枯草芽孢杆菌SE201412及富有机硒菌剂

摘要

本发明涉及枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412，其保藏编号为CCTCC No.M 2015708，该菌株十分耐硒，能在含硒培养基中发酵产生有机硒含量达5000mg/L‑12000mg/L的发酵液，将该发酵液制备成富有机硒菌剂施用于处于生长期作物的液面，能够生产富硒农产品，且生产得到的农产品能够达到富有机硒粮、油、水果、蔬菜、干果的质量标准，且能够提高农产品的品质，产量，增强农作物抗病能力。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及枯草芽孢杆菌SE201412及富有机硒菌剂。

背景技术

硒是人类和动物必须的微量元素，缺硒可引40多种起多种疾病，目前研究表明，每天每人满足50微克硒，可使人健康长寿，而且通过食品补有机硒被认为是最安全，最方便的手段。

全世界75％的国家和地区缺硒少硒，我国缺硒省市达20多个，土壤中硒含量约0.03-0.1mg/kg，向土壤补硒是获得富硒农产品(食品)的一种有效办法。多年来，人们以富硒矿石、富硒煤矸石等原料，经粉碎、碱处理得到少部分(20％)可溶性无机硒，与氮、磷、钾、铜、锌、铁、镁、硼等无机盐或有机质复混成富硒肥料，或把硒制备成硒酸钠、亚硒酸钠，并以其溶液再与无机或有机肥料混配成富硒肥料，喷施到作物叶片或直接施到土壤中，这些富硒肥料虽然可以生产富硒农产品和富硒食品，但作物对肥料中无机硒的利用率仅10％-15％。

此外，一方面，富硒矿石、富硒煤矸石中伴生有超标的重金属鎘、铅、砷、汞、钒，使用富硒矿石、富硒煤矸石矿粉作为富硒肥料，易污染良田。另一方面，硒酸钠、亚硒酸钠价格每吨超过百万元，如果植物的总利用率仅为10％-15％，则生产富硒农产品费用太高。

农用微生物菌剂是一类有别于无机复合肥料、有机肥料的功能性微生物肥料。农用微生物菌剂利用有益微生物转化硒，把无机硒转化成有机硒，以提高农作物对硒利用率，进而提高农产品含硒量。

目前富硒微生物包括：富硒酵母、富硒食用菌、光合细菌等。专利CN200710010871发明的一种富硒联合固氮菌剂，在制备菌剂中加入可溶性无机硒，利用固氮菌将无机硒转化为有机硒，但其制剂中只采用固氮菌，仅具有单一固氮生理功能的富硒微生物肥料并作为作物根部使用的固体肥料，不能直接大量生产出水溶性有机硒。

专利CN102618469A，发明名称：一种荚膜红细菌及其应用，公开了一种荚膜红细菌AYGHJ-16，属光合细菌，利用光能对物质进行代谢，促进无机硒的转化和吸收，并有固氮和固碳作用，不能直接大量生产出水溶性有机硒。

专利100512666C，发明名称：一种含硒微生物饲料添加剂及其制备方法，公开了利用微生物活菌为红假单孢菌、纳豆菌芽孢杆菌和酵母菌进行液体发酵、固体发酵，实现无机硒的微生物转化，不能直接大量生产出水溶性有机硒。

施用水溶性有机硒是大幅度提高作物对硒利用率和生产富有机硒粮、油、水果、蔬菜、干果的重要途径。但是，目前市场生产的富硒酵母不能直接生产出水溶有机硒，而现有技术也没有生产出水溶有机硒超过3000mg/kg的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的缺陷和不足，本发明的发明人经过多年的大量反复筛选，得到了一株十分耐硒，且能分泌水溶性有机硒的菌株。

本发明的技术方案之一是：一种枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)SE201412，该菌已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC No.M2015708。

该菌株是从湖北恩施市盐业复烤厂发酵烟草废弃物中分离得到的，该菌株十分耐硒，能在无机硒高达30000mg/kg浓度的发酵液中正常生长，且能在发酵液中分泌水溶性有机硒5000mg/L-12000mg/L，其 中所述的水溶性有机硒为但不局限于硒氨基酸、硒低聚糖、硒肽中的一种或多种。

本发明的技术方案之二是：所述枯草芽孢杆菌SE201412在生产富有机硒菌剂中的应用。

本发明的技术方案之三是：一种富有机硒菌剂的制备方法，将枯草芽孢杆菌SE201412接种于含硒培养基中发酵培养，取发酵液即得。

所述含硒培养基可在本领域常用培养基的基础上加入亚硒酸钠得到。本发明优选的含硒培养基为：葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/L，亚硒酸钠0.3-30g/L，pH6.8-7.6。本发明进一步优选的含硒培养基为：葡萄糖6g/L，蔗糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，亚硒酸钠0.5-22g/L，pH7.2-7.6。

在大规模生产过程中，所述含硒培养基内还添加有消泡剂，所述消泡剂可根据本领域常识进行选择，本发明优选GPE-6330生物发酵专用消泡剂，所述消泡剂的用量优选为0.5-1.5g/L。

所述发酵培养的条件可依据本领域常识确定，本发明优选的发酵培养条件为：温度30-37℃，压力0.04-0.06MPa，搅拌转速160-220r/min，发酵液体积与通入空气体积比1：(0.2-0.4)。进一步优选的发酵培养条件为：温度32-35℃，压力0.05MPa，搅拌转速190-200r/min，发酵液体积与通入空气体积比1:0.3。

发酵培养采用的菌株是经过活化和扩大培养后得到的，所述活化和扩大培养可采用本领域常规技术手段实现。将扩大培养后的种子液接种进入含硒培养基中进行发酵培养，接种量为本领域常规接种量，优选为1-2.5％。

其中，所述活化采用的固体培养基为：葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/L，琼脂15-20g/L，pH6.8-7.6。优选为，葡萄糖6g/L，蔗糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠 4g/L，琼脂18g/L，pH7.2-7.6。

所述活化的具体操作为：将固体培养基加入试管内，灭菌后摆斜面，冷却凝固，将枯草芽孢杆菌SE201412接种在培养基上，于30-35℃培养试管斜面长满菌。

所述扩大培养采用的种子液培养基为：葡萄糖4-8g/L，蔗糖3-7g/L，牛肉膏3-7g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠2-6g/L，pH6.8-7.6。优选为，葡萄糖6g/L，蔗糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，pH7.2-7.6。

所述扩大培养的条件为：温度30-37℃，压力0.04-0.06MPa，搅拌转速160-220r/min，发酵液体积与通入空气体积比1：(0.2-0.4)，发酵时间12-24h。优选为，温度32-35℃，压力0.05MPa，搅拌转速190-200r/min，发酵液体积与通入空气体积比1:0.3，发酵时间14-18h。

在发酵制备富有机硒菌剂时，将菌株(或种子液)接入发酵培养基后，每隔2-4小时取发酵液样品，用酸度计测定pH并保持发酵液pH在6.8-7.6之间；同时，用可见光分光光度计测定细菌细胞浓度，当前后两次取样检测到的细菌细胞浓度在最大吸光值处没有明显增加时，即可认定发酵结束。

经过大量实验发现，在上述培养基和培养条件下，发酵时间为12-24h，优选为14-18h。

本发明所述菌株可在较大的亚硒酸钠范围内(0.3-30g/L)进行发酵，在工业化大生产过程中，为了充分确保发酵效果，一般而言，当发酵培养基内的亚硒酸钠用量超过1g/L时，采用分批加入亚硒酸钠进行发酵培养的方式。

优选地，在配制培养基的时候，先加入25-35％重量的亚硒酸钠，剩余的亚硒酸钠用水溶解后，在发酵过程中，分批逐渐加入发酵罐内。

进一步优选地，先将25-35％重量的亚硒酸钠加入起始发酵培养基中，然后将剩余的亚硒酸钠用其重量5-7倍的水溶解后，在发酵2-4h 后每隔1-1.5h向发酵体系中加入适量溶液。

所述适量没有特殊限制，以能够在发酵结束前加完，且最后一次添加后发酵尚未结束，能够继续发酵一段时间以消耗新加入的亚硒酸钠为宜。

再进一步优选地，先将30％重量的亚硒酸钠加入起始发酵培养基中，然后将剩余的亚硒酸钠用其重量6倍的水溶解后，在发酵3h后每隔1h向发酵体系中加入溶解液总体积1/10的溶液。

采用上述任意一种制备方法得到的发酵液，其有机硒含量为500mg/kg-30000mg/kg，其中溶于水的有机硒占总有机硒的60％-90％，其中10％-40％为微生物自身合成的有机硒，并经酶降解后可生产出完全溶于水的有机硒。此外，此种方法培养得到的发酵液，其内并不含有镉、铅、砷、汞等重金属，在作为菌肥应用于作物种植时，更加安全，不会对土壤造成重金属污染。

本发明的技术方案之四是：一种富有机硒菌剂，所述富有机硒菌剂是采用上述任意一种制备方法得到的。

具体地，发酵菌剂可以为液体或固体粉末，例如，可以直接取发酵液包装后制成液体菌剂；也可以将发酵液浓缩后再包装制成液体菌剂；或者将发酵液浓缩后经过冷冻干燥制成固体粉末菌剂。具体的制备方法可为：发酵培养结束后，采用固液离心机处理发酵液，取上清液；或浓缩所述上清液取浓缩液或将上清液浓缩、干燥后取干粉即得水溶性有机硒。对于离心后的沉淀物可采用如下方法回收利用：向沉淀物中加入纤维素酶酶解，离心酶解液，再将酶解沉淀物用蛋白酶酶解后离心，合并两次离心液，其内仍含有水溶性有机硒。也可将两次离心液浓缩得浓缩液；或将浓缩液冻干得干粉。

本发明所述的富有机硒菌剂不添加防腐剂即可长期保存，且能保持良好的功效。在具体的生产中，也可以向其中加入防腐剂以进一步延长其保存期限，所述防腐剂可选自E-聚赖氨酸、脱氢乙酸钠、丙 酸钙、双乙酸钠、乳酸钠、乳酸链球菌素中的一种或几种。防腐剂的加入量可依据本领域常识而定，本发明优选的防腐剂的加入质量占发酵液体积的0.1％-0.6％。

优选地，富有机硒菌剂中有机硒含量为300mg/kg-30000mg/kg。

优选地，富有机硒菌剂中枯草芽孢杆菌SE201412的活菌数为10-30亿/mL，进一步优选为15-25亿/mL。

本发明的技术方案之五是：富有机硒菌剂在作物种植中的应用。其中，所述作物优选为粮食作物、油料作物、水果、蔬菜、干果、木本油料中的任何一种。

具体地，所述粮食作物包括但不局限于水稻、玉米、小麦、荞麦、马铃薯、红薯；所述油料作物包括但不局限于大豆、芝麻、油菜、花生；所述水果包括但不局限于荔枝、龙眼、香蕉、橙子，橘子、莲雾、苹果、枣；所述蔬菜包括但不局限于白菜、萝卜、花菜、大蒜、葱、芹菜，所述干果包括但不局限于核桃、板栗；所述木本油料包括但不局限于油茶、油桐。

所述富有机硒菌剂的具体应用方式为：用水稀释所述富有机硒菌剂至有机硒含量为20mg/kg-50mg/kg，使用稀释后的富有机硒菌剂对生长期的作物叶面或经济林叶面喷施1-3次即可。

优选地，喷施2或3次时，喷施间隔时间为6-8天。

优选地，喷施量为10-50L/667M²。

采用本发明的富有机硒菌剂对生长期的作为进行干预，能够使得作物中总硒含量达到0.01-0.05mg/kg，其中有机硒达到80％-85％，达到富有机硒粮、油、水果、蔬菜、干果的质量标准，并能够提高农产品品质，产量和增强农作物抗病能力。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。

附图说明

图1为菌株SE201412显微镜(1000X)观察照片；

图2为菌株SE201412的平板菌落形态；

图3为菌株SE201412进化树。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明涉及到的原料或试剂均可市购获得；涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。本发明采用GB/T5009.93-2003《食品中硒的测定》、GB/T5009.11-2003《食品中总砷和无机砷的测定》、GB/T23942-2009化学试剂、电感耦合等离子体原子发射光谱法通则、杭州市农业标准规范DB3301检测发酵液中的有机硒和重金属含量。

其中，枯草芽孢杆菌SE201412的分离鉴定方法如下：

分离：从湖北恩施市盐业复烤厂发酵烟草废弃物中取材料1g，在无菌超净工作台上，用无菌水振荡稀释10^-1-10^-8，用移液管取0.1ml-0.2ml移入已灭菌倒有专用培养基(自来水1000ml，硒(由亚硒酸钠提供)5g、20g葡萄糖、15g蛋白胨、5g氯化钠、0.5g牛肉膏升、酵母膏0.25％、磷酸氢二钾0.1％、PH>

鉴定：经鉴定，该菌株形态或生理生化特征是：革兰氏染色阳性、细胞杆状、直径＜1um、如图1所示，形成芽孢，不膨大，无伴胞晶体；接触酶、氧化酶阳性，好氧生长，VP试验阳性，VP＜PH6试验阳性，VP＞PH7试验阴性，甲基红试验阴性，利用葡萄糖、木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇产酸；利用葡萄糖不产气；利用柠檬酸盐，还原硝酸盐，水解淀粉、液化明胶、分解酪素。在PH6、7％NaCl、70℃均生长。

根据细胞形态、生化实验结果和基因序列测定结果，该菌株SE201412鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis，已于2015年11月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国 武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号CCTCC No.M2015708。

该菌株的显微镜观察照片、平板菌落形态、进化树分别如图1、图2、图3所示。表1列出了该菌株16S rRNA基因测序BLAST结果，表2，表3列出了该菌株的生理生化特性

表1菌株SE201412 16S rRNA基因测序BLAST结果

表2菌株SE201412生理生化特性–酶活、碳源同化

+：阳性反应；-：阴性反应

表3菌株SE201412生理生化特性--利用碳源产酸

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性

实施例1富有机硒菌剂的制备方法

(1)菌株活化：将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4℃冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种取1环接种在试管复壮培养基上，接种100支试管种，置32℃培养箱中培养至SE201412试管斜面长满菌；

其中，所述复壮培养基为：6g葡萄糖、5g蔗糖、5g牛肉膏、10蛋白胨、4g氯化钠、18g琼脂、1000毫升水、PH7.4。

(2)扩大培养：取曝气的自来水100L装入200L发酵罐中，再加入600g葡萄糖、500g蔗糖、500g牛肉膏、1000g蛋白胨、400g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.1kg，用氢氧化钠调PH7.4，用伽马射线辐照机3kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将100支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度32℃，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1：0.3(v/v)。接入种子后，每隔3小时取样发酵液用酸度计测定PH(维持发酵液PH7.4)和用722可见光分光光度计测定细菌细胞浓度，发现发酵液12h细菌细胞浓度与15h细菌细胞浓度在最大吸光值处没有明显增增加，结束发酵，整个发酵时间15h。

(3)富硒菌剂的生产：在2吨的发酵罐中加入1吨曝气自来水，再加入6000g葡萄糖、5000g蔗糖、5000g牛肉膏、10000g蛋白胨、4000g氯化钠，纯度99％亚硒酸钠673.7g，GPE-6330生物发酵专用消泡剂1kg，调PH7.6。用伽马射线辐照机4kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，将扩大培养的100L枯草芽孢杆菌SE201412菌种子液在无菌条件下送入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度32℃，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1：0.3(v/v)。接入种子后，检测发酵液的pH值并维持发酵液的pH值为7.4，并采用分光光度计检测发酵进程，发酵15h结束发酵。

经检测，发酵液中有机硒含量为300mg/L。

实施例2富有机硒菌剂的制备方法

(1)菌株活化：将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4℃冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种取1环接种在试管复壮培养基上，接种200支试管种，置32℃培养箱中培养至SE201412试管斜面长满菌；

其中，所述复壮培养基为：12g葡萄糖、10g蔗糖、10g牛肉膏、20蛋白胨、8g氯化钠、36g琼脂、2000毫升水、PH7.6。

(2)扩大培养：取曝气的自来水200L装入0.5吨发酵罐中，再加入1200g葡萄糖、1000g蔗糖、1000g牛肉膏、2000g蛋白胨、800g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.2kg，调PH7.5，用伽马射线辐照机3kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将接种的200支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度35℃，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1：0.3(v/v)。接入种子后，检测发酵液的pH值并维持发酵液的pH值为7.6，并采用分光光度计检测发酵进程，发酵15h结束发酵。

(3)富硒菌剂的生产：在2吨的发酵罐中加入2吨曝气自来水，再加入12000g葡萄糖、10000g蔗糖、10000g牛肉膏、20000g蛋白胨、8000g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂2kg，纯度99％亚硒酸钠6666.7g，调PH7.6，用伽马射线辐照机3.5kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将扩大培养的200L种子液在无菌条件下倒入2吨发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度35℃，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1：0.3(v/v)，采用与步骤(2)相同方式检测pH值和发酵进程。

该实施例使用的亚硒酸钠总量为22444.6g，发酵罐里先加6666.7g亚硒酸钠，剩余的亚硒酸钠装脉冲输液瓶中用100kg无菌水溶解后，用伽马射线辐照机3.5kGy灭菌，在发酵3h后每隔1h均匀向罐内输送10kg亚硒酸钠溶液并向罐内加氢氧化钠溶液保持发酵液PH为7.5。

发酵罐培养15h结束发酵，管道输入储罐，用自动灌装机灌装，每瓶灌5L封盖后用伽马射线辐照机3kGy灭菌后存放1年。

经检测，发酵液中有机硒含量为5000mg/L。

实施例3富有机硒菌剂的制备方法

(1)菌株活化：将复壮培养基加入试管中，置伽马射线辐照机下，在2.5kGy条件下灭菌后，摆成斜面，冷却凝固；将4℃冷藏中的枯草芽孢杆菌SE201412试管菌种用接种环种取1环接种在试管复壮培养基上，接种50支试管种，置32℃培养箱中培养至SE201412试管斜面长满菌；

其中，所述复壮培养基为：3g葡萄糖、2.5g蔗糖、2.5g牛肉膏、5蛋白胨、2g氯化钠、9g琼脂、500毫升水、PH7.5。

(2)扩大培养：取曝气的自来水50L装入100L发酵罐中，再加入300g葡萄糖、250g蔗糖、250g牛肉膏、500g蛋白胨、200g氯化钠，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.05kg，调PH7.6，用伽马射 线辐照机4kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将接种的50支枯草芽孢杆菌SE201412复壮试管种接种接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度35℃，罐内压力0.045MPa，罐内空气流量1：0.35(v/v)，发酵罐培养15h，结束发酵。

(3)富硒菌剂的生产：在1吨的发酵罐中加入0.5吨水，再加入3000g葡萄糖、2500g蔗糖、2500g牛肉膏、5000g蛋白胨、2000g氯化钠，纯度99％亚硒酸钠3366.9g，GPE-6330生物发酵专用消泡剂0.5kg，用氢氧化钠调PH7.6，用伽马射线辐照机2kGy灭菌发酵罐通气管道、灭菌发酵罐罐体，灭菌发酵液，然后将扩大培养的50L枯草芽孢杆菌SE201412种子液在无菌条件下接入发酵罐中，设定发酵搅拌速度195转/分钟，罐内温度34℃，罐内压力0.05MPa，罐内空气流量1：0.3(v/v)。发酵罐培养15h，管道输入储罐，用自动灌装机灌装，每瓶灌5L封盖后置，用伽马射线辐照机2kGy灭菌后存放1年。

经检测，发酵液中有机硒含量为3000mg/L。

效果实验例一

实验方法：

(1)分别取有机硒含量200mg/kg富有机硒菌剂1.2L、2.4L、3.6L、4.8L，兑水25L依次稀释为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌剂，制备成四种不同硒含量的菌剂供水稻田备用，同时设定空白对照(纯水)；

(2)分别将四种菌剂以及纯水施用于处于抽穗开花生长期的水稻叶面上(施用一次)，施用量约为25L/667M²；

(3)大米收获后，测定大米硒含量，有机硒利用率等数值，结果列于表4：

表4发酵有机硒生产富有机硒大米效果

注：以上数据由国家富硒产品质量监督检验中心(恩施州产品质量监督检验所)检测提供；试验地土壤中不含硒。

效果实验例二

实验方法：

(1)分别取有机硒含量200mg/kg富有机硒菌剂1.2L、2.4L、3.6L、4.8L，兑水25L依次稀释为10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg的富硒菌剂，制备成四种不同硒含量的菌剂供苹果园备用；同时设定空白对照(纯水)；

(2)分别将四种菌剂及纯水施用于处于苹果开花初期树叶面上(施用一次)，施用量约为25L/667M²；

(3)苹果收获后，测定苹果硒含量，有机硒利用率等数值，结果列于表5：

表5发酵有机硒生产富有机硒苹果效果

注：以上数据由湖北民族学院生物示范中心开放平台检测提供；试验地土壤中不含硒。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。