-淀粉酶基因的克隆

取实施例1中获得的重组质粒pMD-Alamy04为模板，以引物AlamyF2(5ˊ-ACGAATTCGCAACTCCACAGAACGGTACGATGATGCA-3ˊ)和AlamyR2(5ˊ-TAGCGGCCGCTTATTGTTGTGTATAGATGGAA-3ˊ)为扩增引物，获得不含信号肽编码序列的淀粉酶基因。PCR反应体系同实施例1所述。

B、耐碱性α-淀粉酶基因表达载体的构建

胶回收上述步骤中的PCR产物并使用限制性核酸内切酶EcoRI和NotI在37℃下酶切作用1h，然后于65℃加热灭酶20min；将上述淀粉酶基因的酶切产物与同样酶切处理的表达型质粒pPIC9k相连接，获得重组质粒pPIC-Alamy04。所述连接方法和阳性克隆的筛选方法同实施例1所述。

所得重组质粒pPIC-Alamy04，耐碱性α-淀粉酶基因插入到pPIC9k多克隆位点EcoRI和NotI之间，使不含信号肽的耐碱性α-淀粉酶基因在pPIC9k质粒所携带的醇脱氢酶强启动子(AOXI)和酵母α-Factor信号肽的作用下进行细胞外分泌表达。重组质粒pPIC-Alamy04的物理图谱如图1所示。

C、重组酵母的构建

在35μL(2μg)重组质粒pPIC-Alamy04溶液中加入1μL(10U)限制性核酸内切酶SalI和4μLSal酶切缓冲液并于37℃反应4h后，于65℃下灭酶20min，然后使用DNA纯化试剂盒进行纯化并使用30μL双蒸水进行洗涤，得到线性化质粒溶液；取10μL线性化质粒溶液与60μLP.pastoris GS115感受态细胞混匀后使用电穿孔法进行转化；立即在上述处理后的混合液中加入500μL山梨醇溶液(0.5mol/L),混匀后全部吸出并涂布于营养缺陷型平板(MD)，于30℃培养4d后挑取单菌落并点种淀粉检测平板，继续培养3d后于平板中加入10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.5)并在50℃培养箱中静置30min后，倒出缓冲液并自然晾干平板后使用卢卡式碘液进行染色，经碘液染色后出现透明圈的转化子即为具有胞外表达耐碱性α-淀粉酶能力的重组酵母。

实施例3重组酵母发酵产耐碱性α-淀粉酶及性质研究

挑取重组酵母在淀粉检测平板中划线培养40h后，接种一个单菌落至20mL液态YEPD培养基，于30℃、200rpm条件下培养20h后离心收集菌体并将菌体全部转移至30mLBMGY培养基，继续在30℃、200rpm条件下培养12h后离心收集菌体并全部转移至40mL BMMY培养基，于30℃、200rpm条件下培养，每隔12h向摇瓶中补加0.2ml甲醇，发酵96h后，发酵液中耐碱性α-淀粉酶活力达到3120U/mL，其活力单位约是原始菌种的44倍，表明重组耐碱性α-淀粉酶实现了异源高效表达。重组耐碱性α-淀粉酶最适作用温度为50℃(图2)，最适作用pH为9.5(图3)，在50℃、pH9.5条件下的半衰期为90min(图4)。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。