一种防治梨树腐烂病的生物杀菌剂及其生产方法

摘要

本发明公开了一种防治梨树腐烂病的生物杀菌剂，生物杀菌剂中的各组分的含量如下：杀菌活性物质粗提液 300～500 mL/L、羧甲基纤维素纳 20～40 g/L、芸苔素内酯 10～50 mg/L、甘油 50～150 mL/L、氮酮 10～40 mL/L、有机硅DC‑5211 0.3～1 mL/L，其余为水；其中杀菌活性物质粗提液中含有杀菌活性物质为HSAF，生物杀菌剂中HSAF的浓度为24～40mg/L；本发明生物杀菌剂可通过对刮治后的病疤进行药剂涂抹防治梨树腐烂病，且具有成膜效果好，渗透力强，药效期长，伤口愈合快，治愈率高，药养多效，安全实用；本发明能替代化学杀菌剂，减少梨树腐烂病防治过程中化学农药的施用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药的制备技术领域，尤其涉及一种能够用于防治梨树腐烂病的生物杀菌剂。

背景技术

梨树腐烂病又名臭皮病，是梨树最重要的枝干病害。该病在我国各地梨园均有发生，特别在西北、华北和管理水平较低的梨园发生尤为严重。该病以侵染和危害主干、主枝和较大的侧生枝为主，病菌从各种伤口（剪锯口、环割口、冻伤、虫伤口）及死亡组织侵入，也能从皮孔、叶柄痕和果柄痕侵入。病菌有潜伏侵染的特性，当树势衰弱，抗病力下降时，潜伏病菌便大量繁殖，迅速扩展引起树皮腐烂，出现病疤，严重时导致枝干枯死，甚至毁园。生产上梨树腐烂病防治的主要方法是采用对刮治后的病疤涂刷药液或淋洗式喷雾施药。自2009年福美砷禁用后，目前生产上常用的化学药剂有甲硫·萘乙酸、腐植酸铜、菌毒清、甲基硫菌灵、丁香菌酯、噻霉酮、戊唑醇等。这些药剂大多来源于苹果腐烂病的防治，单一效果较好，但是均为化学药剂，对梨果质量和梨园生态环境安全有不同程度的负面影响。

HSAF (Heat Stable antifungal factor) 是本实验室从生防细菌产酶溶杆菌（Lysobacter>）OH11菌株中分离鉴定的一种结构和作用方式新颖，生物合成独特的小分子广谱抗真菌、卵菌物质。该物质对热极其稳定，121℃高压处理20 min仍有抗菌活性；对人、动物和非靶标生物毒性很低；对包括梨腐烂病菌在内的10多种植物病原真菌、卵菌均有较强的拮抗活性（见申请专利201410823196.4）。因此，针对梨树腐烂病绿色防治的现实需求，开发基于HSAF的应用方便、高效安全、兼具病疤治疗和伤口愈合双重效果的生物杀菌剂具有重要意义。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明目的在于提供一种成膜效果好，渗透力强，药效期长，伤口愈合快，治愈率高，药养多效，安全实用，且不会对梨果品质和梨园生态环境造成不良影响的能够用于防治梨树腐烂病的生物杀菌剂。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种防治梨树腐烂病的生物杀菌剂，所述的生物杀菌剂中的各组分的含量如下：杀菌活性物质粗提液 300～500 mL/L、羧甲基纤维素纳 20～40 g/L、芸苔素内酯 10～50 mg/L、甘油 50～150 mL/L、氮酮 10～40 mL/L、有机硅DC-5211 0.3～1 mL/L，其余为水；其中杀菌活性物质粗提液中含有杀菌活性物质为HSAF，生物杀菌剂中HSAF的浓度为24～40mg/L。

本发明的所述的防治梨树腐烂病的生物杀菌剂的生产方法包括杀菌活性物质粗提液的制备和生物杀菌剂的制备，其详细的操作步骤如下：

1）活化培养：取产酶溶杆菌OH11菌株，划线接种至LB固体平板上，在28℃条件下活化培养24～36 h；

2）种子液制备：利用灭菌牙签挑取一个单菌落接种到一个含有LB液体培养基的三角瓶中，28℃条件下震荡培养16～24 h，震荡频率为150 r/min；

3）发酵液制备：将上述步骤2）所得的种子液以体积比为2%的比例接种到10% TSB培养基中进行发酵，发酵温度为28℃，以每分钟通过发酵液的空气体积与发酵液体积之比为0.5～2.0:1的方式，进行发酵通气，搅拌速度为80～160 r/min，发酵时间为72 h；

4）杀菌活性物质粗提液的制备：将发酵液利用双层纱布过滤，煮沸10 min，然后6000 r/min离心15分钟取上清，用HPLC测定发酵上清中HSAF含量，并利用纯水将HSAF的浓度调整到80 mg/L，得到杀菌活性物质粗提液；

5）凝胶的制备：称取20～40 g羧甲基纤维素钠缓慢加入250 mL纯水中，搅拌均匀后静置过夜，使其充分溶胀；然后依次将芸苔素内酯10～50 mg、甘油50～150 ml、氮酮10～40 mL、有机硅DC-5211 0.3～1 mL加到已溶胀好的上述溶液，搅拌均匀并定容至500 mL；

6）生物杀菌剂的制备：将步骤4）中制备好的杀菌活性物质粗提液300～500 mL添加到步骤5）制备的凝胶中，充分搅拌，加蒸馏水定容至1000 mL，得到最终产品生物杀菌剂。

本发明所述的步骤2）中应用的LB液体培养基，其配比为：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g和酵母提取物5 g；经蒸馏水定容至1000 mL，调节pH 7.0～7.2，分装后121℃高压灭菌20 min后得到；步骤1）中应用的LB固体培养基需另外添加琼脂粉15 g。

本发明所述的步骤3）中应用的10% TSB培养基，其配比为：胰蛋白胨1.7 g、大豆蛋白胨0.3 g、氯化钠0.5 g、磷酸氢二钾0.25 g和葡萄糖0.25 g；经蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0～7.2，121℃高压灭菌20 min后得到。

本发明所述生物杀菌的使用方法为：在春季梨树发芽前后，选择晴朗天气，利用锋利的刮刀将梨树腐烂病斑进行彻底刮除，刮至枝干的木质部，然后将药剂涂抹其上，并完全覆盖刮除病斑后的伤口。另外，收集刮除的病斑碎片，进行集中焚烧处理。

本发明的优点在于：本发明所述生物杀菌剂是一种防控梨树腐烂病的新型生物杀菌剂，主要有效成分为HSAF。HSAF是一种含四元酸结构的大环内酰胺，分子式为C₂₉>39>6>2，具有高效、广谱的杀菌活性，具有保护和治疗作用。通过干扰真菌菌丝的极性生长，抑制产孢和孢子萌发，导致细胞结构发生质壁分离，降低其对环境胁迫的抵抗能力，从而影响病菌的生存、侵染和传播。

本发明所述生物杀菌剂中含有高分子成膜材料羧甲基纤维素钠，易于分散在水中形成澄明的胶状液，对热较稳定，无毒、无刺激性，是一种优良的水溶性凝胶剂。涂抹到刮治后的病疤上可以形成一层保护薄膜，耐风吹、日晒、雨雪冲刷而不易脱落，能使凝胶剂持久发挥药效，又能保护伤口减少水分蒸发，也能阻止腐烂病菌再次侵染。凝胶剂中加入了芸苔素内酯，这是一种高效、低毒、广谱性植物生长调节剂，能迅速促进细胞分裂，增强植物的抗逆性，促进伤口愈合。氮酮作为一种渗透剂，也能促进植物对药物的吸收，提高药效。有机硅DC-5211能够显著促进药剂对病原菌和病疤组织的渗透，提高病害防治效果，扩展药剂的持效期。

本发明所述生物杀菌剂在江苏、辽宁、甘肃、陕西、山东、新疆等地果园进行了多年田间试验。试验结果表明，该生物杀菌剂成膜保护时间达4个月以上，对梨树腐烂病治愈率高达85%以上，在果园使用过程中均未出现任何药害。该凝胶剂具有成膜效果好，渗透力强，药效期长，伤口愈合快，治愈率高，药养多效，安全实用等特点，是一种可有效替代化学杀菌剂的生物杀菌剂。

附图说明

图1为本发明人工接种条件下本发明所述生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果；

图2为本发明对梨树腐烂病病疤刮除与涂药处理；

图3为本发明的生物杀菌剂对梨树腐烂病田间防治效果。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。

本发明中所提及的产酶溶杆菌OH11菌株和杀菌活性物质HSAF均为专利CN201410823196.4中所公开的菌种及其代谢产物。若无特别说明，下述实施例中所用技术方法均为常规方法，下述实施例中所用试验材料，均为常规试剂材料。

实施例1：生物杀菌剂及其特性

一、生物杀菌剂制备

本实施例制备了如下7种基于杀菌活性物质HSAF粗提液的生物杀菌剂：

生物杀菌剂（1）组分为：杀菌活性物质粗提液300 mL、羧甲基纤维素纳30 g、芸苔素内酯25 mg、甘油150 mL、氮酮20 mL、有机硅DC-5211 0.6 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（2）组分为：杀菌活性物质粗提液300 mL、羧甲基纤维素纳40 g、芸苔素内酯25 mg、甘油50 mL、氮酮40 mL、有机硅DC-5211 1 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（3）组分为：杀菌活性物质粗提液400 mL、羧甲基纤维素纳30 g、芸苔素内酯50 mg、甘油100 mL、氮酮30 mL、有机硅DC-5211 0.3 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（4）组分为：杀菌活性物质粗提液400 mL、羧甲基纤维素纳30 g、芸苔素内酯50 mg、甘油100 mL、氮酮40 mL、有机硅DC-5211 1 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（5）组分为：杀菌活性物质粗提液500 mL、羧甲基纤维素纳30 g、芸苔素内酯25 mg、甘油100 mL、氮酮20 mL、有机硅DC-5211 0.3 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（6）组分为：杀菌活性物质粗提取液500 mL、羧甲基纤维素纳20 g、芸苔素内酯10 mg、甘油50 mL、氮酮40 mL、有机硅DC-5211 0.3 mL，加水补足1000 mL。

生物杀菌剂（7）组分为：杀菌活性物质粗提液500 mL、羧甲基纤维素纳30 g、芸苔素内酯10 mg、甘油100 mL、氮酮20 mL、有机硅DC-5211 0.6 mL，加水补足1000 mL。

上述生物杀菌剂按照下述方法制备：首先，将羧甲基纤维素钠缓慢加入250 mL纯水中，搅拌均匀后静置过夜，使其充分溶胀；依次将芸苔素内酯、甘油、氮酮、有机硅DC-5211加到已溶胀好的上述溶液，搅拌均匀并定容至500 mL；然后将杀菌活性物质HSAF粗提取液添加到上述凝胶液中，充分搅拌均匀，即为有效成分HSAF含量为24-40 μg/mL的生物杀菌凝胶剂。

二、生物杀菌剂的特性

将配置好的生物杀菌剂分别在3000 r/min离心30分钟，55℃保存7天，0℃保存15天，20℃保存90天，观察其粘稠度、涂展性以及是否分层。结果表明，在试验的条件和时间范围内HSAF凝胶剂表现出良好的涂展性和稳定性(表1)。

表1 生物杀菌剂的理化特性

实施例2：人工接种条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果

2013年4月3日，在江苏省南京市梨园内，梨树品种为砀山酥梨，选择3年生主枝，通过人工接种的方式，进行了生物杀菌剂（5）对梨树腐烂病的防治效果试验。生物杀菌剂（5）按照上述实施例1中的组分配比及方法制备。试验分5个处理，包括预防处理（先涂生物杀菌剂，再接种病原菌）、治疗处理1（先接种病原菌，再涂生物杀菌剂）、治疗处理2（先接种病原菌，再涂5%菌毒清水剂）、阳性对照（接种病原菌，未涂药）和阴性对照（接种水，用水涂抹）。病原菌接种是用打孔器在新鲜树皮上打孔，然后接种梨腐烂病菌菌丝块并保湿，每个处理包括10个枝条。处理7天和21天后分别调查平均病斑长度，21天时观察伤口愈合情况。结果表明本发明生物杀菌剂具有较好的预防和治疗效果，能够快速促进伤口愈合(见下表2和图1所示)。

表2 人工接种条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病防治效果

实施例3：大田发病条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果

2013年4月6日，在江苏丰县梨园进行了生物杀菌剂（5）对梨树腐烂病的田间防治试验，梨树品种为砀山酥梨，树龄在10-12年。生物杀菌剂（5）按照上述实施例1中的组分配比及方法制备。施药方法是采用病疤括除涂抹法，即用刀将病疤处树皮刮剥至木质部，然后将药剂涂抹其上并完全覆盖。试验以化学药剂3.315%甲硫·萘乙酸涂抹剂和2.12%腐殖酸铜水剂为对照药剂。2013年 9月24日进行病疤愈合（长出新鲜组织且无扩展的病疤）调查，在试验过程中同时观察药剂成膜、伤口愈合情况。结果表明，生物杀菌剂（5）对梨树腐烂病的综合防治效果与甲硫·萘乙酸相当，病疤愈合率高，成膜保护时间长，对伤口的愈合作用好（见表3与图2、3）。

表3 生物杀菌剂（5）对梨树腐烂病的田间防治效果（砀山酥梨）

实施例4：大田发病条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果

2014年4月14日，在辽宁营口梨园进行了生物杀菌剂（2）对梨树腐烂病的田间防治试验，梨树品种为巴梨，树龄6-7年。生物杀菌剂（2）按照上述实施例1中的组分配比及方法制备。施药方法是采用病疤括除涂抹法，即用刀将病疤处树皮刮剥至木质部，然后将药剂涂抹其上并完全覆盖。试验以化学药剂3.315%甲硫·萘乙酸涂抹剂和2.12%腐殖酸铜水剂为对照药剂，在2014年9月18日进行病疤愈合（长出新鲜组织且无扩展的病疤）调查，在试验过程中同时观察药剂成膜、伤口愈合情况。结果表明，生物杀菌剂（2）对梨树腐烂病的综合防治效果与甲硫·萘乙酸相当，病疤愈合率高，成膜保护时间长，对伤口的愈合作用好（见下表4）。

表4 生物杀菌剂（2）对梨树腐烂病的田间防治效果（巴梨）

实施例5：大田发病条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果

2014年4月7日，在甘肃景泰进行了生物杀菌剂（3）对梨树腐烂病的田间防治试验，梨树品种为黄冠梨，树龄7-8年。生物杀菌剂（3）按照上述实施例1中的组分配比及方法制备。施药方法是采用病疤括除涂抹法，即用刀将病疤处树皮刮剥至木质部，然后将药剂涂抹其上并完全覆盖。试验以化学药剂3.315%甲硫·萘乙酸涂抹剂和2.12%腐殖酸铜水剂为对照药剂，2014年9月27日进行病疤愈合（长出新鲜组织且无扩展的病疤）调查，在试验过程中同时观察药剂成膜、伤口愈合情况。结果表明，生物杀菌剂（3）对梨树腐烂病的综合防治效果与甲硫·萘乙酸相当，病疤愈合率高，成膜保护时间长，对伤口的愈合作用好（见表5）。

表5 生物杀菌剂（3）对梨树腐烂病的田间防治效果（黄冠梨）

实施例6：大田发病条件下生物杀菌剂对梨树腐烂病的防治效果

2015年4月20日，在新疆库尔勒进行了生物杀菌剂（7）对梨树腐烂病的田间防治试验，梨树品种为香梨，树龄在12-15年。生物杀菌剂（7）按照上述实施例1中的组分配比及方法制备。施药方法是采用病疤括除涂抹法，即用刀将病疤处树皮刮剥至木质部，然后将药剂涂抹其上并完全覆盖。试验以化学药剂3.315%甲硫·萘乙酸涂抹剂和2.12%腐殖酸铜水剂等化学药剂为对照，2015年9月11日进行病疤愈合（长出新鲜组织且无扩展的病疤）调查，在试验过程中同时观察药剂成膜、伤口愈合情况。结果表明，生物杀菌剂（7）对梨树腐烂病的综合防治效果好于对照药剂3.315%甲硫·萘乙酸和2.12%腐殖酸铜，病疤愈合率高，成膜保护时间长，对伤口的愈合作用好（见表6）。

表6生物杀菌剂（7）对梨树腐烂病的田间防治效果（黄冠梨）

实施例7：在配方中其他组分不变的情况下，对本发明的配方中的组分进行对比试验，其应用试验参考实施例5中的应用方法，得到的结果如下表所示：

由上表可知：在本发明设定的各组分含量范围内，生物杀菌剂3对梨树腐烂病的防治效果最好，病斑愈合率高达87.9%，明显高于组分含量不在本发明设定范围内的对比例4、对比例5和对比例6；由此可见，当杀菌物质中各组分的质量浓度发生改变时，部分组分含量过多或者过少，其最终产品的使用效果也会产生一定的下降。另外，在本发明的组分含量设定范围内，芸苔素内酯和有机硅DC-5211均能大幅提高生物杀菌剂对梨树腐烂病的防效，特别是同时添加芸苔素内酯和有机硅DC-5211的生物杀菌剂3防治梨树腐烂病的病斑愈合率高达87.9%，不添加芸苔素内酯和有机硅DC-5211的对比例3防治梨树腐烂病的病斑愈合率仅为66.7%。

需要说明的是，上述仅仅是本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的保护范围，在上述实施例的基础上所做出的任意组合或等同变换均属于本发明的保护范围。

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