一种牧草降解减容的方法

摘要

本发明公开了一种牧草降解减容的方法和一种用于牧草降解减容的真菌，所述方法包括以下步骤：取牧草自然风干，加入尿素，作为牧草基质；将白腐菌接种到PDA液体培养基中，28℃下培养4天，作为白腐菌母液；将真菌QD‑1接种到PDA液体培养基中，28℃下培养4天，作为真菌QD‑1母液；将所述白腐菌母液和真菌QD‑1母液接种到牧草基质上，进行发酵降解减容。本发明的方法较好的克服了牧草降解缓慢，降解过程不稳定，难以标准化的问题。

说明书

技术领域

本发明属于微生物学，具体地说，涉及一种牧草降解减容的方法和一株用于牧草降解减容的真菌。

背景技术

随着经济的发展，环境问题也越来越受人们的关注，特别是重金属(包括核素)对土壤和水体的污染在全球范围内受到极大的关注。对于重金属(包括核素)污染土壤和水体的植物修复技术研究已成为该领域的热点。植物修复技术属于原位修复技术，其成本低、易操作，与此同时植被还具有保护表土、减少侵蚀和水土流失的功效，可大面积应用于矿山的复垦、重金属污染场地的植被与景观修复。对于植物修复技术的研究，国内外的科研工作者主要集中在对超富积植物的筛选，然后人们常常忽略这样一个问题，污染较重的矿区往往并不具备良好的栽培环境，这就是说人们筛选得到的富积植物不一定能适应矿区的环境。这样如果所筛选的富积植物不能生长或者不能较好的生长达到一定的生长量，富积植物的修复作用就不能得到有效的体现。牧草一般具有较好的环境适应性与较强的生长能力，所以选择适当的牧草进行重金属(包括核素)污染土壤的植物修复具有良好的应用前景。因此对于收割后的牧草的处理就成了必须面对的问题。利用微生物对牧草进行降解减容具有温和、环保、安全等特性，是一种绿色环境友好型的处理方法。能够利用牧草的微生物种类繁多，真菌在其中起到重要的作用。在牧草的降解减容过程中由于牧草本身所含有的微生物往往对外接菌影响较大，从而导致较难实现牧草降解减容过程的标准化处理。在实际操作过程中可以利用堆肥的方式来实现牧草的减容，但堆肥与减容又具有不同的测重点。堆肥主要是要通过高温过程对堆肥有机质中所含的微生物病原菌、杂草种子杀死，避免因为 施用含微生物病原菌和杂草种子的有机肥而将微生物病原菌和杂草种子带入大田，而降解减容主要是体积的减少与质量的减少，即在减容的过程中不一定要求到达较高的温度，而更加注重在发酵过程中微生物对有机质的有效降解；在重金属污染土壤的植物修复过程中，通过微生物的有效降解减容可以较好地实现对收获后植物的处理，以及对植物所吸收重金属的浸出和浓缩，为后续对重金属的回收或者其他有效处理提供必要的条件。

在农业生产过程中会产生大量的秸秆，以往常见的处理措施是焚烧，但焚烧会对空气造成严重的污染，特别是在我国东北地区，焚烧秸秆已经成为造成雾霾的主要原因之一。秸秆的微生物降解减容法处理是一个温和、环保、安全的处理法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决现有牧草或秸秆的处理方法对环境污染较大的问题，提供一种牧草降解减容的方法及一株用于牧草降解减容的真菌。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株用于牧草降解减容的真菌，该菌株命名为真菌QD-1(Pterula sp.QD-1)，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12237，保藏日期为2016年3月24日。

本发明还公开了一种牧草降解减容的方法，包括以下步骤：

取牧草自然风干，加入尿素，作为牧草基质；

将白腐菌(white rot fungi)接种到PDA液体培养基中，28℃下培养4天，作为白腐菌母液；

将真菌QD-1(Pterula sp.QD-1)接种到另一PDA液体培养基中，28℃下培养4天，作为真菌QD-1母液；

将所述白腐菌母液和真菌QD-1母液接种到牧草基质上，进行发酵降解减容。

进一步的，所述真菌QD-1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12237，保藏日期为2016年3月24日。

进一步的，所述真菌QD-1母液的接种量为5-10％。

进一步的，所述牧草基质中尿素的含量为0.4-2.0g/Kg。

进一步的，所述白腐菌母液的接种量为5-10％。

进一步的，所述降解减容的温度为20-37℃。

优选的，所述降解减容温度为28℃。

进一步的，所述降解减容时所述牧草基质含水量为50％-70％。

进一步的，所述牧草基质含水量为60％。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明在牧草的降解减容过程中，利用QD-1菌株作为牧草降解减容过程的启动菌株：QD-1菌株本身是从自然条件下牧草降解的过程中分离得到的菌株，其在牧草基质中容易定殖。实验证明了真菌QD-1菌株不容易受牧草基质中其它微生物的影响，其能在牧草基质中迅速的生长成为牧草基质中的优势菌株；QD-1菌株在牧草基质中迅速生长，能迅速的启动牧草的降解，与此同时但堆肥到一定时间后，一般在20天左右时QD-1有一个明显的衰败过程。QD-1的衰败与溶解为其它微生物腾出生态位，有利于牧草在其它微生物的作用下进一步的降解；QD-1真菌的中性代谢特性可以使牧草基质保持较长时间的中性特性，这有利于微生物的综合作用，便于牧草基质的进一步降解。这不同于一般微生物降解牧草基质的产酸代谢类型。

2)本发明的方法较好的克服了牧草降解缓慢，降解过程不稳定，难以标准化的问题。

当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

本发明提供的用于牧草降解减容的真菌命名为真菌QD-1(Pterula sp.QD-1)，已于2016年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12237。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例

一、材料

草样：黑麦草(Lolium perenne)；真菌：实验室分离到的3株菌株，分别为白腐菌、里氏木霉(Trichoderma ressei)以及强化降解菌株QD-1。

黑麦草是具有较好土壤重金属污染修复应用潜能的牧草。白腐菌与里氏木霉分别为具有木质素和纤维素降解能力的菌株；同时也直接通过测定牧草基质降解率的简单方法分离了大量具有降解牧草能力的真菌，并从众多的菌株中筛选出1株真菌QD-1进行研究。菌株QD-1为选定的一株牧草降解减容强化启动菌株，其生长具有受牧草中固有微生物影响小的特性。其生长快，能在牧草前期的降解减容过程中迅速成为优势菌。小规模的牧草降解实验证明，该菌株利用牧草代谢类型为中性代谢，并且在牧草降解减容过程中期(中后期)该菌衰败溶解，为其他微生物对牧草降解减容进一步的作用提供了生态位。

二、降解减容条件研究

2.1三株真菌的共生长研究

将参试的三株真菌分别接种在同一含PDA固体培养基的培养皿中，28℃下培养2～4天，观察三株真菌的共培养情况。三株真菌彼此之间不存在明显的非接触抑制现象，表明三株真菌之间具有较好的共培养能力。

2.2牧草基质

将牧草剪成1～2cm长的小段，烘干至恒重，备用；接种母液的制备：将白腐菌、里氏木霉、强化降解菌株QD-1分别接种到PDA液体培养基中，28℃下培养4天，作为接种母液备用。

2.3不同菌株降解减容能力的比较

通过培养瓶发酵降解减容的方式进行，每个培养瓶中装干草4g，初始牧草发酵基质含水量为60％，牧草基质灭菌备用；实验共设计4组：(1)外 接白腐菌3mL；(2)外接里氏木霉3mL；(3)外接真菌QD-1 3mL；(4)未外接其他真菌的对照组，每个处理3个重复。28℃下培养14天后测定各个处理的失重，结果见表1。

表1不同菌株降解能力的比较

组别 失重/g 降解率/％ 对照 2.149±0.073 26.86^a白腐菌 2.169±0.230 27.11^aQD-1 2.260±0.067 28.24^ab里氏木霉 2.618±0.181 32.73^b

发酵14天后各个处理组的降解情况如表1所示。接种里氏木霉的处理组具有最大的降解率32.73％，比对照的降解率(26.86％)高了5.87个百分点，接种白腐菌的处理组具有最低的降解率27.11％，接种菌株QD-1组的降解率为28.24％。对实验数据进行显著性分析，结果表明接种里氏木霉能显著提高收割后牧草的降解率，接种里氏木霉处理组与接种白腐菌处理组差异显著，接种里氏木霉处理组与接种强启动菌株QD-1差异不显著。

2.4接种量与尿素含量的优化

在以QD-1为牧草降解减容快速启动菌的牧草降解减容体系中，对发酵减容过程中的外接真菌的接种量与尿素的添加量进行优化。实验过程中除选择了QD-1真菌和白腐菌外也选择了实验室保存的另外一株里氏木霉。实验通过培养瓶发酵的方式进行，每个培养瓶中装4g干草，发酵基质的初始含水量为60％。实验共设4个处理3个水平，即：(1)白腐菌接种量0.5mL、1.0mL、1.5mL；(2)里氏木霉接种量0.5mL、1.0mL、1.5mL；(3)真菌QD-1接种量0.5mL、1.0mL、1.5mL；(4)尿素添加量分别为0.004g、0.008g、0.016g。对4因素3水平进行正交实验设计，实验设计如表2所示。接种后28℃条件下培养30天后测定各个处理组的降解率。利用SPSS软件对实验相关数据比较均值的单因素ANOVA分析和一般线性模型下的多因素方差分析。

表2接种量与尿素含量的正交实验设计

在微生物对牧草的降解过程中，由于牧草自身的特性往往限制了微生物的降解效率。牧草中含量最为丰富的为纤维素与半纤维素，这些有机物质可以为微生物的生长提供必要的碳源。在降解的过程中适当的添加合适的氮源能有效调节微生物作用基质的C/N，这有利用加速微生物对牧草的降解。考虑到重金属和核素污染的特性环境，研究选择尿素作为易得到与易操作的外源氮源。研究进一步对发酵减容过程中的外接真菌的接种量与尿素的添加量进行优化。实验按照正交实验设计进行，培养30天后，对各个处理的牧草基质失重进行测定，测定结果如下表3所示。

表3不同处理组牧草失重统计

处理组 重复1(g) 重复2(g) 平均值 降解率/％ 1 1.592 1.638 1.615±0.033 40.38 2 1.638 1.439 1.539±0.141 38.48 3 1.589 1.626 1.608±0.026 40.20 4 1.645 1.473 1.559±0.122 38.98 5 1.397 1.353 1.375±0.031 34.38 6 1.357 1.448 1.403±0.064 35.08 7 1.372 1.610 1.491±0.168 37.28 8 1.755 1.664 1.710±0.064 42.75 9 1.556 1.340 1.448±0.153 36.20

从表3可知，处理组8具有最大的失重率42.75％，即：在白腐菌的接种量为1.5mL(15％)，里氏木霉的接种量为1.0mL(10％)，强化启动菌株QD-1的接种量为5.0mL(5％)，尿素为0.016g(1.6g/Kg)的条件下，培养30天具有最大的失重率。

利用SPSS软件对数据进行一般线性模型下的多因素方差分析。方差分析表如下表4所示，单因素统计表如表5所示。

表4数据的方差分析

来源 平方和 df 均方 F P 修正后模型 0.195^a9 0.022 1.886 0.192 A(白腐菌) 0.064 2 0.032 2.807 0.119 B(里氏木霉) 0.016 2 0.008 0.695 0.527 C(QD-1) 0.023 2 0.011 0.990 0.413 D(尿素) 0.086 2 0.043 3.763 0.070 重复 0.005 1 0.005 0.465 0.515 误差 0.092 8 0.011 总变差 42.276 18 总方差平方和 0.287 17

a.R²＝0.680(校正后R²＝0.319)

表5单因素统计量表

从表4可知，对于白腐菌的接种量之间F＝2.807，P＝0.119＞0.05，差异不显著；对于里氏木霉的接种量之间F＝0.695，P＝0.527＞0.05，差异不显著；对于QD-1的接种量之间F＝0.990，P＝0.413＞0.05，差异不显著；对于尿素的使用量之间F＝3.763，P＝0.070＞0.05，差异不显著。从分析的结果看各个因素对牧草的降解减容影响不同，其作用大小依次为：尿素＞白腐菌＞QD-1＞里氏木霉。根据单因素统计表(表5)可知，A1、B1、C1、D3的均值最大，即根据所得数据确定最优的牧草降解减容条件为白腐菌的接种量为5％， 里氏木霉的接种量为5％，强启动菌株QD-1的接种量为5％，尿素的施用量为1.6g/Kg。进一步对在有优化后的降解减容条件下对牧草基质的降解减容能力进行了验证，培养30d后牧草基质的失重率为45.60％。

鉴于尿素与白腐菌在牧草降解减容过程中重要作用，研究进一步地设计了实验进行验证。实验一共5个处理组，处理1：接种QD-1(10％)，处理2：接种白腐菌(10％)，处理3：接种QD-1(5％)和白腐菌(5％)，处理4：牧草基质自然接种(不人为接种)，处理5：牧草基质(不含尿素)自然接种(不人为接种)。接种后28℃条件下培养30天测定牧草的失重。基质：40％牧草，60％含水量(添加或者不添加1.6g/Kg尿素)。处理1、处理2、处理3和处理4的基质分别为在基本基质的基础上添加1.6g/kg的尿素的基质；处理5为基本基质，不含尿素。实验结果表明：处理3在含尿素的牧草基质中外接QD-1和白腐菌具有最高的失重率。在对未灭菌牧草基质进行降解处理时，为了保证外接真菌能较好的在基质中发挥作用，一般都需要较大的接种量，故在实验过程中对于真菌接种量的设计上以5％或者10％为参考值。

在实际的工程应用过程中，需要根据实际的具体情况对比参照得到的培养条件的参考值对培养条件的各个参数进行修正，以期能得到有效牧草快速降解减容结果。

三、强启动真菌QD-1的种属鉴定

采用18SrDNA-26SrDNA ITS序列分析的方法对参试的QD-1菌株进行了种属鉴定。PCR引物为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'与5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反应体系为25μL：Taq聚合酶(5U/μL)0.2μL；MgCl₂(25mmol/L)3μL；10×PCR>2O>

得到的ITS序列如SEQ ID NO:1所示。在NCBI上进行blast比对得到的结果与Pterula sp strain(DQ494693.1)具有最大的相似度(89％)。因此该 菌初步鉴定为Pterula sp.，命名为Pterula sp.strain QD-1，该菌株于2016年3月24日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12237。

强启动菌株QD-1在牧草降解过程中的应用能有效快速地启动牧草降解过程，使牧草降解过程具有较好的稳定性和可控性。QD-1菌株本身具有较好的牧草降解能力，且与其他牧草降解真菌具有较好的共培养能力，这有利于牧草降解过程中多种菌的综合作用。与此同时，在牧草降解减容过程中期或中后期该菌衰败溶解，为其他微生物对牧草降解减容进一步的作用提供了生态位。在牧草基质中外加一定量的尿素和接种一定量的强启动真菌QD-1与白腐菌能有效的促进牧草基质的降解，且在温和条件下能在30天实现40％以上的降解率。

本发明在牧草的降解减容过程中，利用QD-1菌株作为牧草降解减容过程的启动菌株：QD-1菌株本身是从自然条件下牧草降解的过程中分离得到的菌株，其在牧草基质中容易定殖。实验证明了真菌QD-1菌株不容易受牧草基质中其它微生物的影响，其能在牧草基质中迅速的生长成为牧草基质中的优势菌株；QD-1菌株在牧草基质中迅速生长，能迅速的启动牧草的降解，与此同时但堆肥到一定时间后，一般在20天左右时QD-1有一个明显的衰败过程。QD-1的衰败与溶解为其它微生物腾出生态位，有利于牧草在其它微生物的作用下进一步的降解；QD-1真菌的中性代谢特性可以使牧草基质保持较长时间的中性特性，这有利于微生物的综合作用，便于牧草基质的进一步降解。这不同于一般微生物降解牧草基质的产酸代谢类型。本方法较好的克服了牧草降解缓慢，降解过程不稳定，难以标准化的问题。

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并 非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。