HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺

摘要

本发明涉及一种HPLC法测定氯霉素‑苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，测定氯霉素‑苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯氧乙醇含量。选用高效液相色谱仪；流动相甲醇‑水75:75；双波长测定法：氯霉素检测波长278nm、苯氧乙醇检测波长265nm；通过对照品求得回归方程；外标法计算含量。结果：氯霉素和苯氧乙醇均在0.01‑100mg·ml‑1浓度范围有良好线性关系（r=0.9999）。本发明的有益效果是，用HPLC法测定测定氯霉素‑苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯氧乙醇含量，方法简便、快捷、可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及一种HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，即测量其中氯霉素和苯氧乙醇的含量。

背景技术

氯霉素-苯氧乙醇溶液又称氯苯溶液，是我院研制应用五十多年的外用制剂，主要外用清创消毒、清洗疮口、烧烫伤外创面，疗效确切，不良反应少，本品最大特点是清创杀菌外用不给患者带来疼痛感。因此作为制剂在本院配制，其有效成分氯毒素和苯氧乙醇的重量浓度均为0.1-10%，苯扎溴铵的浓度为0.1%-2%。报制剂批准文号时，该制剂氯毒素和苯氧乙醇含量测量采用紫外分光光度法测，现有因该药品中两主要成分氯霉素和苯氧乙醇测定时选择的最大吸收波长分别为278nm和265nm，本身就相互影响，各自有干扰吸收，又受药品中抑菌剂新洁尔灭的干扰（新洁尔灭是苯扎溴铵的水溶液），更加造成干扰结果不准确、重现性差、稳定性不好，同时采取的方法比较繁琐耗时长。

现有技术具体缺陷：1采用原荧光分析法时，为了去除药品中抑菌剂新洁尔灭的干扰，需要在药品配过程中等氯霉素和苯氧乙醇投料置好后，暂时不添加抑菌剂时取半成品，通过荧光分析法测定测定氯霉素和苯氧乙醇含量，符合后，再添新洁尔灭。造成配置过程不连续。2 原荧光分析法不能有效准确测定最后成品的含量，造成主管部门抽检时没法准确评价药品的质量。3 耗时长、干扰大、结果不准确。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种配置过程连续、检测含量准确、耗时短、抗干扰的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的HPLC法测定氯霉素-苯氧乙醇制剂中有效成分含量的工艺，其特征在于：包括以下步骤：

首先，配制对照品溶液：配制已知浓度并且浓度不同的氯霉素和苯氧乙醇的混合溶液，其中添加有一定数量的抑菌剂；

然后，对照品溶液的检测：采用高效液相色谱仪检测对照品吸收度，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X），进行绘制色谱图，X、Y均为已知，通过对照品求得回归方程。

最后，供试品溶液的检测：将供试品稀释到符合检测要求，采用高效液相色谱仪检测稀释液的吸收度，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度Y，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。

回归方程为，波长λmax=278nm的氯霉素吸收度Y=24.76X+0.4021，波长λmax=265nm苯氧乙醇吸收度Y=18.21X-0.1905。

氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为0.01-100mg/ml时，有良好的线性关系。

色谱条件：采用高效液相色谱仪，色谱柱为Acclccim120C18柱4.6mm×150mm，5μm，柱温为室温，检测波长为双波长，氯霉素检测波长278nm，苯氧乙醇检测波长265nm，进样量为10μl，流动相为甲醇-水体积比75:75，流速为0.5-2ml/min。

对照品溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的氯霉素对照品，100℃干燥至恒重的苯氧乙醇对照品，量取一定数量和浓度的抑菌剂新洁尔灭，共同置于一个棕色容量瓶中，加纯化水振摇溶解，再加至刻度度机械振动15min至溶解完全作为对照品储备液，精密量取一定体积的溶液至另一棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀，达到可检测浓度，作为对照品；

线性关系的确定：分别取上述配好的对照品贮备溶液，取不同体积的10份，分别放入一定容积的棕色容量瓶中，加流动相甲醇-水容积比75：75至刻度摇匀，分别按上述色谱条件进样检测，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，色谱图以峰面积吸收度为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X），进行绘制，吸收度Y为已知，通过对照品求得回归方程，波长λmax=278nm的氯霉素吸收度Y=24.76X+0.4021，波长λmax=265nm苯氧乙醇吸收度Y=18.21X-0.1905，线性关系指标r=0.9999，检测次数n=10次。

供试品溶液的检测：精密量取供试品溶液一定数量至一定容积的棕色容量瓶中，加纯化水至刻度摇匀溶解至完全，再取稀释一次后的一定数量的溶液至一定容积的另一棕色容量瓶中加流动相至刻度摇匀，作为供试品溶液；如果仍然达不到检测要求，则继续稀释；按上述色谱条件进样检测，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。

本发明的有益效果是，采取高效液相色谱法（HPLC）用于混合溶液中有效成分的含量测定，该方法简便、快捷、准确、稳定性好、重现性好，具体如下：1能够直接在最后成品测定药品中氯霉素和苯氧乙醇的含量，并且测量准确，耗时短。2 避免了氯霉素和苯氧乙醇在其比较临近各自最大吸收波长处278nm和265nm相互干扰。3 使不同批次间质量能保持一致和准确，提高药品质量安全、有效。4 便于推广药品进一步的开发。

附图说明

图1是 检测波长λ=278nm对照品图谱 ， 图2是 检测波长λ=265nm对照品图谱，图3是空白溶液色谱图。

具体实施方式

附图为本发明的一种具体实施例。

一、 仪器与试药

1.1仪器 Agr1ent1100高效液相色谱仪（配三元泵、二级管陈列检测仪、在线脱气机、色谱工作站），WP3-3000（Rs）型自动进样器，BP211D分析天平。

1.2试药氯霉素对照品（南京白敬辛制药有限责任公司，批号132104），苯氧乙醇对照品（瑞士Fluca公司，批号1431021），甲醇为色谱醇，水为超纯水。

1.3方法：选用Agr1ent1100高效液相色谱仪；WP3-3000（Rs）型自动进样器；流动相甲醇-水75:75；双波长测定法：氯霉素检测波长278nm、苯氧乙醇检测波长265nm；通过对照品求得回归方程；外标法计算含量。结果：氯霉素和苯氧乙醇均在0.01-100mg/ml浓度范围有良好线性关系（r=0.9999）。结论用HPLC法测定测定氯霉素-苯氧乙醇溶液中氯霉素和苯氧乙醇含量，方法简便、快捷、可靠。

二、 具体方法与结果

1 色谱条件 采用Agr1ent1100高效液相色谱仪，色谱柱为Acclccim120C18柱（4.6mm×150mm，5μm），柱温为室温，检测波长为双波长，氯霉素278nm，苯氧乙醇265nm，进样量为10μl，流动相为甲醇-水75:75（容量比），流速为0.5-2ml/min-1。

2 对照品溶液制备和检测 精密称取105℃干燥至恒重的氯霉素对照品50.00mg，量取2ml重量浓度为5%的新洁尔灭溶液，100℃干燥至恒重的苯氧乙醇对照品50.00mg，共同置于100ml棕色容量瓶中，加纯化水振摇溶解，再加至刻度度机械振动15min至溶解完全作为对照品储备液，精密量取10ml溶液至100ml棕色容量瓶中，加流动相至刻度摇匀作为对照品。

分别取上述配好的对照品贮备溶液2ml、4ml、5ml、6ml、8ml、10ml、13ml、15ml、17ml、20ml至20ml棕色容量瓶中，加流动相甲醇-水（容积比75：75）至刻度摇匀，得到的溶液氯霉素和苯氧乙醇重量浓度分别为0.005、0.01、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0325、0.0375、0.0425、0.05，单位mg/ml，氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为0.005~0.05mg·ml-1。分别按上述色谱条件进样检测，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度，以峰面积吸收度为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X），绘制色谱图，X、Y为已知，通过对照品求得回归方程，波长λmax=278nm的氯霉素吸收度Y=24.76X+0.4021，波长λmax=265nm苯氧乙醇吸收度Y=18.21X-0.1905，线性关系指标r=0.9999（检测次数n=10次）（r越接近1，正比关系越好）。

如果最初取的氯霉素和苯氧乙醇分别为500mg，新洁尔灭的数量与上述相同或不同，配制溶液，那么仍然要将溶液稀释为氯霉素和苯氧乙醇的重量浓度为0.05 mg/ml，相当于加10升水。以上述同样方法进行检测，得到上述相似的色谱图和相似的回归方程。如果最初取的氯霉素和苯氧乙醇是其它数目，配制溶液后要稀释到百分之一mg/ml的数量级的浓度来进行高效液相色谱仪的吸收度进行分析。

优选方案为，检测三次，分别测定波长278nm时氯霉素的吸收度，求相同浓度时的平均值，分别测定波长265nm苯氧乙醇吸收度，求相同浓度时的平均值，以峰面积吸收度平均值为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X），绘制色谱图，X、Y为已知，通过对照品求得回归方程，即为上面的回归方程。这样尽量减小了误差。

因此，氯霉素和苯氧乙醇的浓度范围为0.01-100mg/ml时，有良好的线性关系。

3 供试品溶液的检测、线性关系考察 精密量取供试品溶液 10ml至50ml棕色容量瓶中，加纯化水至刻度摇匀溶解至完全，再取5ml至25ml棕色容量瓶中加流动相至刻度摇匀，作为供试品溶液。如果仍然达不到检测要求，则继续稀释。按上述色谱条件进样检测，记录波长λmax=278nm时氯霉素的吸收度，和λmax=265nm时苯氧乙醇的吸收度Y，代入回归方程，根据Y计算X就可求得氯霉素和苯氧乙醇的含量。

4方法专属性

取氯霉素-苯氧乙醇对照品溶液，按上述色谱条件进样检测，分别测定波长278nm和265nm的吸收度，分离度为2.6良好，见图1和图2。不加对照品氯霉素和苯氧乙醇按原有处方规定配制空白溶液，按测定上述对照品溶液的方法进样检测，得到图3空白溶液图谱，在278nm和265nm处，无杂质吸收峰出现，方法专属性良好。

5精密度试验 取对照品溶液，按照上述色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，经过计算结果氯霉素峰面积RSD为0.52%，苯乙醇峰面积RSD为0.75%，说明精密度良好。

6重复性试验精密量取同一批号（20141212）氯苯溶液6份，按照供试品溶液配制方法分别进行稀释，按照上述相同色谱条件进样，按外标法计算各自含量，结果该批氯苯溶液产品氯霉素平均含量为标示量的99.65%，RSD为0.46%，苯氧乙醇平均含量为标示量的100.3%，RSD为0.62%，说明该测量方法重复性较好。

7稳定性试验分别将同一批（20141212）氯苯溶液按上述方法制成的供试品溶液分别在室温下放置0，1，3，5，7，9，15，24h后取样按上述相同的方法进行测试，测得氯霉素峰面积RSD为0.78%，苯氧乙醇峰面积RSD为0.47%，结果说明方法稳定性较好。

8供试品含量测定取5批氯苯溶液（20141103，20150115，20150312，20150314，20150328）按照上述供试品溶液制备方法进行稀释，作为待测样品。按照上述色谱条件和相同测试方法进行进样检测，按外标法代入上述回归方程计算5批样品含量，结果见表1。

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氯霉素-苯氧乙醇溶液（简称氯苯溶液）作为医院制剂，未有国家统一标准，我们作为研制单位，为了提高其检测质量标准，确保制剂质量稳定有效，参考《中国药典》2015年版及文献方法，对氯霉素和苯氧乙醇采取HPLC法检测，检测方法线性关系、稳定性、重复性和精密度均较好。据氯霉素和苯氧乙醇极性差别，参考氯霉素滴眼液质量标准（中国药典） 和文献方法，对流动相进行优选，确定适合的流动相甲醇-水（75:75）流动相进行分离，分离后的成分最大吸收波长分别为278nm和265nm，经过试验在任意单一波长278nm或265nm测定其含量时受干扰较大，吸收度差别不大，对计算结果的准确度和精密度不好，故采用双波长法，分别于各自最大吸收波长处测其吸收度，在278nm和265nm分别测定氯霉素和苯氧乙醇的吸收度较好，经过回归方程分别计算含量，结果稳定，方法简便。