一组用于三阴性乳腺癌预后的基因及其应用

摘要

本发明公开了一组用于三阴性乳腺癌预后的基因及其应用，该组基因包括：基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2。该组基因的应用包括：用于三阴性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片、用于三阴性乳腺癌预后的试剂盒和用于三阴性乳腺癌预后的基因的评价系统等。本发明能对中国人群的早期三阴性乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行准确预后和分类，有效及时地指导临床用药。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因及其应用，特别是涉及一组用于早期三阴性乳腺癌预后的基因及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性最为常见的恶性肿瘤和死亡原因。随着我国经济的发展和生活方式的改变，国内特别是发达城市的乳腺癌的发病率呈现出快速上升趋势(以每年5％的速度上升)，年新发病人数接近18万。在上海等特大城市，乳腺癌已经跃居女性恶性肿瘤发病率之首。由于目前民众筛查意识的提高以及诊疗水平的提高，乳腺癌的死亡率随之下降，早期乳腺癌的5年存活率高达90％。

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受体ER、孕激素受体PR和人表皮生长因子受体(HER2)均为阴性的一种特殊类型乳腺癌，约占所有乳腺癌的15-20％。根据复旦大学附属肿瘤医院2008年可手术乳腺癌病例的统计结果，TNBC约占所有乳腺癌的18％。根据已有针对TNBC的研究显示，激素受体阴性的乳腺癌分化较差，组织学分级较高，容易复发且总生存率较低，对内分泌药物治疗不敏感是TNBC乳腺癌的主要临床表现。TNBC不仅具有侵袭性强，预后差的临床特点，而且因缺少激素受体无法接受内分泌治疗，缺乏HER-2基因位点而无法接受生物靶向治疗，同时目前免疫组化条件下无法再对三阴性乳腺癌细分，同时对于三阴性乳腺癌，目前尚无统一的标准治疗方法，成为了乳腺癌治疗的难点，其中一部分早期三阴性乳腺癌患者容易出现早期复发、早期转移以及容易出现比较严重的肺、肝等重要脏器的转移复发。根据目前的乳腺癌的共识，TNBC乳腺癌的治疗主要以化疗为主。

目前的最新的研究认为三阴性乳腺癌可能是一大类乳腺癌的杂项，具有高度异质性，其预后差异性很大，传统的病理临床指标尚无法区分出三阴性乳腺癌的预后。高通量的全转录组基因芯片又因为其价格的昂贵，信息量的巨大，无法运用到实际的临床中。国外尚没有针对三阴性乳腺癌的芯片表达谱。同时由于目前回顾性研究中，用于芯片表达谱研究的新鲜冻存标本非常稀有，很难对于已经具有完整随访信息的病例进行研究。

另外，目前美国已经上市的Oncotype DX针对的是雌激素受体阳性的乳腺癌，根据不同的打分标准可以为雌激素受体阳性的乳腺癌判断预后以进一步指导用药。但是Oncotype DX使用的是比较复杂的RT-PCR的技术，需要提取RNA，反转录的过程比较复杂，会减少其效率，所以对三阴性患者并不适用。而Mammaprint有70个基因可以将患者分为高危和低危风险组，对于乳腺癌重要的分子分型没有限制。由于其存在过多的未知功能的基因，在分析效率和实际运用都有很大的限制，广泛推广运用限制较大。而且Mammaprint需要的样本在临床上获取较难，需要新鲜冻存的标本，进一步限制了临床运用。

因此，急需开发一种更加实用、简便且快速的用于检测三阴性乳腺癌预后的基因的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组用于三阴性乳腺癌预后的基因及其应用。本发明针对的是乳腺癌治疗中的难点即三阴性乳腺癌，尤其是针对于临床病理提示早期的三阴性乳腺癌，通过对于定制芯片的多重平行定量检测技术，可对mRNA进行多重平行定量研究，并且所运用的标本可为病理科广泛存在的石蜡切片，因此，本发明更具有临床实用性、高效、灵敏、易操作、准确等优点。

为解决上述技术问题，本发明的第一方面，提供一组用于三阴性乳腺癌(包括早期三阴性乳腺癌)预后的基因，其包括：基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2。该基因的组合能对中国人群的早期三阴性乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行预后和分类，以便及时地进行干预，有效指导临床治疗。

因此，针对本发明的基因组，可提供一系列的应用，如包括：以下的用于三阴性乳腺癌预后的多重平行检测液相基因芯片、用于三阴性乳腺癌预后的试剂盒和用于三阴性乳腺癌预后的基因的评价系统等。另外，需要说明的是，本发明中所述的早期三阴性乳腺癌是指早期三阴性乳腺癌(T_1－2N_0－1)。

本发明的第二方面，提供一种用于三阴性乳腺癌(包括早期三阴性乳腺癌)预后的多重平行检测(如多重平行定量检测)液相基因芯片(该芯片是针对上述基因组进行检测的，以便检测基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2)，包括探针；其中，所述探针包括下列三组核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示序列；

(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示序列中的每条序列的互补链；

(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。

所述芯片还包括：SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示序列的探针。

本发明的第三方面，提供一种用于三阴性乳腺癌(包括早期三阴性乳腺癌)预后的试剂盒，包括下列三组核苷酸序列之一的探针：

(1)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示序列；

(2)SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示序列中的每条序列的互补链；

(3)与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的序列中的每条序列有至少70％同源性的序列。

所述试剂盒还包括：SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示序列的探针。

另外，该试剂盒还可包括用于检测基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2的其他相应试剂，如Proteinase K、Lysis Mixture等。

本发明的第四方面，提供一种用于三阴性乳腺癌(包括早期三阴性乳腺癌)预后的基因的评价系统，包括：复发风险值模块和评价模块；

所述复发风险值模块，用于获得复发风险值，其中，该复发风险值是将上述基因芯片测得的样本的基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2的各自mRNA值与其在Cox回归中的效果估计值相乘而得到的值；

所述评价模块，用于将复发风险值模块中获得的复发风险值，通过受试者工作特征曲线(ROC)的最佳的临界值(cutoff)，能将样本分为预后好和预后差两组。

优选地，所述复发风险值的计算公式可如下：

FFPE_SCORE＝-0.1636*GSTM1+0.5272*BAG1+1.6144*CD68-4.4979*HDGFRP3-2.1337*MAOB-3.6536*TMEFF2

其中，公式中的GSTM1表示利用上述基因芯片检测得到的GSTM1基因的mRNA值；

BAG1表示利用上述基因芯片检测得到的BAG1基因的mRNA值；

CD68表示利用上述基因芯片检测得到的CD68基因的mRNA值；

HDGFRP3表示利用上述基因芯片检测得到的HDGFRP3基因的mRNA值；

MAOB表示利用上述上述基因芯片检测得到的MAOB基因的mRNA值；

TMEFF2表示利用上述基因芯片检测得到的TMEFF2基因的mRNA值。

对于上述基因组，是经以下的研究而获得的：

通过对复旦大学附属肿瘤医院2006年到2008年的乳腺癌标本入手，在全基因表达谱水平及公共数据库进行筛选，从前期初步筛选得到的分子标志基因与前期工作整合的乳腺癌预后相关基因群，这些分子标志基因的功能涉及生长和增殖、细胞外基质形成、趋化因子受体、细胞凋亡、信号转导及DNA修复等多个重要生物学过程。对三阴性乳腺癌的石蜡标本进行检测，筛选出预后表达差异基因群。同时根据三阴性标本预后好坏的标本信息筛选出如下基因在三阴性早期乳腺癌中具有预后价值，临床意义如下：

基因GSTM1：位于第1号染色体上，编码人类谷胱甘肽S-转移酶GSTM1_HUMAN蛋白。谷胱甘肽S-转移酶的细胞质和细胞膜结合的形式是由两个不同的超基因家族编码。参与胞内物质转运、激素的合成、细胞氧化应激损伤的保护，并在癌症化学治疗保护和药物抗性中发挥重要功能。另外，其多态性还与疾病易感性相关。文献报道，GSTM1在小叶原位癌中表达较多。

基因BAG1：位于第9号染色体上，可以编码BAG家族分子伴侣调节器1，BAG1是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它具有与BCL-2形成复合物，而促进抗细胞凋亡的能力。但是BAG1并不属于BCL-2家族。BAG1可以与多种激素受体相结合，从而调整它们的功能。在乳腺组织中BAG-1的阳性表达量要高出乳腺良性肿瘤和正常乳腺组织。可以作为乳腺组织癌变的早期诊断指标。

基因CD68：位于第17号染色体上，(白细胞分化抗原68)是一种糖蛋白结合的低密度脂蛋白。在组织巨噬细胞的吞噬活动中发挥作用，在细胞内的溶酶体代谢和细胞外的细胞与细胞之间、细胞与病原菌的相互作用。结合组织和器官的特异性凝集素或选择，使巨噬细胞亚群归巢到特定的位点。

基因HDGFRP3：位于第15号染色体上，是编码HDGR3_HUMAN蛋白的基因，是肝癌生长因子相关蛋白3，肿瘤组织淋巴细胞浸润中出现上调，在多种组织中存在着表达。这个基因可以增强DNA合成，可以在细胞增殖中起到作用。

基因MAOB：单胺氧化酶B基因，该基因编码的蛋白质属于黄素胺氧化酶家族。它是一种酶，位于线粒体外膜。它催化的氧化脱氨的生物和异胺和神经活性和血管活性胺在中枢神经系统和外周组织的代谢中起着重要的作用。

基因TMEFF2(transmembrance protein with EGF-like and two follistatin-like domains)：其编码了一种tomoregulin-2的蛋白质，是一类与神经发育相关的基因，于1999年首次被克隆。TMEFF2中的表皮生长因子(EGF)样功能域和EGF/Neuregulin家族生长因子具有较高的同源性。TMEFF2表达的受到雄激素的调控，并且被c-Myc蛋白抑制，可能具有抑癌基因的功能。

本发明中，使用的多重平行定量检测技术，是一种三明治结构的核酸杂交方法，该方法采用bDNA分子放大捕获的目标RNA信号。它可以分析各种样本(组织、细胞、血液、FFPE样本、纯化的RNA或DNA等)，只需用特定裂解液裂解样本即可，对样本量下限无要求，特别适合需要对微量样本做多基因定量的研究实验。它融合转录本和DNA拷贝数变异无需核酸的抽提纯化，无需PCR，仅通过与探针的杂交和信号放大，即可进行基因定量，避免了很多人为因素的干扰，可以快速得到准确的实验结果。适用于保存多年的石蜡切片样本。

本发明用于三阴性乳腺癌预后的基因，通过分子杂交，扩增放大的手段进行多重平行检测，对回顾性三阴性乳腺癌组织样本中基因的表达改变状况进行检测，从而对中国人群的早期三阴性乳腺癌患者在手术后5年内复发和不复发的情况进行准确预后和分类，有效及时地指导临床用药。

附图说明

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

图1是训练集的聚类分析图；

图2是验证集的聚类分析图；

图3是训练集的曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)，AUC＝0.818(95％的可信区间为0.659-0.977)；

图4是训练集的曲线下面积(AUC)-受试者工作特征曲线(ROC)，AUC＝0.974(95％的可信区间为0.615-0.974)；

图5是训练集的Kaplan-Meier生存曲线，其中，P值＝0.003；

图6是验证集的Kaplan-Meier生存曲线，其中，P值＝0.020。

具体实施方式

本实施例以中国乳腺癌人群为研究对象，以乳腺癌病理组织为样本，以多重平行检测液相基因芯片工具，进行以下实验。

其中，以下试验中所用的试剂如未特别说明，则为商业化试剂。

另外，所有的乳腺癌组织标本均来自复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科所收治的可手术乳腺癌患者的标本，病理分期为T_1-2N_0-1的早期乳腺癌，确定为乳腺浸润性癌标本，其免疫组化ER及PR为阴性、HER21+或者2+Fish检测为阴性的患者。结合前期乳腺癌预后相关基因群的工作，采用10折交叉验证(10-fold>

具体实验如下：

(一)样本收集和临床信息采集

收集复旦大学附属肿瘤医院病理科中回顾性的组织标本，采集临床信息，临床信息包括：治疗方案选择、完整临床病史、组织病理分型、组织学分级、有无脉管浸润、淋巴结情况、激素受体情况、免疫组化指标、治疗情况、随访资料等，并建立数据库。收集了从2006年至今的明确的三阴性乳腺癌组织标本，均为手术之前未接受过任何治疗的标本，新辅助化疗的病例被排除，所有的病例术后的病理学检测均为淋巴结转移少于等于3个转移的可手术乳腺癌(T_1-2N_0-1)。选择的病例为明确出现局部复发或原处转移的标本。局部复发的患者具有细胞学明确诊断的。远处转移的患者多发的仅通过影像学确定，单发的需要病理学确诊。

一共挑选出60例的石蜡切片的标本。这60例标本随机分为两组，其中，30例标本作为训练集(训练集中预后好19例，预后差11例)，30例标本作为验证集(验证集中预后好19例，预后差11例)。

(二)对于上述60例石蜡切片的标本，重新进行免疫组化蛋白ER、PR、HER2和ki67，标准如下：

ER和PR抗体使用商用的抗体，Dako(克隆号ER 1D5 1:35和PR 636 1:50)。ER和PR阴性的评判标准是乳腺癌核细胞阳性<1％。两个独立的病理科医生共同评判ER和PR的阴性。对于HER2阳性的判定，使用的是单克隆抗体(Dako，克隆号PN2A 1:400)，HER-2阳性需要是肿瘤细胞细胞膜阳性，阳性比例超过10％。HER2也进行0到3+的半定量的评判，需要根据膜染色强度。0分(0)认为是没有染色；1分(1+)被认为是染色强度弱，细胞膜染色不完整；2分(2+)细胞膜染色强度弱到中等，至少染色比例超过10％；3分(3+)染色强度均匀一致，超过30％的比例)。在研究中，HER2免疫组化3+被认为是HER2有扩增，2+的结果需要根据HER2/neu基因扩增FISH检查的结果进一步判定，HER2阴性我们定义为免疫组化HER21+，以及HER22+且FISH阴性。

将免疫组化ER及PR为阴性、HER21+或者HER22+且Fish检测为阴性的患者，确认为三阴性乳腺癌患者。

(三)多重平行定量检测技术标本的准备，可按常规的实验手册所述的条件进行，具体可如下。

1)石蜡包埋切片组织匀浆液的制备

1.测量玻片上组织的面积，取5片玻片用干净的刮刀将玻片上的FFPE样本(即上述石蜡切片样本)刮入1.5mL的离心管中。按照下表1加入相应体积的匀浆液和蛋白酶K(10mg/mL)。其中，匀浆液来自商业化试剂盒(Quantigene multiplex assay kit)。

表1 匀浆液和蛋白酶K的用量

组织面积(mm²)匀浆液(μL)蛋白酶K体积(μL)25-1003003100-2256006>2259009

2.短暂地漩涡震荡样本后，将样本置于65±1℃水浴6小时，期间每过一个小时漩涡震荡1min。

3.室温下最大速度离心样品5min，沉淀细胞碎片，然后，将匀浆液转移至新的离心管中，避免石蜡和碎片残留，如有必要重复操作来去掉碎片。

4.立即使用组织匀浆液或保存于-80℃冰箱中。

2)样本多重平行定量检测(液相基因芯片)实验步骤

1.将所需试剂从冰箱取出，置于室温融化平衡10min。组织匀浆液，如果是冷冻的，首先将其从-80℃冰箱取出并室温融化之后，置于37±1℃30分钟。孵育后，振荡混匀样本。放置于室温中。

2.将Lysis Mixture置于37±1℃水浴预热30分钟，并轻柔混匀。

3.根据所用样本数，结合下表2中所列配制工作液。

表2 工作液的组分

其中，上述组分中的Lysis Mixture、Blocking Reagent、Proteinase K和Capture Beads来自商业化的试剂盒(Quantigene multiplex assay kit)。

2.0Probe Set(SEQ ID NO.1-16所示的探针)中所涉及的探针为针对基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2的捕获探针和杂交探针以及内参基因(ACTB和PPIA)的捕获探针和杂交探针(表3)。其中，每种探针的浓度为1μg/mL。

表3 探针

4.在96孔杂交板上，每孔加入60μL工作液以及40μL相应的样本(上述石蜡包埋切片组织刮除标本的匀浆液)，覆膜后，54±1℃600rpm振荡避光杂交18-22小时。

5.杂交完毕后，将杂交板中的液体，转入相应的磁力分离板的对应孔中。

6.将磁力分离板置于手持磁力架上。每个反应孔加入洗涤缓冲液(来自Quantigene multiplexassay kit)100μL洗涤20s，重复三次。

7.加入预扩增工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。

8.重复步骤6。

9.加入扩增工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。

10.重复步骤6。

11.加入Label Probe工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，50±1℃600rpm振荡避光温浴1小时。

12.重复步骤6。

13.加入SAPE工作液(来自Quantigene multiplex assay kit)100μL，覆膜后，室温600rpm振荡避光温浴0.5小时。

14.将磁力分离板置于手持磁力架上，每个反应孔加入SAPE洗涤缓冲液(来自Quantigenemultiplex assay kit)100μL洗涤20s，重复三次。

15.加入130μL SAPE洗涤缓冲液(来自Quantigene multiplex assay kit)于每个反应孔中，800rpm振荡1分钟后，置于Bioplex 100液体芯片分析系统，读取荧光值数据。

其中，上述芯片检测中，杂交反应仪器：Labnet wortemp 56；杂交反应清洗仪器：BioplexProII wash station；荧光数据读取仪器：Luminex 100。

多重平行定量检测所使用的石蜡标本是储存在病理科，挑选的石蜡标本都是经过病理科高年资的医生重新复读HE染色切片，保证所选择的石蜡标本是所有标本中，恶性肿瘤所占比例最高，同时至少满足50％的要求。对于不满足的标本予以剔除。

(四)多重平行定量检测(液相基因芯片)技术进行检测

通过Bioplex 100液体芯片分析系统读取上述检测得到的相关基因的荧光值，并用内参基因(ACTB和PPIA)的几何平均值对每个待测基因进行均一化分析，以得到每个样本每个基因的表达量。

(五)数据处理：

将已有的标本病例采用随机抽样法对两种组织样本分别进行抽样随机分为两组，一组为训练集(训练集30例)，一组作为独立的验证集(验证集30例)。

通过结合前期乳腺癌预后相关基因群的工作，采用10折交叉验证(10-fold crossvalidation)来选择和评估模型。利用Cox比例风险回归模型，构建复发风险计算模型，通过训练集构建三阴性患者的基因谱，然后通过独立的验证集进行验证。所有统计分析过程通过SPSS软件(IBM SPSS 19)以及Weka3.6.10完成，以双侧P<0.05为统计学显著界值。

多重平行定量检测技术通过Bioplex 100液体芯片分析系统读取相关基因的荧光值，并用内参基因的几何平均值对每个待测基因进行均一化分析，以得到每个样本每个基因的表达量。由于将同样的训练集建立模型，所有的单因素生存分析及多因素生存分析均使用重复抽样(Bootstrapping)1000次进行内部验证。独立验证集进行外部验证。Kaplan-Meier生存分析进行分组因素水平间的线性趋势检验，以双侧P<0.05为统计学显著界值。

(六)数据结果

1、经过前期筛选和优化，有6个mRNA(GSTM1，BAG1，CD68，HDGFRP3，MAOB和TMEFF2)纳入模型构建。利用Cox比例风险回归方程，建立了基于以上分子的模型，模型结果如下：

FFPE_SCORE(复发风险值)

＝-0.1636*GSTM1+0.5272*BAG1+1.6144*CD68-4.4979*HDGFRP3-2.1337*MAOB-3.6536*

TMEFF2

其中，公式中的GSTM1表示利用上述多重平行定量检测得到的GSTM1基因的mRNA值；

BAG1表示利用上述多重平行定量检测得到的BAG1基因的mRNA值；

CD68表示利用上述多重平行定量检测得到的CD68基因的mRNA值；

HDGFRP3表示利用上述多重平行定量检测得到的HDGFRP3基因的mRNA值；

MAOB表示利用上述多重平行定量检测得到的MAOB基因的mRNA值；

TMEFF2表示利用上述多重平行定量检测得到的TMEFF2基因的mRNA值。

也就是说，用上述多重平行定量检测中获得的mRNA的读值和其在Cox比例风险回归中的效果估计值相乘，所得到的评分就是三阴性乳腺癌患者的复发风险值。

2、通过聚类树状图，可以看到训练集标本中复发、转移的样本和无复发、转移的样本各自聚成一类，说明这6个基因可以很好地把三阴性乳腺癌术后复发和不复发样本区分开，聚类树状图上面是样本编号，右列是本发明探针所针对的6个差异基因的名称，再下面是表达图谱，黑色表示基因上调(相对于该基因的平均数)，白色表示下调，根据训练集的模型，用验证集进行验证，分类的准确性达到80％(如图1-2所示)。

3、通过训练集中多重平行检测中获得的mRNA的读值和其在Cox比例风险回归中的效果估计值相乘所得到的三阴性乳腺癌的复发风险值(FFPE_SCORE)，根据模型评分，计算出训练集和验证集中每位患者的复发风险值(FFPE_SCORE)，训练集的曲线下面积(AUC)为0.818、95％的可信区间为(0.659-0.977)，并根据ROC得到最佳的cutoff值，将其划分为高危组和低危组。通过Kaplan-Meier曲线，可以看到无论是训练集还是验证集，高危组和低危组均能很好的区分不同的预后，对于无疾病进展时间具有统计学差异(训练集P＝0.003，验证集P＝0.020)(如图3-6所示)。

4、我们把复发风险值和其他临床有意义的预后指标(月经状态、腋窝淋巴结阳性个数、肿瘤大小、核分级、有无脉管癌栓、手术治疗方式)放入进行多因素回归分析，可以看到无论是在训练集还是验证集中，复发风险值是独立于其它预后因素的预后指标，其P值均小于0.05，具有统计学差异。其中，训练集中的结果如表4所示，验证集中的结果如表5所示。另外，表4-5中，B＝回归系数的估计值，SE＝估计值的标准误，Wald＝估计值的Wald检验统计量值，df＝自由度，Sig＝显著性水平即P值，Exp(B)＝各因子或哑变量的效果的估计值。

由上述实验可知，本发明能对中国人群的早期三阴性乳腺癌预后的复发和不复发的情况进行准确预后和分类，为及时指导临床用药奠定基础。

表4 方程中的变量

表5 方程中的变量