一株产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种生产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CB‑019，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.11950。本发明的菌株发酵及制备生化型驱油剂的方法简单易行，制备的生化型驱油剂的环境适应性好，能保持较高的表界面活力和原油乳化降粘能力；该菌株还能够降解石油、瓜胶等高分子聚合物，可应用于含油污水、压裂返排液和含聚废水处理。本发明的解淀粉芽孢杆菌CB‑019在微生物采油和环境修复领域具有重要的推广和应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌及其在微生物采油和环境修复领域中的应用。

背景技术

生物表面活性剂，是微生物在特定条件下代谢产生的具有表面活性的物质，依据化学组成和微生物来源可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身等五大类。与化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂的分子结构也由两部分组成，疏油亲水的极性基团和疏水亲油的非极性基团。但是与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂有其自身的强大优势，选择性广，对环境友好，分子结构类型多样，具有许多特殊的官能团，专一性强，原料在自然界广泛存在且价廉，发酵生产是典型的“绿色”工艺等，这是一般化学合成的表面活性剂难以匹敌的。尤其是脂肽类表面活性剂，常由13～15个碳为主的脂肪酸链和4～17个氨基酸数不等的肽组成，拥有重要的表面活性，其中主要分为Surfactin(表面活性素)、iturin(伊枯草菌素)、fengycin(芬荠素)、lichenysins(地衣素)和bacillomycin(杆菌霉素)等。生物表面活性剂拥有庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强，因其具有许多独特的优良特性，从而吸引着越来越多的研究者。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为革兰氏阳性芽孢杆菌，好氧菌，与枯草芽孢杆菌具有很高的亲缘性，其生长过程中可以产生一系列低分子量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性代谢产物，具有表面活性，广谱抗菌活性和抗逆能力，生长速度快，稳定性较好。目前，已报道的解淀粉芽孢杆菌产生脂肽类表面活性物质，主要有表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和芬荠素(Fengycin)。芽孢杆菌作为工业生产脂肽类生物表面活性剂的优良菌种，其中报道最多的是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，有关解淀粉芽孢杆菌及其在油井增产和环境修复等领域的应用报道较少。

目前我国大多数油田已进入高含水期，总体含水率已高达90％，而全国平均采收率还不到35％，仍然有50％以上的难动原油有待挖潜。因此三次采油有着特别重要的意义，目前世界上已形成四大技术系列，即化学驱、气驱、热力驱和微生物驱。微生物驱油中较为重要的就是利用微生物及其代谢产生的生物表面活性剂进行驱油。生物表面活性剂的驱油机理主要有以下几点：降低油水界面张力，从而大大降低或消除地层的毛细管作用，减少了剥离原油所需的粘附功，提高了洗油效率；乳化原油，表面活性剂体系对原油具有较强的乳化能力，在水油两相流动剪切的条件下，能迅速将岩石表面的原油分散、剥离，形成水包油(O/W)型乳状液，从而改善油水两相的流度比，提高波及系数；改变岩石表面的润湿性(润湿反转机理)，合适的表面活性剂，可以使原油与岩石间的润湿接触角增加，使岩石表面由油湿性向水湿性转变；提高表面电荷密度，当驱油表面活性剂为阴离子(或非离子-阴离子型)表面活性剂时，它们吸附在油滴和岩石表面上，可提高表面的电荷密度，增加油滴与岩石表面间的静电斥力，使油滴易被驱替介质带走，提高了洗油效率；改变原油的流变性，用表面活性剂水溶液驱油时，一部分表面活性剂溶入油中，吸附在沥青质点上，可以增强其溶剂化外壳的牢固性，减弱沥青质点间的相互作用，削弱原油中大分子的网状结构，从而降低原油的极限动剪切应力，提高采收率。

近年来，随着石油行业的快速发展，原油开采过程中产生的油田污水和含油固废已成为主要的工业污染源之一。目前油田污水基本可以分为水驱的含油污水和聚驱的含聚污水。含油污水和含聚废水已经严重影响了周围土壤、农作物、生物以及人类的健康，油田污水的无害化处理将关系到整个石油行业的生存与发展。迄今为止，物理的化学的方法都已经普遍应用于油田污水的处理，但其处理效果比较局限，成本较高，尤其是“水十条”等环保法的颁布，迫切需要高效和低成本的处理技术，国内外学者已经开始把目光投向了微生物处理，微生物处理技术也已经成为油田污水处理技术的研究热点。含油固废主要包括钻井泥浆和老化油等，其中钻井泥浆成分复杂，含有悬浮颗粒、重金属离子、油、化学处理剂、盐类等，具有污染物种类多、COD含量高、色度大、可生化性差的特点；老化油含有重质化原油、多种采油措施后的化学残液、采出液携带的矿物质、泥沙等，成分非常复杂，具有高胶质、高沥青质、高盐份、高乳化程度、高杂质含量等特点。另外，压裂返排液污染主要来自油水井的压裂工艺，压裂作业排出的残余压裂液中，含有瓜胶、原油及各种添加剂，若不处理直接排放，将会对周围环境造成污染。在油田污水、含油固废和压裂返排液污染的处理技术中，与传统物理和化学处理方法相比，生物处理技术具有作用持久、低成本、环境友好等优势，具有广阔的开发与应用前景。针对石油、瓜胶和聚合物等难降解的有机物，利用能够高效降解这些污染物的优良菌种，调控生态因子，从而使污染物达到排放标准具有重要的工业价值。

目前，有关解淀粉芽孢杆菌及其生物活性产物在微生物采油和环境修复领域中应用的相关报道较少。

发明内容

本发明旨在提供一种可通过发酵生产微生物采油用表面活性素的微生物菌株，并提供利用该菌株制备生化型驱油剂的方法和应用。

本发明所提供的生产表面活性素的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CB-019是由某油田采出液中筛选获得的。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，保藏号为CGMCC No.11950，保藏日期为2016年1月4日。

本发明的解淀粉芽孢杆菌CB-019的生理生化特征及遗传学特征如下：

(1)菌体特征：单个细胞(0.7～0.8)×(2.0～3.0)μm，着色均匀；芽孢(0.6～0.9)×(1.0～1.5)μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

(2)菌落特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

(3)理化性质：革兰氏阳性菌，接触酶和氧化酶反应均为阳性，淀粉水解、水解酪素及水解明胶均为阳性，柠檬酸利用试验呈阳性，甲基红试验呈阴性。

(4)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)相似但又有区别的类群，定名为CB-019。

本发明还提供利用所述解淀粉芽孢杆菌CB-019制备的生化型驱油剂，按质量百分比包括如下组分：

进一步地，所述的非离子型表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸二乙醇酰胺和多元醇脂肪酸脂中的至少一种。

进一步地，所述的氟碳表面活性剂为非离子氟碳表面活性剂。

本发明还提供上述生化型驱油剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将解淀粉芽孢杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，30～37℃培养0.5～2d，所述LB固体培养基为琼脂粉18～20g/L，蛋白胨8～10g/L，酵母粉3～5g/L，NaCl 8～10g/L，补水至1L，pH 7.0～8.0；

(2)将LB固体培养基单菌落接种于种子培养基内，在30～37℃、100～300rpm下振荡培养1～4d，得种子液，所述种子培养基为：蛋白胨8～10g/L，酵母粉3～5g/L，NaCl 8～10g/L，补水至1L，pH 7.0～8.0；

(3)将种子液按照体积比1:20～50接入发酵培养基中，在30～37℃、100～300rpm下振荡培养2～5d，离心，得解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液，所述发酵培养基为：葡萄糖10～12g/L，L-谷氨酸钠2～3g/L，酵母粉0.5～1g/L，K₂HPO₄>2PO₄>4>4>40.01～0.02g/L，CaCl₂>

(4)在25～50℃下，根据质量百分比将解淀粉芽孢杆菌CB-019发酵液、非离子型表面活性剂、氟碳表面活性剂和蒸馏水混合搅拌40～60min。

本发明还提供解淀粉芽孢杆菌CB-019在含油污水、压裂返排液和含聚废水处理中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌CB-019具有降解原油、瓜胶和高分子聚合物的能力。其应用方向还包括，但不限于，石油工业领域中的钻井泥浆处理、老化油及油泥处理、油田有害微生物抑制(如硫酸盐还原菌)，原油污染的土壤生物处理，以及在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料工业等领域。

本发明的有益效果：

本发明的解淀粉芽孢杆菌CB-019是一株高产表面活性素的菌株，菌株发酵及制备生化型驱油剂的方法简单易行，制备的生化型驱油剂的环境适应性好，能保持较高的表界面活力和原油乳化降粘能力；同时解淀粉芽孢杆菌CB-019在油田污水的处理过程中，环境敏感性弱，对来水水质要求不严格，具有高效的原油和瓜胶降解能力，可满足微生物采油技术和环境修复领域的工程需求。

附图说明

图1为菌株CB-019的革兰氏染色镜检图；

图2为菌株CB-019的系统发育树；

图3为菌株CB-019发酵产物的红外图谱；

图4为菌株CB-019发酵产物的核磁共振图谱；

图5为菌株CB-019的排油圈；

图6为菌株CB-019降解原油前后的气相色谱对比图；

图7为菌株CB-019降解瓜胶水解圈。

具体实施方式

下属非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例采用的培养基及其组成如下：

LB固体培养基：琼脂粉18～20g/L，蛋白胨8～10g/L，酵母粉3～5g/L，NaCl8～10g/L，补水至1L，pH 7.0～8.0；

种子培养基：蛋白胨8～10g/L，酵母粉3～5g/L，NaCl 8～10g/L，补水至1L，pH 7.0～8.0；

发酵培养基：葡萄糖10～12g/L，L-谷氨酸钠2～3g/L，酵母粉0.5～1g/L，K₂HPO₄>2PO₄>4>4>4>2>

实施例1 菌株CB-019的筛选及鉴定

1.菌株CB-019的分离

(1)样品来源：某油田采出液。

(2)菌株初筛：将样品用无菌水按浓度梯度稀释至10^-3～10^-8，取0.1mL均匀涂布于血平板培养基上，放于37℃培养箱中培养。将有溶血圈的菌落转接至新鲜的血平板上，划线纯化后接种至斜面培养基中，4℃保存，备用。

(3)菌株复筛：将保存的菌种接种至LB培养基中，37℃、160rpm振荡培养24h，再以1:50的接种量接种至发酵培养基中，37℃下、160rpm振荡培养30～36h。取上述发酵液30mL，5000r/min条件下离心后测定上清液的表面张力。其中表面张力值最低(29.35mN/m)的菌株，编号为CB-019。

2.菌株CB-019的鉴定

(1)菌体特征：单个细胞(0.7～0.8)×(2.0～3.0)μm，着色均匀；芽孢(0.6～0.9)×(1.0～1.5)μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

(2)菌落特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

(3)理化性质：革兰氏阳性菌(革兰氏染色镜检如图1所示)，接触酶和氧化酶反应均为阳性；淀粉水解、水解酪素及水解明胶均为阳性；柠檬酸利用试验呈阳性；甲基红试验呈阴性。

(4)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)相似但又有区别的类群，定名为CB-019，被分类于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.11950，保藏日期为2016年1月4日。菌株CB-019的16S rDNA序列具体可见序列表，系统发育树如图2所示。

实施例2 菌株CB-019的发酵产物提取及鉴定

菌株CB-019的发酵：将解淀粉芽孢杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，在35℃培养1d，将单菌落接种于种子培养基内，在35℃、150rpm下振荡培养2d，成为种子液，种子液按照体积比1:20接入发酵培养基中，在35℃、150rpm下振荡培养3d，离心，得发酵液。

发酵液采用酸沉淀法提取CB-019中的发酵产物：将发酵液离心去除菌体，调节上清液pH为2.0，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀用pH 2.0盐酸洗涤，用NaHCO₃粉末调节盐酸洗涤液至pH>

分别采用茚三酮显色反应、红外图谱和核磁图谱对发酵产物进行鉴定。

茚三酮显色反应为紫色，说明菌株CB-019的发酵产物含有肽类物质；红外图谱的测定结果如图3所示，由图可知，3410cm^-1处的吸收带为N-H、O-H键伸缩振动吸收。2928cm^-1、2859cm^-1为脂肪族碳链上的C-H键伸缩振动的吸收带，1468cm^-1和1390cm^-1为碳链上C-H的弯曲振动吸收带，说明存在碳链结构。在1658cm^-1和1545cm^-1处是酰胺谱带I和II，说明CB-019发酵产物分子中存在肽键；1240cm^-1是C-O-C键的吸收峰，说明物质中有酯基结构；H-NMR核磁共振图谱的测定结果如图4所示，由图可知，化学位移0.5～1.25的峰，可以推断含有烷烃链，且峰面积较大，说明存在长链脂肪酸，化学位移4.6的峰，可以推断烯烃的存在。

综合茚三酮显色反应、红外光谱和核磁图谱的分析结果，推断出CB-019的表面活性产物具有表面活性素的结构特征，CB-019发酵产物为表面活性素。

实施例3 菌株CB-019生物活性物质性能测定

采用实施例2得到的菌株CB-019的发酵液进行如下的测定。

1.乳化性能测定

(1)发酵液排油圈测定：0.5g苏丹红Ⅲ加入到100mL液体石蜡中，将液体石蜡染色，过滤后备用。将8mL染色后的液体石蜡加入到装有60mL蒸馏水的9cm平皿中，平皿表面形成一层均匀分散的染色后的液体石蜡薄膜后，在油膜中心慢慢滴入菌株CB-019发酵液1mL，观察排油圈大小，结果如图5所示，结果表明CB-019能产生较大排油圈，直径约5～6cm。

(2)煤油和液体石蜡乳化率：取煤油和液体石蜡各5mL，在刻度试管内分别与等体积的菌株CB-019发酵液混合，漩涡振荡器震荡1min，混合后静置，5min后观察起泡层高度，结果表明CB-019对煤油乳化率可达72％，对液体石蜡乳化率可达55％。

(3)原油乳化测定：发酵培养基中分别加入10％的4种原油样品，接入CB-019种子液，接种量为1:10，在35℃、150rpm培养3d后，观察原油变化。结果如表1所示，结果表明CB-019对原油具有较好的乳化效果。

表1 菌株CB-019的原油乳化性能

油样CB-019对原油乳化实验现象1#分层，黑色小颗粒1～2mm，水相澄清，少量挂壁2#分层，黑色小颗粒4～5mm，水相澄清，挂壁3#分层，棕色絮状，水相略浑浊，挂壁4#分层，黑色小颗粒0.5～1mm，水相浑浊，少量挂壁

2.环境适应性

(1)耐温适应性：将CB-019种子液按照体积比1:10接种于发酵培养基，置于不同温度下培养24h，测定发酵液表面张力。结果如表2所示，结果表明菌株CB-019可在温度为25～45℃的范围内生长，并产生生物表面活性剂，35℃下代谢产物活性最高，表面张力最低，可达27.3mN/m。

表2 菌株CB-019的耐温适应性

温度，℃2530354045表面张力，mN/m30.629.027.328.529.7

(2)耐碱适应性：将CB-019种子液接种于不同pH的发酵培养基，培养24h，测定发酵液表面张力。结果如表3所示，结果表明菌株CB-019可在pH为4～9的范围内生长，并产生生物表面活性剂，pH＝6下表面张力最低，可达28.9mN/m。

表3 菌株CB-019的耐碱适应性

pH456789表面张力，mN/m30.230.328.929.129.529.1

(3)耐盐适应性：将CB-019种子液接按照体积比1:10种于由NaCl配制的不同矿化度的发酵培养基，培养24h，测定发酵液表面张力。结果如表4所示，结果表明菌株CB-019可在矿化度≤10×10⁴mg/L的范围内生长，并产生生物表面活性剂。矿化度为5×10⁴mg/L下表面张力最低，可达27.3mN/m。

表4 菌株CB-019的耐盐适应性

矿化度，10⁴mg/L051015表面张力，mN/m29.627.330.940.3

实施例4菌株CB-019原油降解能力测定

发酵培养基中接入10％的原油样品，高温高压灭菌后，接入CB-019种子液，接种量为10％；150rpm培养8d后，观察原油变化，并采用气相色谱测定CB-019降解原油前后的组分变化。结果表明CB-019在接有原油的培养基中能够生长，且培养基呈浅棕色。图6为菌株CB-019降解原油前后的气相色谱对比图，结果表明CB-019处理原油样品前后，原油中各组分明显减少，其中碳链长度小于11的组分几乎完全降解，碳链长度为11～21的降解情况如表5所示，CB-019对碳链长度为11～21的平均降解率可达42.15％，说明CB-019对原油中各组分具有较好的降解能力。

表5 CB-019降解原油前后组分含量变化

实施例5生化型驱油剂的表面张力测定

按照如下方法制备生化型驱油剂，并进行表面张力测定。

(1)将解淀粉芽孢杆菌CB-019菌种接种于LB固体培养基上，35℃培养1d，所述LB固体培养基为琼脂粉18g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，补水至1L，pH 7.0～8.0；

(2)将LB固体培养基单菌落接种于种子培养基内，35℃、振荡培养1d，成为种子液，所述种子培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L,补水至1L，pH 7.0～8.0；

(3)将种子液接入发酵培养基中，培养2d，离心，得发酵液，所述发酵培养基为：葡萄糖10g/L，L-谷氨酸钠2g/L，酵母粉1g/L，K₂HPO₄>2PO₄1.5g/L，FeSO₄>4>4>20.02g/L，补水至1L，pH>

其中所述的培养条件还包括所述振荡速率为150rpm；所述种子液与发酵液培养基的体积比为1:20。

在50℃下，将质量百分比为70％的菌株CB-019的发酵液、0.8％的非离子型表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸二乙醇酰胺或多元醇脂肪酸脂中的一种)、0.002％的非离子氟碳表面活性剂FC-03(聚氧乙烯醚类)混合搅拌50min，分别测定表面张力值。实验结果如表6所示，复配的生化型驱油剂表面张力值较低，可达25.0mN/m左右，具有较高的降低表面张力的能力。

表6 生化型驱油剂的表面张力测定

实施例6 模拟驱油试验

按照如下方法进行菌株CB-019发酵液和生化型驱油剂的填砂管驱油试验。

(1)使用的填砂管长度为30cm，内径为2.5cm，其中1#为对照组，2#为CB-019发酵液实验组，3#为生化型驱油剂实验组，实验用砂为粒径大小不一的砂粒，人工压制填实。

(2)将制备好的砂管通氮气测定气相渗透率。

(3)砂管用模拟配制矿化度为7×10⁴mg/L的水抽真空饱和24h，比较饱和地层水前后的岩心质量差以确定孔隙体积PV，然后计算孔隙度。

(4)测定在恒流下整个岩心段的压差，通过达西定律来确定绝对渗透率。

(5)用采集获得的原油驱替岩心管中的地层水直至出口产出液含水小于2％，计算驱出水体积即原油饱和体积，计算出原始含油饱和度。

(6)砂管在37℃条件下老化7d。

(7)1#砂管进行水驱，水驱至含水95％。计算水驱采收率。

(8)将CB-019发酵液分别注入其它2根砂管中，37℃条件下孵育7d后水驱，计算采收率。

结果如表7所示，结果表明CB-019可使驱油效率提高14.71％，生化型驱油剂可使驱油效率提高18.86％，表明生化型驱油剂具有更好的驱油能力，在提高原油采收率方面具有很大的潜力。

表7 菌株CB-019的填砂管试验结果

实施例7 菌株CB-019处理含油废水试验

发酵培养基中接入约500mg/L的原油样品，高温高压灭菌后，接入CB-019种子液，接种量为10％；150rpm培养8d后，加入适量的石油醚萃取至发酵液无色，经无水硫酸钠脱水，保证萃取液不浑浊，在430nm的波长下比色。结果如表8所示，结果表明菌株CB-019能够降531.2mg/L的含油废水降解至171.8mg/L，降解率达67.66％，菌株CB-019对含油废水有较好的处理效果。

表8 菌株CB-019处理含油污水前后对比

含油污水石油烃浓度，mg/LCB-019处理前531.2CB-019处理后171.8

实施例8 菌株CB-019瓜胶降解能力测定

1.菌株CB-019降解瓜胶水解圈

挑取菌株CB-019单菌落，稀释平板涂布于含油0.5％瓜胶的固体培养基上，于37℃下培养48h，往平板中倒入一层碘液，静置10min，观察菌落和透明水解圈。结果如图7所示，结果表明能看见明显降解瓜胶的水解圈，菌株CB-019具有降解瓜胶的能力。

2.菌株CB-019降解瓜胶粘度

将CB-019种子液接种至装有5.0mL瓜胶的发酵培养基中静置3d，以加蒸馏水作为对照，分别测定粘度。结果如表9所示，结果表明CB-019可将粘度为10.27mPa·s的瓜胶降至1.62mPa·s，对瓜胶的降解率达84.2％，可应用于压裂返排液的处理。

表9 菌株CB-019降解瓜胶试验结果

样品粘度，mPa·s空白对照10.27CB-019发酵液1.62