一种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法

摘要

本发明涉及茶叶中抗氧化能力分析，旨在提供一种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法。该种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法包括步骤：配制次氯酸钠标准溶液、配制载流溶液、配制茶多酚标准品溶液、配制鲁米诺发光试剂溶液、配制待测试样溶液，然后利用顺序注射化学发光分析系统装置进行分析测定，可得试样折算成标准还原性物质抗氧化性能力的定量指标，实现对茶叶或茶叶制品总抗氧化能力的分析测定。本发明是基于茶叶试样提取物与氧化剂次氯酸钠的反应，来测定样品的总抗氧化能力，且将顺序注射分析与化学发光检测技术联用，兼具两者的优势。

说明书

技术领域

本发明是关于茶叶中抗氧化能力分析领域，特别涉及一种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法。

背景技术

抗氧化作用被认为是茶叶保健作用中最重要的部分。目前国内外有关茶的抗氧化作用及机理研究报道较多，但大量用于茶叶中抗氧化能力的分析研究报道，是基于茶叶及其制品中有效成分，如茶多酚、黄酮类、没食子酸、儿茶素及茶黄素等成分的分子结构所具有的物理化学性质，分别进行紫外-可见分光光度法检测。如茶多酚采用Folin-Ciocalteu(福林酚)法(Mokbel,M.S.,and Hashinaga,F.Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan(Citrus grandis Osbeck)fruit tissues[J].Food Chem.,2006,94:529-534)测定，其原理是试样在70℃水浴上用70％甲醇提取，用Folin-Ciocalteu试剂氧化茶多酚中—OH基团并显蓝色，在最大吸收波长λ为765nm下测定，没食子酸作参比校正，标定茶多酚含量。黄酮类采用三氯化铝比色法(钟萝，主编.茶叶品质理化分析[M].上海：上海科技出版社，1989.)测定，其原理为试样用AlCl₃络合显色后，在最大吸收波长λ为510nm下测定，以芦丁为标准品，标定黄酮含量。没食子酸、儿茶素及茶黄素采用高效液相色谱法(Liang,Y.R.,Lu,J.L.,and>18柱色谱柱上，采用梯度洗脱分离，并在波长278nm检测，分别用茶黄素、儿茶素等标准物外标法定量。

上述对茶叶中不同抗氧化有效成分的分析，需分别采用相应显色剂或相应色谱分离技术，不仅操作繁琐，而且对茶叶的总抗氧化性能的测定也不直接；尤其是各种分析方法对某些有效成分可能重复测定，而对另一些有效成分则测定不全面，因此对总抗氧化性能的测定不直接且可能存在误差。

流动注射分析(Flow Injection Analysis，FIA)，是由丹麦技术大学的J.Ruzicka和E.H.Hansen于1975年提出的迅速发展起来的溶液自动在线处理及测定的现代分析技术，即在非热力学平衡条件下，在液流中重现性地处理试样或试剂区带的定量流动分析技术。近年来，该分析方法与其它分析技术相结合，极大地推动了仪器分析的发展，成为带有微量、高速和自动化等优势的新型分析方法。

流动注射分析发展迅速，被广泛应用于很多分析领域。顺序注射分析(Sequential Injection Analysis，SIA)是在此基础上，由Ruzicka和Marshall于1990年进一步发展的流动分析法。除具有FIA的优势外，SIA还有一些独特的优点。系统硬件简单可靠，操作完全由微机控制，样品和试剂的混合程度、反应时间可通过软件控制，分析过程易于自动化、智能化；可用同一装置完成不同组分的检测而无需改变流路设置，样品和试剂的消耗更少，更适于受样品来源有限、试剂昂贵等因素制约的试样的分析。

随着顺序注射分析中试样试剂用量的减少，对检测方法的灵敏度的要求也相应提高。化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、检测装置简单、可持续在线检测等优点，鲁米诺具有良好的水溶性和突出的发光性能，是应用最广泛的化学发光试剂。次氯酸及次氯酸盐具有强氧化性，可快速氧化溶液中的还原性物质，氧化鲁米诺后会发生化学发光反应，且该发光反应速度快，量子效率高。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种简单、方便、灵敏度高，基于流动分析的茶叶中还原性物质总抗氧化能力检测分析方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法，利用顺序注射化学发光分析系统装置进行分析测定，所述茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法具体包括下述步骤：

(1)配制次氯酸钠标准溶液：

量取次氯酸钠溶液(有效氯含量5％)，加重蒸馏水稀释并滴加0.5mol/L的硫酸，调节至pH为6.2后，定容；再采用紫外分光光度法标定浓度(检测λ＝235nm的吸光度，以ε＝100mol/L·cm为消光系数进行标定)，得到次氯酸钠储备液；

进一步稀释采用重蒸馏水，临用时稀释至1.0×10^-4mol/L～1.0×10^-5mol/L的次氯酸钠标准溶液；

(2)配制载流溶液：

称取碳酸钠，溶于水制成0.10mol/L的Na₂CO₃溶液；再向该Na₂CO₃缓冲溶液中滴加0.10mol/L的HCl溶液，调节pH至10.50，得到Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液；

(3)配制茶多酚标准品溶液：

称取茶多酚标准品，溶于100mL水中定容，得到浓度范围为1.0×10^-7～1.0×10^-6mol/L的茶多酚标准品溶液；

再用pH为3.0的甲酸-甲酸钠缓冲液(取1.36mL的浓硫酸和4.23mL甲酸加重蒸馏水至250mL，用0.5mol/L稀硫酸调至pH为3.0，即制得甲酸-甲酸钠缓冲液)稀释茶多酚标准品溶液，分别稀释成所需的不同浓度的茶多酚标准品溶液；

(4)配制鲁米诺发光试剂溶液：

称取鲁米诺溶解于0.1mol/L的NaOH溶液中，再用步骤(2)配制的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液(根据试样需要，pH控制在8.0～12.0范围)定容后，制得浓度范围在1.0×10^-1mol/L～1.0×10^-3mol/L的鲁米诺发光试剂溶液；

(5)配制待测试样溶液：

称取0.0001g待测茶叶或茶叶制品捣碎，加重蒸馏水混合、过滤后，制得待测试样溶液，并将待测试样溶液定容至100mL；

(6)先用重蒸馏水清洗顺序注射化学发光分析系统装置，包括顺序注射泵、储液管、六位选择阀，并使整个顺序注射化学发光分析系统装置的管路内部充满重蒸馏水且无空气；

(7)开启恒流注射泵，用步骤(4)配制中的鲁米诺发光试剂溶液以20mL/h～40mL/h的固定流速推入反应盘管；

(8)待光电倍增管的记录基线平稳后，六位选择阀依次先转至P3号阀位，顺序注射泵将步骤(2)配制的载流溶液抽入储液管；六位选择阀再转至P4号阀位，顺序注射泵将步骤(1)配制的次氯酸标准溶液抽入储液管；六位选择阀再转至P5号阀位，顺序注射泵将步骤(5)配制的待测试样溶液抽入储液管；六位选择阀最后转至P1号阀位，顺序注射泵将上述在储液管内逐渐混合的溶液注入反应盘管；

(9)步骤(8)注入反应盘管的溶液，与步骤(7)由恒流注射泵推入鲁米诺发光试剂溶液混合发光，发光信号用光电倍增管记录，经数据处理后输出；

(10)重复步骤(8)至步骤(9)，分别测定步骤(3)配制的不同浓度的茶多酚标准品溶液的发光信号；根据所得检测信号的相应峰高，绘制工作曲线；

(11)将六位选择阀P4号阀位对应的次氯酸标准溶液，换成待测试样溶液(步骤(5)配制)，重复上述步骤(8)至步骤(9)，检测待测试样溶液(步骤(5)配制)，得到检测信号的相应峰高，对照工作曲线，可得试样折算成标准还原性物质抗氧化性能力的定量指标，实现对茶叶或茶叶制品总抗氧化能力的分析测定。

在本发明中，绘制步骤(10)中工作曲线的茶多酚标准品溶液，为步骤(3)配制的浓度为1.0×10^-7～1.0×10^-6mol/L的茶多酚标准品溶液。

在本发明中，所述步骤(6)～步骤(11)的具体操作(整个流程由软件控制自动进行)为：

a：将顺序注射泵的三通阀转至A-B口相连，S口封闭；

b：将重蒸馏水用注射器手工注入储液管、六位选择阀、反应盘管等组成的发光分析管路系统；

c：将顺序注射泵的三通阀转至S-B口相连，A口封闭；

d：开启恒流注射泵，使鲁米诺溶液以20mL/h～40mL/h的固定流速推入反应盘管；

e：将六位选择阀顺时针转至P3号阀位；

f：在15秒之中，顺序注射泵吸液300μL；

g：六位选择阀顺时针旋转至P4号阀位；

h：在5秒之中顺序注射泵吸液10μL；

i：等待3秒；

j：六位选择阀顺时针旋转至P5号阀位；

k：等待3秒；

l：在10秒之中，顺序注射泵吸液80μL；

m：等待3秒；

n：六位选择阀顺时针旋转至P1号阀位；

o：等待3秒；

p：在10秒之中，顺序注射泵注射390μL。

提供一种用于所述茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法的顺序注射化学发光分析系统装置，包括顺序注射进样系统、恒流注射泵、储液管、反应盘管、光电倍增管、数据采集系统；

所述顺序注射进样系统包括顺序注射泵、六位选择阀和计算机，计算机通过串口连接顺序注射泵和六位选择阀，实现对顺序注射泵和六位选择阀进行控制；

所述数据采集系统，采用数据采集卡与数据采集计算机连接，记录光电倍增管产生的信号；

所述恒流注射泵和反应盘管通过管路连接，顺序注射泵和六位选择阀之间采用储液管连接；所述六位选择阀的P1号阀位通过管路连接到反应盘管，P3号阀位、P4号阀位通过管路分别连接到载流溶液储液池、次氯酸钠标准溶液储液池，P5号阀位通过管路连接到茶多酚标准溶液储液池或待测试样溶液储液池；所述光电倍增管置于反应盘管下方，用于检测发光信号。

在本发明中，所述反应盘管的内径和外径分别为0.5～0.9mm和1.0～1.7mm。

在本发明中，所述顺序注射泵采用100μL～1000μL的顺序注射泵。

在本发明中，所述储液管采用长度为1cm～20cm的聚四氟乙烯管。

在本发明中，所述光电倍增管与盘管式反应检测池的反应盘管都设置在不透明的暗盒中。

在本发明中，所述顺序注射化学发光分析系统装置中的连接管路都采用聚四氟乙烯(PTFE)管。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明是基于茶叶试样提取物与氧化剂次氯酸钠的反应，来测定样品的总抗氧化能力，且将顺序注射分析与化学发光检测技术联用，兼具两者的优势。

本发明所用氧化剂，在体内可由嗜中性粒细胞中的髓过氧化物酶催化H₂O₂和Cl^-(髓过氧化物酶/H₂O₂/Cl^-体系)产生，亦属内源性氧化性物，因此本法对抗氧化能力的测定具有很强的针对性。

附图说明

图1为本发明中顺序注射化学发光分析系统装置的示意图。

图2为茶多酚试样浓度与检测信号的相关性记录图。

图3为茶多酚试样流速与信号相关性记录图。

图4为次氯酸溶液溶度与信号相关性记录图。

图中的附图标记为：1注射器；2恒流注射泵；3顺序注射泵；4六位选择阀；5计算机；6反应盘管；7废液池。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

一种茶叶或茶叶制品中抗氧化能力的分析方法，采用微型盘管检测池，用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH＝10.50)作为载流，用光电倍增管和数据采集仪记录次氯酸和鲁米诺混合反应后的化学发光信号，进行定量分析；以茶多酚溶液作为标液，绘制标准曲线，从而实现对茶叶或茶叶制品总抗氧化能力的分析测定。

一、仪器装置及方法：

实验所用的顺序注射化学发光分析系统装置如图1所示，主要部件包括程控进样系统、储液管、盘管式反应检测池、光电倍增管处理系统等。程控进样系统包括一个微量恒流注射泵2，一个500μL顺序注射泵3和六位选择阀4组成，采用计算机控制注射泵注射速度和六位选择阀4阀位。

连接注射泵和检测盘管的管路均采用聚四氟乙烯(PTFE)管，发光试剂鲁米诺溶液由微量恒流注射泵2推送进入反应检测盘管。顺序注射泵3和六位选择阀4之间采用长度为10cm的聚四氟乙烯管，作为储液管。六位选择阀4的P3、P4、P5端口上的聚四氟乙烯管分别连接载流(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为10.50)、次氯酸和不同浓度样品的储液池，顺序注射泵3依次抽取进入储液管后，最后通过六位选择阀4的1端 口推入反应盘管6与鲁米诺溶液混合发光，光电倍增管置于反应盘管6下方检测发光信号(其中反应盘管6与光电倍增管置于不透明的暗盒中)。待每次分析结束，可切换顺序注射泵3上的三通阀，用重蒸水清洗流路。

二、实验试剂和材料：

无水碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，无水磷酸氢二钠，无水磷酸二氢钾，次氯酸钠，甲酸，稀硫酸，鲁米诺。

三、实验流程：

实验前将顺序注射泵3、储液管以及六位选择阀4体系用去重蒸馏水清洗，并使这个体系充满水防止空气进入。将鲁米诺溶液经恒流注射泵2以30mL/h的流速推入反应盘管6，待基线平稳后，六位选择阀4依次转至P3号阀位抽取载流、转至P4号阀位抽取次氯酸、转至P5号阀位抽取待测试样溶液，最后转至P1号阀位将储液管的溶液注入反应盘管6，整个流程由软件控制自动进行。发光信号用光电倍增管记录，经数据处理后输出。重复上述流程分别检测不同浓度的试样液。具体操作流程如下：

分析系统操作程序

a：将顺序注射泵3的三通阀转至A-B口相连，S口封闭；

b：将重蒸馏水用注射器1手工注入储液管、六位选择阀4、反应盘管6等组成的发光分析管路系统；

c：将顺序注射泵3的三通阀转至S-B口相连，A口封闭；

d：开启恒流注射泵2，使鲁米诺溶液以20mL/h～40mL/h的固定流速推入反应盘管6；

e：将六位选择阀4顺时针转至P3号阀位；

f：在15秒之中，顺序注射泵3吸液300μL；

g：六位选择阀4顺时针旋转至P4号阀位；

h：在5秒之中顺序注射泵3吸液10μL；

i：等待3秒；

j：六位选择阀4顺时针旋转至P5号阀位；

k：等待3秒；

l：在10秒之中，顺序注射泵3吸液80μL；

m：等待3秒；

n：六位选择阀4顺时针旋转至P1号阀位；

o：等待3秒；

p：在10秒之中，顺序注射泵3注射390μL；

四、标准还原性物质的工作曲线

分别取不同浓度的茶多酚标准溶液。按上述流程分析，得检测信号，根据得到相应峰高，绘制工作曲线。

五、试样抗氧化性能力测定

未知浓度的试样溶液(如茶叶或茶叶制品浸出液或提取液)按上述流程进行检测，得到信号，对照工作曲线可得试样折算成标准还原性物质抗氧化性能力的定量指标。

下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

采用图1中所示装置：反应盘管6内径×外径(根据需要可选0.5×1.0mm、0.8×1.4mm、0.5×1.5mm、0.7×1.7mm、0.9×1.7mm等)与光电倍增管置于暗盒内，暗盒开一个个小孔将反应盘管6引出。反应盘管6中部的下方正对光电倍增管光窗，见图1。光电倍增管工作电压-40V，光信号通过光电倍增管记录。

3个贮液管(3～5)分别装载流缓冲液、次氯酸溶液、茶多酚溶液，本实施例使用的次氯酸浓度为3.2×10^-5mol/L，分别配置茶多酚浓度为1.2×10^-7mol/L、1.7×10^-7mol/L、2.2×10^-7mol/L、2.7×10^-7mol/L、3.2×10^-7mol/L，连续循环进样，微量恒流注射泵2以固定流速(30mL/h)持续进样。实例进样顺序、流量和流通时间见上述分析系统操作程序。实验前用去离子水将整个通道循环运行至光电倍增管数值稳定。

分别进行分析记录相应的光信号，以不同浓度茶多酚浓度横坐标，以信号强度为纵坐标，得图2。

实施例2鲁米诺流速影响

3个贮液管(3～5)分别装pH＝10.50缓冲液、次氯酸溶液、pH＝10.50缓冲液，本实施例使用的次氯酸浓度为3.2×10^-5mol/L，连续循环进样，微量恒流注射泵2流速：10mL/h、20mL/h、30mL/h、40mL/h、50mL/h持续进样。进样顺序、流量和流通时间同上述分析系统操作程序。

如图3所示，结果表明鲁米诺流速为30ml/h时，信号强度最高。表明此为理想的化学发光分析条件。

实施例3次氯酸浓度对信号的影响

3个贮液管(3～5)分别装pH＝10.50缓冲液、次氯酸溶液、pH＝10.50缓冲液，本实施例使用的次氯酸浓度为1.0×10^-4mol/L、5.6×10^-5mol/L、3.2×10^-5mol/L、1.8×10^-5mol/L、1.0×10^-5mol/L，连续循环进样，微量恒流注射泵2流速固定30ml/h持续进样。进样顺序、流量和流通时间同上述分析系统操作程序。

如图4所示，结果表明次氯酸浓度为1.0×10^-4mol/L、5.6×10^-5mol/L时，信号强度已超分析装置的检测上限；次氯酸浓度为1.8×10^-5mol/L、1.0×10^-5mol/L时，信号强度偏弱，会导致茶多酚试样分析的检测范围缩小；次氯酸浓度为3.2×10^-5mol/L，信号强度最合适。表明此为理想化学发光分析条件。

最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。