特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用

摘要

本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用。本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极表面通过金‑巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该生物传感器利用功能化的DNA假结结构探针修饰的金电极与目标蛋白反应后，引起DNA假结结构构象改变，借助具有良好导电性的电信号分子MB，实现了对转录因子Nanog的灵敏检测，可以有效区分靶蛋白与其他对照蛋白。本方法操作简单，具有较高灵敏性和特异性，最小检测范围是170pM。

说明书

技术领域

本发明属于电化学传感器技术领域，具体涉及一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及制备方法和应用。

背景技术

细胞生物学的最有趣的问题之一是细胞多能性，细胞多能性受到严格的监管，调节异常可能会导致先天性缺陷、无法损伤修复甚至是癌症。Nanog是多能性相关的重要转录因子(transcription factors,TFs)之一，是一个近期引起大家极大兴趣的生物分子，它发挥功能是通过调控细胞增殖、死亡，决定细胞命运。已知，Nanog在大部分正常成年组织中不表达，但是高表达于胚胎干细胞和肿瘤细胞。研究已经揭示了Nanog在肿瘤中对于肿瘤细胞的干细胞样表型做出了贡献。升高的Nanog水平通常与肿瘤发生、细胞侵袭和转移有关。Nanog的强烈高表达通常预示了癌症恶性程度高、抗药性以及不良结局。因此，检测Nanog对于肿瘤评估、药物干预检测及临床预后具有重要意义。

传统的TF检测方法有如下几种：浓度检测(例如：western blots,immunohistochemistry or ELISA)，绑定活性检测(例如：electrophoresis mobility shift assay,ChIP)和转录水平检测(例如：qPCR)。这些方法各有优点，但是也存在着耗时长、操作复杂，测定结果容易出现假阴性等弊端。近年来，电化学技术不断发展，在生命科学领域发挥了十分重要的作用。电化学DNA(E-DNA)传感器具有操作简单、灵敏性高、成本低廉等优势。目前，研究人员已发展了一些检测TF的E-DNA传感器，他们都具有相当的灵敏性和特异性，给TF检测提供了潜在的替换方法。但是这些方法尽管具有这些优势，他们在实际应用中仍然存在一些缺陷。例如，大部分报道的E-DNA体系是signal-off型，signal-off的体系结构容易出现假阳性(例如探针降解)和相对小的检测范围。相反，signal-on型传感器则能够降低背景信号，具有明显优势。因此，近期有研究投入到了开发signal-on的TF电化学传感器。然而这些方法仍然存在DNA链设计复杂、结合效率低等不足。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种特异性DNA假结结构修饰的金电极及其制备方法和对Nanog的定量检测。

为了达到解决上述问题的目的，本发明采用如下机理：DNA假结结构包含两个茎环结构(茎环1和2)，茎环1形成了茎环2的一部分。DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatct。DNA假结结构3′端修饰了亚甲蓝氧化还原标签，5′端通过金-巯键修饰到电极表面(图1)。茎环1设计了Nanog结合序列。因为DNA假结结构具有相对刚性的结构，减少了氧化还原探针和电极的接触，信号背景将最小化。Nanog绑定后，由于Nanog分子相对较大，存在位阻效应，将打断茎环2，释放一个弹性的单链信号链，从而加强了电子传递效率，增加感应电流。

本发明的技术方案：

本发明所述一种特异性DNA假结结构修饰的金电极的表面通过金-巯键的作用自组装修饰有末端带亚甲蓝氧化还原标签、茎环1含Nanog结合序列的DNA假结结构，该DNA假结结构序列为：ttttgaccga ttatgtttag atcagttcat aatcggtctt tttttttttt ttctgatct。

本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极的制备方法由以下步骤构成：(1)将金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H₂SO₄:30％H₂O₂＝3:1)15分钟，以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗；(2)分别用1μm和0.3μm的氧化铝打磨，并且依次在乙醇和超纯水中超声10分钟，用氮气吹干；(3)取水虎鱼溶液滴加到金电极表面反应5分钟，用超纯水冲洗干净，吹干；(4)将处理过的金电极置于0.5M>2SO₄中，在0～1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为100mV/s,直至达到稳定；(5)金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在1mM巯基乙醇溶液中1h，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰的金电极。上述含DNA假结结构的电极修饰溶液为10mM>2,5mM>

本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极对转录因子Nanog的电化学检测方法，采用本发明所述特异性DNA假结结构修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，具体步骤为：

(1)取Nanog加入到10mM Tris–HCl,140mM NaCl,1mM MgCl₂,and>

(2)将经步骤(1)处理的工作电极放置于10mM Tris–HCl,PH 7.0缓冲液中，利用三电极系统，以方波伏安法(SWV)检测，并在5～25nM范围内，得到电流与Nanog浓度的线性关系曲线，其线性系数为0.99；

(3)利用步骤(2)所得标准曲线法对待测样进行分析检测，分析Nanog的含量。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述特异性DNA假结结构检测转录因子的金电极，其制作成本低廉、工艺简单、操作简易；

(2)本方法制备的电化学传感器能够成功检测转录因子Nanog，而且灵敏度、特异性高，具有很好的重复性；

(3)由于Nanog本身可以作为一种的检测靶标，用于细胞多能性分析、肿瘤耐药性及预后诊断，对疾病的临床检测提供技术支持，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明的方法原理图。

图2为不同浓度0～45nM Nanog存在情况下电化学信号的变化图。其中内嵌图为蛋白浓度在5～25nM范围内与电化学信号变化值之间的线性关系图。

图3修饰有DNA假结结构底物的金电极分别与空白、25nM血红蛋白、BSA、NF-κB、Nanog反应1h的电化学信号。

具体实施方式

实施例一：利用特异性DNA假结结构修饰的金电极检测不同浓度Nanog。

步骤一，将金电极(3.0mm直径)浸泡于水虎鱼溶液(H₂SO₄:30％H₂O₂＝3:1)15分钟，以消除吸附的物质，并用超纯水漂洗。接着，分别用1μm>

步骤二，将处理过的金电极置于0.5M>2SO₄中，在0～1.6V电压范围内进行伏安扫描，扫速为100mV/s,直至达到稳定；金电极用超纯水冲洗并吹干后，浸没在含DNA假结结构的电极修饰溶液中，室温下孵育1.5h，再浸没在1mM巯基乙醇溶液中1h，用超纯水冲洗，吹干，即得到DNA假结结构修饰的金电极。

步骤三，取Nanog加入到10mM Tris–HCl,140mM NaCl,1mM MgCl₂,and>

如图2所示，测得各溶液的峰电流随着Nanog浓度升高而升高，这是由于Nanog与DNA假结结构结合位点结合后，由于Nanog分子相对较大，绑定之后存在位阻效应，将打开茎环2，释放MB分子到电极表面，增强电信号。Nanog浓度在5–25nM与SWV峰值响应线性相关，最小检测范围是170pM，说明本发明的检测方法具有较高的灵敏性。

实施例二：生物传感器特异性研究。

为验证本发明检测Nanog的特异性，本发明用了不同的蛋白，如人血红蛋白,牛血清白蛋白(BSA)和转录因子NF-κB，按照实施例一的操作过程处理来验证该生物传感器的特异性。如图3所示，当没有Nanog或者用其他非特异蛋白替代时，则几乎没有峰值，只有当加入Nanog时，检测到明显峰信号。实验证实，此方法具有很好的特异性，本生物传感器检测具有高度选择性。