一种用于奶牛健康养殖的复合乳酸菌微生态液体制剂

摘要

本发明属于饲用微生态制剂领域，具体涉及一种可用于奶牛健康养殖的乳酸菌复合微生态液体制剂。所述微生态液体制剂是由一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI‑01和一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI‑02经过共生耦合发酵和共价交联包埋技术制成而成，饲喂奶牛后能够很好的定殖于胃肠道粘膜，抑制病原菌滋生，改善肠道有益菌群，增强机体免疫力，可有效降低体细胞数，减少隐性乳房炎发病率，增加产奶量。

说明书

技术领域：

本发明属于饲用微生态制剂领域，具体涉及一种可用于奶牛健康养殖的乳酸菌复合微生态液体制剂。

背景技术：

早在70年代，欧美一些发达国家相继开发研制新型微生态制剂，并希望在一定程度上替代抗生素，并相继限制或禁止使用抗生素作为饲料添加剂。近些年，伴随国家对奶牛健康养殖的大力倡导，我国乳酸菌微生态制剂在我国饲料行业同样得到广泛应用。

申请号为201310465699.4的发明专利公布了一种中药微生态制剂及其制备方法，其成分包含：益生菌、中药组合物和酵母细胞壁多糖，益生菌包括凝结芽孢杆菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，中药组合物包括包括蒲公英、金银花、王不留行、连翘、丝瓜络、加吊藤。本发明中药组合物能提高益生菌活性，加强益生菌的定植制能力，同时中药组合物能有效预防和治疗奶牛的隐性乳房炎。

专利号为ZL 201410396851.2的中国发明专利公公布了一种防治奶牛隐性乳房炎中药微生态添加剂的制备方法,其按以下方法制备的,将杜仲叶、银杏叶、紫苏、白头翁、紫锥菊、葎草、虾壳、黄芪、甘草超微粉碎，加水武火煮沸，文火保温，冷却过滤，收集滤液，加入白糖煮沸，冷却降至常温后接种乳酸杆菌、红茶菌及酵母菌发酵所得微生态制剂，所得微生态制剂按比例给奶牛饮用。

但国内市场微生态制剂产品仍存在诸多缺陷。主要表现在：菌种资源有限，缺乏专业的菌种库，大部分菌株益生功能较差；以使用芽孢菌、酵母菌为主，而真正可以定植在肠道中的乳酸菌使用较少；产品主要以固体形式存在，而液体类微生态产品较少，目前市场上液体类微生态制剂性能不稳定，在常温条件下活菌数下降明显(一般贮存1个月后活菌死亡率＞10％)，使产品功能发挥受到限制，难以广泛应用。

奶牛健康养殖都在追求高产、稳产、优质、安全、效益最大化，因此奶牛肠道健康水平又是重中之重。研究表明奶牛肠道微生态环境的好坏和消化功能的高低成为奶牛是否健康及生产性能能否改善的限制性因素。草料中约有25％-30％ 的可消化物质和50％粗纤维在奶牛后肠道中消化吸收,在这一系列的消化过程中微生物起着重要作用。且微生态制剂可增强动物机体免疫力、维持肠道微生态平衡、产生有益代谢产物等多种功能，并具有无毒副作用、不残留、不污染环境等优点，从而达到降低牛奶体细胞数，预防和治疗奶牛隐性乳房炎和提高高品质牛奶产量的效果。因此微生态制剂具有较大潜力和广阔的发展前景。

发明内容：

为了实现上述目的，本发明提供一种用于奶牛健康养殖的复合乳酸菌微生态液体制剂，所述微生态液体制剂是由一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-01和一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-02经过共生耦合发酵和共价交联包埋技术制成而成，饲喂奶牛后能够很好的定植于胃肠道粘膜，抑制病原菌滋生，改善肠道有益菌群，增强机体免疫力，可有效降低体细胞数，减少隐性乳房炎发病率，增加产奶量。

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-01,该菌株已于2015年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC No.11930；该菌株能够很好的定植于胃肠道粘膜，抑制病原菌滋生，改善肠道有益菌群，增强机体免疫力；

所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SCI-02，该菌株已于2015年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC No.11931；该菌株可有效降解真菌毒素，具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快；所述SCI-02菌株由抑制植物致病真菌(寄生曲霉、黄曲霉、娄地青霉、番茄早疫、甜瓜枯萎、苹果炭疽、甜瓜疫霉)和肠道致病细菌(大肠杆菌、鼠伤沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单胞李斯特氏菌)筛选而来，高产苯乳酸等天然抑治致病菌物质和伽马氨基丁酸等促进奶牛采食量物质；

表1 L.plantarum SCI-02真菌抑制试验

表2 L.plantarum SCI-02致病细菌抑制试验

所述微生态液体制剂的具体制作工艺如下：

(1)菌种活化和培养：将冷冻保存的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化菌种；

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(2)共生耦合发酵：将活化好的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02按照各5％(v/v)的比例同时接种到经过灭菌的上述MRS培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，调节初始pH6.5，通过流加中和剂控制恒pH5.0-5.9发酵3-5小时后，再进行自然发酵，当pH低于4.5时，通过流加中和剂控制pH至5.0-5.9发酵3-5小时后，再进行自然发酵，如此循环，至乳酸菌活菌数达到1×10¹⁰CFU/mL以上，结束发酵。

(3)所述共价交联包埋技术具体工艺如下：

a.共价交联包埋过程中所添加物质除凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶外，其它均经过微波杀菌，微波杀菌温度为80-100℃，15-30min；

b.将共生耦合发酵后的液体通入氮气置换其中的空气，置换时间5min；

c.步骤(2)所得每1000L发酵液中加入30-40Kg蔗糖、15-25Kg糖蜜和5-15Kg酵母粉，并保持发酵罐搅拌桨50-100r/min的转速，在37-42℃条件下，作用10-30min以满足维持菌体微代谢的营养需求；

d.对上述处理的每1000L发酵液中加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂各0.3-1.0Kg，并保持发酵罐搅拌桨60-100r/min的转速，在37-42℃条件下，作用20-30min减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生过氧化物对菌体造成损伤；

e.对上述处理的每1000L发酵液中加入3-10Kg多孔淀粉,并保持发酵罐搅拌 桨50-90r/min的转速，在37℃条件下，作用30min,结束吸附包埋过程，此过程对发酵液中的菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境；

f.对上述处理的每1000L发酵液中加入5-20Kg脱脂乳，调节pH到5.0-5.9，保持恒温25-45℃，通过乳化机在进液口处调节处理后发酵液流量为10-50L/min，调节共价交联包埋混合液流量为0.02-0.2L/min，二者在乳化机中发生共价交联反应，且经过乳化机后，这几种物质充分反应形成稳定的菌悬液，将菌体包埋形成了非常稳定的微环境，结束共价交联包埋过程，制得复合乳酸菌微生态液体制剂。从而解决液体制剂中乳酸菌活菌死亡速度较快的问题；

所述共价交联包埋混合液是含有0.5-1.0％(m/m)凝乳酶和0.3-1.0％(m/m)谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

所述微生态制剂在预防及改善奶牛乳房炎中的应用，具体方法如下：

饲喂方案：饲喂复合微生态制剂每天早晚各1次，每次100mL，将100mL微生态液体制剂均匀喷洒饲料表面并混合均匀，饲喂患有乳房炎或健康的牛，连续饲喂10天。

有益效果：

本发明提供的微生态制剂具有下述积极效果：

(1)本发明复合微生态液体制剂可在25℃常温条件下,将发酵液活菌稳定贮存6个月，活菌存活率大于80％，显著提高产品贮藏过程稳定性。

(2)本发明复合微生态制剂与饲料混合均匀后，饲喂患有乳房炎的奶牛，每天饲喂100mL，每头牛每天早晚各1次，连续饲喂10天，可有效降低体细胞数，降低率为78.3％，提高牛奶品质。

(3)本发明复合微生态制剂与饲料混合均匀后，饲喂健康的奶牛，每天饲喂100mL，每头牛每天早晚各1次，连续饲喂10天，可有效增加奶牛平均单头日产奶量1.6Kg/天。

(4)本发明首先通过对发酵结束的液体中加入蔗糖、糖蜜和酵母粉，以满足维持菌体微代谢的营养需求；第二，加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂，减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生过氧化物对菌体造成损伤；第三，用多孔淀粉对其中的菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境；第四，加入脱脂乳，在乳化机进液口处将处理后液体与凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶发生共价交联反应，且经过乳化机后，这几种物质充分反应形成稳 定的菌悬液，将菌体包埋形成了非常稳定的微环境，从而解决液体制剂中乳酸菌活菌死亡速度较快的问题，提高产品贮藏过程稳定性。

附图说明：

图1复合微生态液体制剂对奶牛平均单头日产奶量的作用.

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：一种微生态液体制剂及其制备方法

复合乳酸菌微生态液体制剂，所述微生态液体制剂是由一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-01和一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-02经过共生耦合发酵和共价交联包埋技术制成而成，具体制备方法如下：

(1)菌种活化和培养：将冷冻保存的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20h，如此传代培养3次得到活化菌种；

MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min；

(2)共生耦合发酵：将活化好的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02按照各5％(v/v)的比例同时接种到存有经过灭菌的MRS培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，初始pH 6.5，通过流加25％(V/V)氨水作为中和剂控制恒pH5.5发酵3小时后，再进行自然发酵，当pH低于4.5时，通过流加25％(V/V)氨水作为中和剂控制pH至5.5发酵3h，再进行自然发酵，如此循环控制20小时，至乳酸菌活菌数达到1×10¹⁰CFU/mL以上，结束发酵。

(3)所述共价交联包埋技术具体工艺如下：

a.共价交联包埋过程中所添加物质除凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶外，其它均经过微波杀菌，微波杀菌温度为90℃，20min；

b.将共生耦合发酵后的液体通入氮气置换其中的空气，置换时间5min；

c.向发酵结束的液体中每1000L加入35Kg蔗糖、20Kg糖蜜和10Kg酵母粉，并保持发酵罐搅拌桨80r/min的转速，在37℃条件下，作用20min以满足维持菌 体微代谢的营养需求；

d.每1000L发酵液中加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂各0.8Kg，并保持发酵罐搅拌桨80r/min的转速，在37℃条件下，作用25min减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生过氧化物对菌体造成损伤；

e.每1000L发酵液加入8Kg多孔淀粉,并保持发酵罐搅拌桨80r/min的转速，在37℃条件下，作用30min,结束吸附包埋过程；

f.每1000L发酵液加入10Kg脱脂乳，调节pH到5.5，保持恒温37℃，通过乳化机在进液口处调节处理后发酵液流量为25L/min，调节共价交联包埋液(所述包埋液为含有0.7％(m/m)凝乳酶和0.7％(m/m)谷丙酰胺转氨酶的水溶液)流量为0.1L/min，共价交联包埋液在乳化机中发生共价交联反应，且经过乳化机后，这几种物质充分反应形成稳定的菌悬液，将菌体包埋形成了非常稳定的微环境，结束共价交联包埋过程，制得复合乳酸菌微生态液体制剂。

实施例2一种微生态液体制剂及其制备方法

复合乳酸菌微生态液体制剂，所述微生态液体制剂是由一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-01和一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-02经过共生耦合发酵和共价交联包埋技术制成而成，具体制备方法如下：

(1)菌种活化和培养：将冷冻保存的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18h，如此传代培养2次得到活化菌种；

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(2)共生耦合发酵：将活化好的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02按照各5％(v/v)的比例同时接种到存有经过灭菌的上述MRS培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，调节初始pH6.5，通过流加25％(V/V)氨水控制恒pH5.0发酵3小时后，再进行自然发酵，当pH低于4.5时，通过流加25％(V/V)氨水控制pH至5.0发酵3小时后，再进行自然发酵，如此循环，至乳酸菌活菌数达到1×10¹⁰CFU/mL以上，结束发酵。

(3)所述共价交联包埋技术具体工艺如下：

a.共价交联包埋过程中所添加物质除凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶外，其它均 经过微波杀菌，微波杀菌温度为80℃，15min；

b.将共生耦合发酵后的液体通入氮气置换其中的空气，置换时间5min；

c.每1000L发酵液中加入30Kg蔗糖、15Kg糖蜜和5Kg酵母粉，并保持发酵罐搅拌桨50r/min的转速，在40℃条件下，作用10min以满足维持菌体微代谢的营养需求；

d.对上述处理的每1000L发酵液中加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂各0.3Kg，并保持发酵罐搅拌桨60r/min的转速，在40℃条件下，作用20min减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生过氧化物对菌体造成损伤；

e.对上述处理的每1000L发酵液中加入3Kg多孔淀粉,并保持发酵罐搅拌桨50r/min的转速，在37℃条件下，作用30min,结束吸附包埋过程，此过程对发酵液中的菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境；

f.对上述处理的每1000L发酵液中加入5Kg脱脂乳，调节pH到5.0，保持恒温25℃，通过乳化机在进液口处调节处理后发酵液流量为10L/min，调节共价交联包埋混合液流量为0.02L/min，二者在乳化机中发生共价交联反应，且经过乳化机后，这几种物质充分反应形成稳定的菌悬液，将菌体包埋形成了非常稳定的微环境，结束共价交联包埋过程，制得复合乳酸菌微生态液体制剂。从而解决液体制剂中乳酸菌活菌死亡速度较快的问题；

所述共价交联包埋混合液是含有1.0％(m/m)凝乳酶和0.3％(m/m)谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

实施例3一种微生态液体制剂及其制备方法

复合乳酸菌微生态液体制剂，所述微生态液体制剂是由一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-01和一株植物乳杆菌(Lactobacillus.plantarum)SCI-02经过共生耦合发酵和共价交联包埋技术制成而成，具体制备方法如下：

(1)菌种活化和培养：将冷冻保存的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养22h，如此传代培养3次得到活化菌种；

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(2)共生耦合发酵：将活化好的植物乳杆菌SCI-01和植物乳杆菌SCI-02按 照各5％(v/v)的比例同时接种到经过灭菌的上述MRS培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，调节初始pH6.5，通过流加25％(V/V)氨水控制恒pH5.9发酵5小时后，再进行自然发酵，当pH低于4.5时，通过流加25％(V/V)氨水控制pH至5.9发酵5小时后，再进行自然发酵，如此循环，至乳酸菌活菌数达到1×10¹⁰CFU/mL以上，结束发酵。

(3)所述共价交联包埋技术具体工艺如下：

a.共价交联包埋过程中所添加物质除凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶外，其它均经过微波杀菌，微波杀菌温度为100℃，30min；

b.将共生耦合发酵后的液体通入氮气置换其中的空气，置换时间5min；

c.每1000L发酵液中加入40Kg蔗糖、25Kg糖蜜和15Kg酵母粉，并保持发酵罐搅拌桨100r/min的转速，在42℃条件下，作用30min以满足维持菌体微代谢的营养需求；

d.对上述处理的每1000L发酵液中加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂各1.0Kg，并保持发酵罐搅拌桨100r/min的转速，在42℃条件下，作用30min减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生过氧化物对菌体造成损伤；

e.对上述处理的每1000L发酵液中加入10Kg多孔淀粉,并保持发酵罐搅拌桨90r/min的转速，在37℃条件下，作用30min,结束吸附包埋过程，此过程对发酵液中的菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境；

f.对上述处理的每1000L发酵液中加入20Kg脱脂乳，调节pH到5.9，保持恒温45℃，通过乳化机在进液口处调节处理后发酵液流量为50L/min，调节共价交联包埋混合液流量为0.2L/min，二者在乳化机中发生共价交联反应，且经过乳化机后，这几种物质充分反应形成稳定的菌悬液，将菌体包埋形成了非常稳定的微环境，结束共价交联包埋过程，制得复合乳酸菌微生态液体制剂。从而解决液体制剂中乳酸菌活菌死亡速度较快的问题；

所述共价交联包埋混合液是含有0.5％(m/m)凝乳酶和1.0％(m/m)谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

实施例4：本发明复合微生态液体制剂常温贮存稳定性效果

将实施例1制备的微生态液体制剂在室温条件下，放置于密封性良好的无菌管中，分别在0天、30天、60天、90天、120天、150天和180天取样，进行活菌数检验，实验数据见表3。

表3 复合微生态液体制剂室温贮存稳定性情况

由表3实验结果可知，将该复合微生态液体制剂在常温条件下贮存180天，其活菌数可达到1.02×10¹⁰CFU/mL，其存活率为81.6％，说明该复合微生态液体制剂具有良好的贮存稳定性，具有很高的实际应用价值。

实施例5：本发明复合微生态制剂对乳房炎乳中体细胞的改善作用。

利用实施例1所得复合微生态制剂对浙江和内蒙古不同牧场，患有乳房炎的20头牛进行体细胞试验，饲喂微生态制剂前，利用DHI检测法测试牛乳中的体细胞数，饲喂微生态制剂每头牛每天早晚各喂1次，每次100mL，连续饲喂10天，然后利用DHI检测法再次测试牛乳中的体细胞数，将饲喂复合微生态制剂前后的体细胞数进行比较。试验结果见表4。

表4 饲喂复合微生态制剂前后牛乳中体细胞数变化情况(单位：万个/mL)

通过表4数据分析可知，20头试验牛中18头牛的体细胞数出现明显下降，仅有2头牛无效果。如果按体细胞数大于50万个/mL为临床型乳房炎，那么试验结果说明：其中8头牛被治愈，10头牛效果明显。10头牛试验前平均体细胞数为882.9万个/mL，试验后平均体细胞数为191.2万个/mL，下降了78.3％，表明饲喂复合 微生态制剂可有效改善奶牛乳房炎，降低牛乳中的体细胞。

实施例6：本发明复合微生态液体制剂对奶牛平均单头日产奶量的作用。

利用实施例1所得复合微生态液体制剂对内蒙古牧场的20头健康牛进行试验，饲喂微生态制剂每头牛每天早晚各喂1次，每次100mL，连续饲喂10天，然后记录每天的产奶重量，结果表明20头奶牛的平均单头日产奶量明显增加，试验结果见图1，说明此复合微生态制剂能够有效增加奶牛产奶量。

通过图1数据分析可知，20头奶牛经过7天饲喂复合微生态液体制剂后，奶牛平均单头日产奶量由初始的29.5Kg/天增加到31.1Kg/天，增加1.6Kg/天，其后3天平均单头日产奶量维持在31Kg/天左右，说明此复合微生态制剂在有增加奶牛产奶量方面具有显著效果。

通过图1数据分析可知，20头奶牛经过7天饲喂复合微生态液体制剂后，奶牛平均单头日产奶量由初始的29.5Kg/天增加到31.1Kg/天，增加1.6Kg/天，其后3天平均单头日产奶量维持在31Kg/天左右，说明此复合微生态制剂在有增加奶牛产奶量方面具有显著效果。