一株降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌的细菌菌株及其应用

摘要

本发明公开了一株具有降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌作用的细菌菌株绿针假单胞菌及其应用。本发明的菌株为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL‑8，微生物保藏号为CGMCC N

说明书

技术领域

本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株能将难溶性的无机磷分解成植物能吸收利用的速效磷，并能防治杨树腐烂病菌的菌株及其应用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。

背景技术

杨树是我国造林绿化、生态环境建设和社会经济发展的重要树种，其品种繁多，抗逆性、适应性强，林木在防风固沙、水土保持，农田保护和维护生态平衡等方面发挥着重要的作用。杨树也是我国栽培面积最大的用材树种，在世界各地亦有广泛分布。

近年来，中国杨树病害频发，年均发生面积超过660万亩，造成了巨大的经济和生态损失。其中杨树腐烂病是一种重要的枝干病害，是杨树的常见病和多发病，该病害在世界范围内广泛发生。杨树腐烂病菌发病轻时会影响树木生长，出现放叶晚、枝干枯干等现象；发病重时会造成杨树成片死亡，损失巨大。其主要病原菌为污黑腐皮壳菌(Valsa sordida Nit.)，其无性阶段为金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma(Pers.)Fr.)。

目前，杨树腐烂病的防治还是主要以化学防治和培育杨树抗病品种为主。采用抗病育种的方法虽然取得了一定的效果，但所培育出抗病品种却存在抗性退化、抗性低等问题。而化学防治长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，而且会污染环境，影响人类健康，破坏生态环境。随着可持续发展战略的实施，人们越来越意识到了使用化学农药的弊端。自20世纪80年代中期，在生物防治蓬勃发展的带动下，植物病害的生物防治作为了一种安全、有效的控制植物病害的新途径，渐渐被人们所重视，并成为热点研究方向。

假单胞菌是一类广泛分布于自然界中的革兰氏阴性菌，也是植物根际常见的微生物。其种类繁多、营养需求简单、繁殖快、竞争定殖力强。假单胞菌也是一种重要的拮抗菌资源，世界许多国家均有报道分离到的假单胞菌能防治植物病害，而且很多的假单胞菌不仅能通过产生一种或多种抗病活性物质，防治多种植物病害，还能分泌其他促生物质，促进植物生长。假单胞菌作为一种重要的根际植物促生拮抗菌，已被世界各国的研究者广泛研究。从杨树根际土壤中分离筛选获得的一株能高效抑制杨树腐烂病菌且具有解磷能力而促进植物生长，并能产生抑菌挥发物的拮抗菌，使生物防治应用范围更加广泛、使用更加灵活，这些对于杨树腐烂病的生物防治具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是针对杨树腐烂病防治中存在的植物病原菌产生抗药性的技术问题提供一株能将难溶性的无机磷分解为植物能吸收利用的速效磷，能产生HCN、蛋白酶和酯酶，对杨树腐烂病菌抑菌效果强，且能产生抑菌挥发物的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8。

本发明从杨树根际土壤中分离筛选获得的拮抗菌菌株Pseudomonas chlororaphisXZL-8能分解难溶性的无机磷、对杨树腐烂病菌金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)具有高效拮抗作用、并且还能产生挥发性抑菌物质HCN，抑制病原菌并能诱导植物产生抗性；同时还能产生蛋白酶和酯酶，降解病原真菌细胞壁，抑制或杀死病原菌；是一种解磷抗病的细菌菌株，应用本发明的拮抗菌Pseudomonaschlororaphis XZL-8的菌株解决了目前杨树腐烂病菌化学农药防治难，环境污染严重的问题。

本发明的目的之二是提供上述拮抗菌株Pseudomonas chlororaphis XZL-8在防治杨树腐烂病方面的用途，尤其是拮抗菌Pseudomonas chlororaphis XZL-8的菌株在防治杨树腐烂病等方面的多种应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的具有降解无机磷、拮抗腐烂病作用的拮抗菌为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，其微生物保藏号是：CGMCC NO.12555；分类命名是：Pseudomonas chlororaphis；保藏时间：2016年5月27日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

其中，所述无机磷为难溶性无机磷，优选为磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、过磷酸钙，进一步优选为磷酸钙；所述腐烂病为杨树腐烂病。

特别是，所述杨树腐烂病为由金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)所致腐烂病。

尤其是，所述杨树腐烂病菌选择导致杨树腐烂病的金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)。

本发明的拮抗菌菌株Pseudomonas chlororaphis XZL-8能将难溶性的无机磷分解为植物能吸收利用的速效磷、能高效防治杨树腐烂病菌，而且还能产生抑菌挥发物，产生的抑菌挥发物也能很好的抑制杨树腐烂病菌的生长。

本发明所述降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌的细菌菌株的形态特征：

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8为革兰氏阴性杆菌，菌体大小约0.8-1.0um×1.2-2.3um，无芽孢，有鞭毛，能运动。

菌体在KMB培养基平板上呈橘红色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整。

其中，每1000mL所述KMB培养基含有蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄>4>

本发明拮抗杨树腐烂病菌的细菌菌株Pseudomonas chlororaphis XZL-8的分离筛选方法：

1)取杨树根际新鲜土壤5g，装入盛有45mL无菌水的灭菌三角瓶中，于28℃下180rpm振荡30min，静置，得到的菌悬液(即为10^-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的土壤溶液)；然后用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl>

2)连续观察8d后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在LB培养基平板上进行划线纯化培养，获得多株杨树根际土壤细菌菌株，并在4℃下保存备用。

3)将杨树腐烂病菌(由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号CFCC89600)接种于马铃薯琼脂培养基PDA(每1000mL含有马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，pH 7.0-7.2)平板上，在28℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，并将新鲜的、直径为6mm的杨树腐烂病菌菌饼置于另一PDA平板中央，接着用接种环分别挑取少许步骤2)分离纯化后的土壤细菌，并在距离杨树腐烂病菌菌饼2.5cm处轻轻划线，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

4)培养7d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树腐烂病菌具有最强抑制效果，抑菌带最宽的土壤细菌菌株。

观察结果表明XZL-8菌株的抑菌效果最好，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度≥18mm。

本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的筛选及防治杨树腐烂病菌特性测定采用的培养基如下：

筛选培养基(LB平板培养基)成分：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂粉，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

LB液体培养基成分：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2。灭菌后冷却待用。

KMB液体培养基：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g KH₂PO₄，0.736g>4，去离子水调节总体积为1000ml，pH>

KMB固体培养基：：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g KH₂PO₄，0.736g>4，15g琼脂粉，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

NB液体培养基成分：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g NaCl，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2。灭菌后冷却待用。

马铃薯琼脂(PDA)平板培养基成分：200g马铃薯，20g葡萄糖，17g琼脂粉，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

TYB液体培养基成分：10g胰蛋白胨，5g酵母浸粉，3g牛肉膏，20g葡萄糖，0.5g KH₂PO₄，0.3g>4，0.07g>4，0.3g>4，0.3g柠檬酸，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

NBRIP培养基成分：10g葡萄糖，5g Ca₃(PO₄)₂，5g>2·6H₂O，0.25g>4·7H₂O，0.2g>4)₂SO₄，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

HCN检测培养基成分：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g K₂HPO₄，0.736gMgSO₄，4.5g甘氨酸，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

脱脂牛奶培养基：50g脱脂奶粉，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

Tween 80培养基：10g蛋白胨，5g NaCl，0.1g CaCl₂·2H₂O，10mL Tween80，9g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的培养特性及生理生化特性：

本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8生长温度范围为4℃～37℃，最适生长温度为30℃；生长pH范围为5.0～9.0，最适生长pH范围为6.0～7.0；能在0.2％～3％的NaCl浓度的NB培养基中生长；能氧化果糖、甘露醇、D-木糖产酸；能氧化葡萄糖产酸，但不产气，接触酶、氧化酶、氨合成呈阳性，甲基红、V-P实验呈阴性，不能水解淀粉、卵黄、苯丙氨酸，能利用柠檬酸盐，具有硝酸盐还原能力，不能产硫化氢，能液化明胶。

根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株XZL-8的形态特征、生理生化特性以及系统发育树分析鉴定菌株XZL-8为Pseudomonas属菌株，并确认本发明菌株为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8。

本发明还包括以上述能分解难溶性的无机磷且能高效防治杨树腐烂病的菌株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，微生物保藏号为CGMCC NO.12555的培养物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液、菌株培养过程中产生的挥发性代谢物。

以上所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，微生物保藏号为CGMCC NO.12555为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

本发明的细菌菌株还包括以上所述菌株的能解磷、拮抗杨树腐烂病的菌株Pseudomonas chlororaphis XZL-8的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物。

本发明的降解无机磷、拮抗杨树腐烂病的细菌菌株绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8在将难溶性的无机磷分解为植物能吸收利用的速效磷中的应用。

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8具有较强的将难溶性的无机磷分解为植物能吸收利用的速效磷的能力。

无机磷选择为难溶性无机磷，优选为磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝、过磷酸钙，进一步优选为磷酸钙。所述速效磷又称有效磷(Available phosphorous)，是土壤中可被植物吸收的磷组分，包括全部水溶性磷、部分吸附态磷及有机态磷。

本发明细菌菌株通过下述培养基培养用于降解难溶性无机磷处理：其中液体培养：10g葡萄糖，5g Ca₃(PO₄)₂，5g>2·6H₂O，0.25g>4·7H₂O，0.2g>4)₂SO₄，去离子水调节总体积为1000ml，pH>3(PO₄)₂，5g>2·6H₂O，0.25g>4·7H₂O，0.2gKCl，0.1g(NH₄)₂SO₄，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

将细菌菌株接种于含有难溶性无机磷的培养基中，进行培养，菌株在生长过程中分解难溶性无机磷，形成利于植物吸收利用的速效磷。

本发明的降解无机磷、拮抗杨树腐烂病菌的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8细菌菌株、菌株培养物在拮抗杨树腐烂病中的应用。

包括将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株进行培养，得到菌株培养物或发酵培养液、发酵培养液过滤后的过滤液；用所得的菌株培养物或发酵培养液、发酵培养液过滤后的过滤液抑制杨树腐烂病菌的生长。

所述杨树腐烂病菌选择导致杨树腐烂病的金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)。

本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株、菌株培养物、菌株菌液、菌株的发酵培养液及其过滤液和菌株培养过程中产生的挥发性代谢物抑制杨树腐烂病菌金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)生长，降解金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的细胞壁，抑制或杀死杨树腐烂病菌。

本发明的降解无机磷、拮抗杨树腐烂病的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8在产生HCN中的应用。

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8具有明显产生HCN的能力。

本发明细菌菌株通过下述培养基培养产生HCN：其中HCN检测液体培养：20g蛋白胨，10mL甘油，1.5g K₂HPO₄，0.736g>4，4.5g甘氨酸，去离子水调节总体积为1000mL，pH>2HPO₄，0.736g>4，4.5g甘氨酸，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

本发明细菌菌株在产生的挥发性代谢物HCN，用于拮抗杨树腐烂病和/或诱导植物对杨树腐烂病产生抗性中的应用

将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株进行培养，得到菌株的菌液、发酵培养液过滤后的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物；用所得的菌株的菌液、发酵培养液过滤后的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物抑制杨树腐烂病菌的生长。

本发明的降解无机磷、拮抗杨树腐烂病的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8在产生蛋白酶和酯酶中的应用。

绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8能明显产生蛋白酶和酯酶。

本发明细菌菌株通过下述培养基培养产生蛋白酶：其中检测产生蛋白酶的固体培养(脱脂牛奶培养基)：50g脱脂奶粉，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

本发明细菌菌株通过下述培养基培养产生酯酶：其中检测产生酯酶的固体培养(Tween 80培养基)：10g蛋白胨，5g NaCl，0.1gCaCl₂·2H₂O，10mL Tween 80，9g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH>

将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株进行培养，得到菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液过滤后的过滤液；用所得的菌株的菌液、发酵培养液过滤后的过滤液中产生蛋白酶、酯酶，抑制杨树腐烂病菌的生长，拮抗杨树腐烂病。

本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株生长过程中产生的蛋白酶、酯酶降解病原菌细胞壁，达到抑制或杀死病原菌的目的。

所述病原菌选择导致杨树腐烂病的金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)，即绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8细菌菌株生长过程中产生的蛋白酶、酯酶，降解病原菌金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的细胞壁，抑制或杀死病原菌金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)。

本发明的降解无机磷、拮抗杨树腐烂病的绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8在防治杨树腐烂病中的应用。

还包括绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液、生长过程中产生的挥发性代谢物(抑菌挥发物)在防治杨树腐烂病中的应用。

将降解无机磷、拮抗腐烂病菌的细菌菌株进行培养，得到菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液、培养液的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物；用所得的菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液、培养液的过滤液或培养过程中产生的挥发性代谢物抑制杨树腐烂病菌的生长。

又包括绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌液对杨树腐烂病病菌的离体防治。

其中，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的菌液、发酵培养液、培养液的过滤液及抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的平板抑制作用明显。菌株XZL-8的菌液在3d内对杨树腐烂病菌的平板抑制率达到100％，XZL-8的发酵培养液的过滤液在3d内对杨树腐烂病菌的平板抑制率随着培养时间的增加而增大，在第1d时抑制率达到91.81％，在第3d时抑制率达到93.55％。XZL-8在生长过程中产生的挥发性代谢物(抑菌挥发物)在48h内对杨树腐烂病的平板抑制率随着培养时间的增加而减小，在12h时，其抑制率达到100％，在48h时，其抑制率达到81.62％。

另外，绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的菌液对杨树腐烂病菌的离体枝条防治效果明显。XZL-8的菌液在不同的处理下对杨树腐烂病菌的离体叶片防治效果明显。其中，XZL-8的菌液和杨树腐烂病菌同时接种时离体枝条防治效果最好，其防治效果达到95.7％。

本发明的解磷、拮抗杨树腐烂病的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8能将难溶性的无机磷分解为植物能吸收利用的速效磷；能产生HCN、蛋白酶和酯酶，在防治杨树腐烂病方面的作用极为显著，对杨树腐烂病菌有很强的抑制作用，能明显抑制杨树腐烂病菌菌丝的生长，并且绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)XZL-8能产生抑菌挥发物，抑制杨树腐烂病菌菌丝的生长。绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8作为促生抗病的菌株，具有很好的促进植物生长和防治杨树腐烂病菌引起的植物病害的潜力，为防治由杨树腐烂病菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。

附图说明

图1为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8(微生物保藏号CGMCCNO.12555)菌株对杨树腐烂病菌抑制作用检测的对峙培养试验结果，其中A为没有接种Pseudomonas chlororaphis XZL-8，仅接种杨树腐烂病菌的生长情况；B为划线接种Pseudomonas chlororaphis XZL-8和杨树腐烂病菌的平板对峙培养生长情况结果。

图2为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8(微生物保藏号CGMCCNO.12555)的菌落形态图，其中A为Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株在KMB培养基上的培养形态；B为Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株革兰氏染色后的阴性观察结果(10×400)。

图3为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8基于16S rDNA序列的系统发育树；图中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。

图4为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8在NBRIP培养基平板上降解难溶性无机磷形成明显的透明圈的解磷效果图。

图5为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8产HCN的检测效果图，其中A无HCN产生的阴性对照；B为Pseudomonas chlororaphis XZL-8培养过程中产生HCN使培养皿盖上的滤纸片由黄色变成棕色。

图6为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8产蛋白酶和酯酶的检测效果图，其中A为Pseudomonas chlororaphis XZL-8在脱脂牛奶培养基平板上产生蛋白酶降解蛋白质形成明显的透明圈的效果图；B为Pseudomonas chlororaphisXZL-8在Tween 80培养基平板上产生酯酶使菌体周围产生模糊的晕圈的效果图。

图7为本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌液、发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌的平板抑制效果图，其中A为空白对照组平板培养图；B为Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌液对杨树腐烂病菌抑制效果图；C为Pseudomonas chlororaphis XZL-8发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌的平板抑制效果图。

图8为本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8培养过程中产生抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的平板抑制效果图，其中A为空白对照组平板培养图；B为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8抑菌挥发物对杨树腐烂病菌抑制效果图。

图9为本发明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8对杨树腐烂病的离体枝条防治效果图，其中A为只接种空白PDA块的对照；B为只接种杨树腐烂病菌的对照；C为同时接种XZL-8菌液和杨树腐烂病菌的离体枝条防治效果图；D为先接种XZL-8菌液，2d后再接种杨树腐烂病菌的离体枝条防治效果图；E为先接种杨树腐烂病菌，2d后再接种XZL-8菌液的离体枝条防治效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的分离、筛选及其鉴定

1、绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8的分离与筛选

本发明的菌株采集自北京市海淀区北京林业大学校园杨树根际土壤中。

1A)取杨树根际土壤5g，装入装有45mL无菌水的灭菌三角瓶中，置于摇床上，在28℃条件下180rpm振荡30min，静置得菌悬液(即为10^-1浓度的土壤稀释液)；然后取1mL菌悬液采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-3、10^-4、10^-5浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl>

1B)连续观察8d后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在LB培养基平板上进行划线纯化培养，获得多株土壤细菌菌株，并在4℃下保存备用。

1C)将杨树腐烂病菌(由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号CFCC89600)接种于马铃薯琼脂培养基PDA(每1000mL含有马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，pH 7.0-7.2)平板上，在25℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，并将新鲜的、直径为6mm的杨树腐烂病菌菌饼置于另一PDA平板中央，接着用接种环分别挑取少许步骤1B)分离纯化后的土壤细菌，并在距离杨树腐烂病菌菌饼2.5cm处轻轻划线，放置于培养箱中，25℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次。

1D)培养7d后观察并记录抑菌带的有无以及大小，选出对杨树腐烂病菌具有最强抑制效果的1株杨树土壤细菌菌株。

结果表明：对照组杨树腐烂病菌生长正常(图1A)，处理组即本发明筛选得到的Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株对杨树腐烂病菌抑菌效果最好(图1B)，抑菌带宽度最宽，抑菌带宽度达到≥18mm。

2、降解无机磷、拮抗病菌的菌株XZL-8的鉴定

参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社，2001:349-398)以及周德庆等人编著的《微生物学实验手册》(上海:科学技术出版社，1986:1-137)中介绍的方法以及16S rDNA对XZL-8菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。

2A)绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8在KMB培养基(每1000mL含有蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄>4>

2B)通过显微镜观察，表明Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌体大小约0.8-1.0um×1.2-2.3um之间，无芽孢，有鞭毛，革兰氏染色呈阴性，如图2B所示。

2C)生化实验结果表明，Pseudomonas chlororaphis XZL-8，好氧，接触酶、氧化酶、氨合成呈阳性，甲基红、V-P实验呈阴性，不能水解淀粉、卵黄、苯丙氨酸，能利用柠檬酸盐，具有糖酵解能力、硝酸盐还原能力，不能产硫化氢，能液化明胶。

依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株的形状、大小、其它生理生化反应进行检测，明确形态和基本生理生化特性。本发明的Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株的形态和基本生理生化特征如表1所示。

表1 Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株的形态和基本生理生化特性

项目结果项目结果菌体大小0.8-1.0um×1.2-2.3um明胶液化+菌落颜色橘红色，不透明柠檬酸盐利用+菌落形状光滑，中央隆起，边缘完整淀粉水解－菌体形态杆状硫化氢生成－鞭毛+苯丙氨酸脱氨酶测定－芽孢－形成吲哚－革兰氏染色－在pH＝5.7营养肉汤中生长+运动性+硝酸盐还原+接触酶反应+卵黄水解－氧化酶反应+利用葡萄糖产酸+厌氧生长－利用D-木糖产酸+甲基红反应－利用果糖产酸+V-P反应－利用甘露醇产酸+10％NaCl生长－氨合成+

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。

2D)挑取少量单菌落，放入盛有500uL无菌水的EP管中，100℃煮沸10min，然后离心(10000rpm、2min)，取上清，4℃保存，即为菌株XZL-8的基因组DNA。以菌株XZL-8的基因组DNA为模板，采用如下引物：

63f：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’

1387r：5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’

(参见Marchesi JR等，Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primersthat amplify genes coding for bacterial 16S rRNA，Applied and environmental micro-biology,1998,64(2):795-799)进行PCR扩增，扩增体系为20uL，含有10×TaqE缓冲液2uL、dNTP 1.6uL、正反向引物各1uL、DNA Taq聚合酶0.1uL、DNA模板1uL，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为20uL。扩增条件：94℃4min，94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min，最后系统温度降至4℃，反应结束。

PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，PCR扩增出约为1.3kb左右的产物片段，测序结果表明序列含有1200个碱基(SEQ ID NO：3)，具有序列表中序列3的核苷酸序列。将该序列经Chromas序列拼接软件校正，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，采用MEGA 5.0软件用邻解法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，进行系统发育分析，各支上的数字是1000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比。

通过在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现菌株XZL-8与Pseudomonas chlororaphis种的菌株的同源性最高。基于系统发育分析(见图3)，发现菌株XZL-8与菌株Pseudomonas chlororaphis DSM 50083(Z76673)亲缘性最近，并聚在同一分支中，而与其他菌株的亲缘性较远。结果表明该菌株为绿针假单胞菌。

结合菌株的形态特征及生理生化特性以及16S rDNA，鉴定菌株XZL-8为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。

本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC NO.12555。

实施例2绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8生物学特性的探究

1A)挑取一菌环(接种菌环)活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株，接种于装有100mL KMB液体培养基(每1000mL含有蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄>4>600值约为1.9；

1B)按照1％(V/V)的接种量将Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株种子液接种到装有40mL的不同盐(NaCl)浓度、pH值的NB液体培养基的100mL三角瓶中，于30℃，200rpm的条件下振荡培养2d后，分别吸取0.4mL的Pseudomonaschlororaphis XZL-8菌株种子液接种到装有40mL NB液体培养基的100mL的三角瓶中，分别置于不同温度，200rpm条件下振荡培养2d，然后将各个培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值，其中不同盐(NaCl)浓度、pH值的NB液体培养基的盐浓度、pH值如表2所示。

测定结果表明：Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株能在pH范围为5.0～9.0的条件下能够生长，在偏酸的条件下均生长良好，最适生长pH范围为6.0～7.0；菌株XZL-8在4℃～37℃的条件下能够生长，其中最适生长温度为30℃；在NaCl浓度为0.2％～3％的NB培养基中菌株XZL-8能够生长，最适生长NaCl浓度为1％～2％。菌株的生物学特性如表2所示。

表2 Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株的生物学特性

注：“+++”表示生长最好，“++”表示生长较好，“+”表示生长好，“-”不能生长。

实施例3本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株降解难溶性无机磷能力的测定

挑取一菌环活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，点种于倒有NBRIP培养基(每1000mL含有葡萄糖10g，Ca₃(PO₄)₂>2·6H₂O5g>4·7H₂O>4)₂SO₄>3(PO₄)₂)是否被分解而在平板上形成透明圈。有透明圈出现代表菌株能降解难溶性的无机磷(Ca₃(PO₄)₂)，没有透明圈出现则代表菌株不能降解难溶性的无机磷。

测定结果显示：绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株在NBRIP培养基平板上能降解难溶性的无机磷(Ca₃(PO₄)₂)而形成明显的透明圈(图4)，表明绿针假单胞菌(Pseudomonas>

实施例4本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株产HCN能力的测定

挑取一菌环活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，划线接种于倒有HCN检测培养基(每1000mL含有蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄1.5g，MgSO₄>

测定结果显示：培养拮抗菌Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株的培养皿的皿盖上的滤纸片由黄色变成红棕色(图5B)，而空白培养皿的皿盖上的滤纸片未变色(图5A)，表明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8能产生HCN，从而能抑制甚至杀死病原真菌并能诱导植物产生对病原菌的抗性。

实施例5本发明的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株产蛋白酶和酯酶能力的测定

1A)挑取一菌环活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，点种于倒有脱脂牛奶培养基(每1000mL含有脱脂奶粉50g，琼脂15g，pH 7.2-7.4)的平板中央，然后将平板置于30℃的恒温培养箱中倒置培养，分别于1、3、5、7d后观察菌落周围及平板上的脱脂牛奶是否被分解而呈透明。有透明圈出现代表菌株能产蛋白酶，将培养基中脱脂奶粉的蛋白质分解，没有透明圈出现则代表菌株不能产生蛋白酶，不能分解蛋白质。

1B)挑取一菌环活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，点种于倒有Tween 80培养基(每1000mL含有蛋白胨10g，NaCl 5g，CaCl₂·2H₂O0.1g，Tween>

测定结果显示：拮抗菌Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株在脱脂牛奶培养平板上能形成明显的透明圈(图6A)，同时在Tween 80培养基平板上的菌株XZL-8周围能观察到模糊的晕圈(图6B)，表明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8能产生蛋白酶和酯酶，说明绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8具有降解病原真菌细胞壁的能力，从而能抑制甚至杀死病原真菌。

实施例6绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌液和发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌的平板拮抗作用

1A)挑取一菌环活化后的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8，接种于装有100mL KMB液体培养基(每1000mL含有蛋白胨20g，甘油10mL，K₂HPO₄>4>600值约为1.9，该种子液即为平板拮抗作用测定所用的菌液，备用；

1B)按照1％(V/V)的接种量，将XZL-8菌株种子液接种到装有100mL TYB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，牛肉膏3g，葡萄糖20g，KH₂PO₄>4>4>4>

1C)分别吸取步骤1A)制备的XZL-8菌液、步骤1B)制备的XZL-8发酵培养液的过滤液各自混入到灭菌、冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中菌液、发酵培养液的过滤液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)菌饼，分别作为处理组Ⅰ和处理组Ⅱ；对照组为在PDA培养基中倒入与菌液、发酵培养液的过滤液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的杨树腐烂病菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，每天测量菌落直径，计算抑制率，直到对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上为止，其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑制率计算公式如下：

抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。

其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。

测定结果表明：绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌液和发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病都有很好的拮抗活性，菌落直径、抑制率测定结果如表3、图7所示；其中XZL-8菌液能完全抑制杨树腐烂病菌的生长(图7B)；XZL-8的发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病的平板抑制作用随着培养时间的增加而不断增大，在第1d时，XZL-8发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌的平板抑制率达到91.81％，到第3d时，XZL-8发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌的平板抑制率仍达到93.55％(图7C)。

表3 Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌液及发酵培养液的过滤液对杨树腐烂病菌平板拮抗活性

实施例7绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8挥发性代谢物对杨树腐烂病菌的平板拮抗作用

1A)挑取一菌环活化的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株，接种于装有100mL KMB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Pseudomonas chlororaphisXZL-8菌株种子液(即XZL-8菌液)备用，其中，Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株种子液的OD₆₀₀值约为1.9；

1B)菌株XZL-8挥发物抑菌活性的测定采用二分格培养皿法进行，具体方法如下：

先在二分格培养皿的一侧倒上病原菌杨树腐烂病菌Cytospora chrysosperma生长的PDA培养基，然后按照1％(V/V)的量将Pseudomonas chlororaphis XZL-8的菌株种子液加入到加热冷却至45℃的KMB固体培养基中，混匀倒在二分格培养皿的另一侧，作为拮抗菌处理组；对照组是在直接在二分格培养皿的另一侧倒上不混合XZL-8种子液的KMB固体培养基，然后放置于30℃恒温培养箱中培养1d；

1C)1d后再在每个二分格培养皿一边的PDA平板中央接上6mm新鲜的杨树腐烂病菌菌饼，用双层封口膜将二分格培养皿密封，倒置放置于25℃恒温培养箱中培养，每隔24h测量一次菌落直径，计算抑制率，直到对照组菌落直径达到培养皿直径一半的3/4以上为止。其中菌落直径采用十字交叉法测定，菌落直径法测抑制率计算公式如下：

抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。

其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。

测定结果表明：绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8生长过程中产生抑菌挥发性气体，该种抑菌挥发性气体能显著抑制杨树腐烂病菌，抑菌挥发性气体对杨树腐烂病有很好的拮抗活性，菌落生长直径、抑制率如表4、图8所示。培养24h前抑菌挥发性气体对杨树腐烂病菌的抑制率达到100％，培养24h后XZL-8在生长过程中产生的抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的抑制率随着培养时间的增加而缓慢降低。当培养时间为48h时，菌株ZSH-1抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的平板抑制率依然达到81.62％(图8B)，菌落生长直径明显比对照组(图8A)小。

表4 Pseudomonas chlororaphis XZL-8抑菌挥发物对杨树腐烂病菌的平板拮抗活性

实施例8绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8对杨树腐烂病菌的离体枝条防治试验

1A)挑取一菌环活化的绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8菌株，接种于装有100mL KMB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Pseudomonas chlororaphisXZL-8菌株种子液(即XZL-8菌液)备用，其中，Pseudomonas chlororaphis XZL-8菌株种子液的OD₆₀₀值约为1.9；

1B)在PDA平板上培养2d的杨树腐烂病菌菌落边缘和空白的PDA平板上，用打孔器分别打出直径为6mm的菌饼和空白PDA块，备用；

1C)选取直径1.5cm-2.5cm的杨树枝条剪成20cm的长度，用75％的酒精进行表面消毒，顶端封蜡，得到表面消毒后的杨树枝条备用；

1D)对1C)中的枝条中间部位进行烫伤接种(即对枝条烫伤后再接种)，利用步骤1A)制备的XZL-8菌液及步骤1B)的杨树腐烂病菌菌饼和空白PDA块接种枝条。共设5种接种处理：

处理Ⅰ为在枝条烫伤部位只接种空白PDA块，用蘸无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜将其固定，2d后解除保湿；处理Ⅱ为在枝条烫伤部位只接种杨树腐烂病菌菌饼，用蘸无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜将其固定，2d后解除保湿；处理Ⅲ为在枝条烫伤部位及周围涂抹XZL-8的菌液，同时再在烫伤部位接种杨树腐烂病菌菌饼，用蘸无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜将其固定，2d后解除保湿；处理Ⅳ为先在枝条烫伤部位及周围涂抹XZL-8的菌液，2d后再在烫伤部位接种杨树腐烂病菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜将其固定，2d后解除保湿；处理Ⅴ为先在枝条烫伤部位接种杨树腐烂病菌菌饼，用蘸无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜将其固定，2d后解除保湿，2d后再在烫伤部位及周围涂抹XZL-8的菌液。

每一处理组设12个枝条，其中以处理Ⅰ和处理Ⅱ作为对照组，最后每种处理的所有枝条均放置在底部垫有蘸有无菌水的脱脂棉的烧杯中水培，接种后将杨树枝条置于25℃保湿培养，28d后调查发病率、病级，并计算防治效果。以接种枝条出现病斑、病原菌子实体的早晚及数量作为发病程度的分级标准，具体0－4级的分级标准为：0－杨树枝条没有病斑和子实体出现；1－杨树枝条出现病斑或出现≤3个病原菌子实体；2－杨树枝条出现4－9个病原菌子实体；3－杨树枝条出现10－12个病原菌子实体；4－杨树枝条出现13个以上病原菌子实体。发病率、病情指数和防治效果的计算公式如下：

发病率＝发病的枝条总数/总的枝条数×100％；

病情指数＝[∑(病级×该病级的枝条数)/(最高病级×总的枝条数)]×100％；

防治效果＝(对照组枝条病情指数—处理组枝条病情指数)/对照组枝条病情指数×100％。

测定结果表明：绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)XZL-8对杨树腐烂病有很好的离体枝条防治效果(如表5，图9所示)。其中处理Ⅲ防治效果最好(图9C)，其枝条的发病率只有16.7％，而最后的防治效果达到95.7％；其次是处理Ⅳ的防治效果(图9D)，处理Ⅳ组的枝条的发病率均为25.0％，防治效果达到89.1％，处理Ⅴ的防治效果最差(图9E)，其枝条的发病率达到66.7％，但最后的防治效果也能达到65.3％。这说明菌株XZL-8用在前期预防和防治杨树腐烂病上作用明显。

表5 Pseudomonas chlororaphis XZL-8对杨树腐烂病菌的离体枝条防治效果

处理组发病率(％)病情指数防治效果(％)处理组Ⅰ00－处理组Ⅱ10095.8－处理组Ⅲ16.74.295.7处理组Ⅳ25.010.489.1处理组Ⅴ66.733.365.3