一种早期鉴定荔枝成花早、晚性状的分子标记及其应用

摘要

本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及一种早期鉴定荔枝成花早、晚性状的分子标记及其应用。一种早期鉴定荔枝成花早、晚性状的分子标记，其特征在于：所述的分子标记包括ZW1和ZW2；所述的分子标记ZW1是由Seq ID NO.1所示的上游引物和Seq ID NO.2所示的下游引物扩增得到；所述的分子标记ZW2是由Seq ID NO.3所示的上游引物和Seq ID NO.4所示的下游引物扩增得到。本发明提供的分子标记及其鉴定方法不仅筛选快速精确，可在幼苗阶段进行早期鉴定，对于荔枝特早花和特晚花种质资源育种创新具有重要意义，可显著缩短育种周期，大大节省人力、物力及土地，具有很高的社会经济价值和广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子遗传学技术领域，具体涉及一种决定荔枝成花早晚关键基因LcFT1启动子的分子标记及其该分子标记在荔枝熟期杂交育种中的应用。

背景技术

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)为无患子科荔枝属植物，起源于中国，因果实形、色、香、味俱佳和营养丰富而誉称“岭南果王”驰名中外。在中国荔枝种植已形成商业化大规模生产，产量居世界第一位。以往生产经验表明：早花品种(如‘三月红’)仅需要较短时间的低温就能够完成成花诱导(十月中下旬)，因而易成花，一般在2月左右开花，而晚花品种(如‘马贵荔’)必须经过整个冬天的低温才能完成成花诱导(一月上中旬)，因而难成花，一般在4月左右开花，两者相差两个多月(图1)。一般而言荔枝成花早晚与熟期早晚是相关联的，即早花品种是早熟品种，晚花品种是晚熟品种，当然不同品种果实发育的快慢也与熟期有关。

我国荔枝生产中一个重要问题是早、中、晚熟品种结构不够合理，品质一般的中熟品种所占比例过大，加上荔枝采后保鲜难，大部分在6月上旬至7月中旬集中上市，常造成价格低廉，果农丰产年而不丰收。故优化调整品种结构，增加特早熟和特晚熟品种比例，拉长鲜果产品供应期是产业健康发展的有效策略。然而生产中可供商品性栽培的特早熟和特晚熟优质荔枝品种很少。因此，开展荔枝特早熟和特晚熟种质资源的创新工作尤为重要。人工杂交育种选育特早熟和特晚熟品种已经成为一个主要的可行方法。然而荔枝童期长，使得人工杂交育种周期漫长，加上荔枝树体高大占地 多更加不利于人工杂交育种的开展，因而借助分子标记辅助育种尤为重要。

发明人通过人工设施栽培在夏季对荔枝开展反季节低温诱导实验，有力证明了低温是诱导荔枝成花的关键环境因子，对荔枝的叶片和顶芽开展局部低温诱导实验，证明了荔枝的叶片是感受低温诱导信号的关键器官，为此申请工作人员对低温处理0h、8h、32h、9d、27d、47d和61d的叶片开展RNA-Seq和小RNA高通量深度测序。其中通过RNA-Seq筛选到一个荔枝成花关键基因LcFT1，进一步研究证明低温是通过诱导荔枝叶片中LcFT1基因的表达进而导致其成花，并且LcFT1基因启动子存在两个类型，早花荔枝属于一个类型，晚花荔枝属于另一个类型，这种启动子差异导致诱导早、晚花荔枝LcFT1基因表达所需低温量不同，进而导致早花荔枝易成花并早于晚花荔枝(相关结果以Promoter difference of LcFT1isa leading cause of natural variation of flowering timing in different litchicultivars(Litchi chinensis Sonn.)发表在plant science,2015,241:128-137)。荔枝杂交试验还表明早花荔枝的LcFT1基因对于晚花荔枝的LcFT1基因是隐性基因，早、晚花荔枝杂交F₂代才可能出现早晚花性状的分离。

本发明首次根据早、晚花荔枝LcFT1基因启动子的差异开发一种用于早期鉴定荔枝成花早、晚性状的分子标记，用于早、晚花荔枝种质资源育种创新的早期鉴定。荔枝属于木本果树，树体高大，童期长，造成杂交育种周期长、占地面积大、费工费时。本发明提供的分子标记可显著缩短荔枝熟期杂交育种周期，节省人力、物力及土地。

发明内容

本发明目的之一是提供一种决定荔枝成花早晚关键基因LcFT1启动子的分子标记。

本发明目的之二是提供上述分子标记的检测方法。

本发明目的之三是提供上述分子标记在荔枝熟期杂交育种中的用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种早期鉴定荔枝成花早、晚性状的分子标记，该分子标记引物为ZW1和ZW2；

所述分子标记ZW1是根据早、晚花荔枝LcFT1基因启动子的差异(图2)开发的分子标记，所述分子标记ZW1是由Seq ID NO.1所示的核苷酸碱基序列和Seq ID NO.2所示的核苷酸碱基序列组成，其中Seq ID NO.1所示的核苷酸碱基序列是根据晚花荔枝LcFT1基因启动子的特异序列设计的上游引物(图3)，Seq ID NO.2所示的核苷酸碱基序列是根据晚花荔枝LcFT1基因启动子的特异序列设计的下游引物(图3)。

所述分子标记ZW1是由Seq ID NO.1所示的上游引物和Seq ID NO.2所示的下游引物扩增得到；

Seq ID NO.1：5’-TGATCAAAGAACATATAATATTTGGGCG-3’；

Seq ID NO.2：5’-TAAATAAAAATACTCATTATATATGAGC-3’。

所述分子标记ZW2是根据早、晚花荔枝LcFT1基因启动子的差异(图2)开发的分子标记，所述分子标记ZW2是由Seq ID NO.3所示的核苷酸碱基序列和Seq ID NO.4所示的核苷酸碱基序列组成，其中Seq ID NO.3所示的核苷酸碱基序列是根据早花荔枝LcFT1基因启动子的特异序列设计的上游引物(图3)，Seq ID NO.4所示的核苷酸碱基序列是根据早花荔枝LcFT1基因启动子的特异序列设计的下游引物(图3)。

所述分子标记ZW2是由Seq ID NO.3所示的上游引物和Seq ID NO.4所示的下游引物扩增得到；

Seq ID NO.3：5’-TTAATTAACATTAATTAATTAATTAATTAATTATAATTTGACACG-3’；

Seq ID NO.4：5’-GAGACACAATCTACAATGCACAGGAGTATGT-3’。

本发明所述的分子标记在荔枝育种中的用途是检测待检测荔枝品种和品系中早花型或晚花型LcFT1基因启动子，进而通过本发明分子标记在荔枝特 早花或特晚花杂交育种中能够早期鉴定早、晚花性状的荔枝，可显著缩短荔枝熟期杂交育种周期，节省人力物力及土地。

本发明还提供一种提取荔枝基因组DNA的方法，具体步骤如下：

(1)将叶片材料洗净，放入液氮冷冻的研钵中，加少许不溶性的PVP，加液氮研磨成粉末；

(2)取0.5g粉末转移至10mL离心管中并加入3mL 65℃水浴的CTAB提取液，剧烈震荡，65℃水浴30-60min，每隔10min轻轻震荡一次；

(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(V/V/V：25：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(4)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；

(5)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V：24：1)，轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2/3V预冷的异丙醇轻柔颠倒混匀，-20℃沉淀DNA 30min；

(6)12000rpm离心20min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀2次；

(7)加100-300μL TE缓冲液，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计检测其浓度与纯度，将最终得到的荔枝基因组DNA稀释到100ng/μL，放入-20℃冰箱备用。

用分子标记ZW1的标记引物对待检测荔枝基因组DNA进行PCR扩增，其标准PCR反应体系为25μL，具体组成如下：

PCR具体扩增程序如下：

用分子标记ZW2的标记引物对待检测荔枝基因组DNA进行PCR扩增，其标准PCR反应体系为25μL，具体组成如下：

PCR具体扩增程序如下：

以上PCR扩增产物加入4μL 6×Loading Buffer用1.8％琼脂糖胶(每100mL加入5μL GoldViewTM DNA染料)电泳分离，D2000DNALadder作为标准分子量对照，电泳电压120V，电流48mA，在凝胶成像系统中观察拍照。

本发明还提供了所述的分子标记ZW1用于筛选决定荔枝成花早晚主效基因LcFT1启动子的方法，包括以下步骤：以上述得到的荔枝基因组DNA为模板，以所述的引物ZW1进行PCR扩增，如果引物扩增出202bp的LcFT1基因启动子片段，说明待检测的荔枝为晚花型，LcFT1基因为纯合晚花型或为杂合晚花型，如果引物扩增不出202bp的LcFT1基因启动子片段，说明待检测的荔枝为早花型，并且LcFT1基因为纯合早花型。

本发明还提供了所述的分子标记ZW1和分子标记ZW2用于筛选决定荔枝成花早晚主效基因LcFT1启动子的方法，包括以下步骤：以上述得到的荔枝基因组DNA为模板，以所述的分子标记ZW1和分子标记ZW2进行PCR扩增，如果引物ZW1扩增出202bp的LcFT1基因启动子片段，引物ZW2扩增出218bp的LcFT1基因启动子片段，说明待检测的荔枝为晚花型，且LcFT1基因为杂合晚花型。如果引物ZW1扩增出202bp的LcFT1基因启动子片段，引物ZW2扩增不出218bp的LcFT1基因启动子片段，说明待检测的荔枝为晚花型，且LcFT1基因为纯合晚花型。

另外，本发明还提供了所述的分子标记在荔枝育种中的用途，其特征在于：在荔枝特早花或特晚花杂交育种中，通过所述的分子标记检测待测荔枝品种和品系LcFT1基因启动子类型为早花型或晚花型，进而能够在幼苗阶段早期鉴定待测荔枝种质资源的早、晚花性状。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了两个分子标记，用以检测决定荔枝成花早晚关键基因LcFT1启动子类型，进而鉴定早、晚花类型的荔枝。本发明提供的分子标记及其鉴定方法不仅筛选快速精确，不受环境影响，选择目标明确，对于木本果树的荔枝来说，可克服其童期长，可在幼苗阶段进行早期鉴定，对于荔枝 特早花和特晚花种质资源育种创新具有重要意义，可显著缩短育种周期，大大节省人力、物力及土地，具有很高的社会经济价值和广泛的应用前景。

(2)本发明提供的分子标记及鉴定方法能够在DNA水平上对目标性状进行选择，有助于建立早、晚花荔枝的分子标记辅助育种体系，便于快速、高通量的应用于荔枝熟期杂交实践中。

附图说明

图1为早、晚花荔枝开花时间对比图；

其中，A为早花品种(如‘三月红’)在2月左右开花；B为在相同的时间晚花品种(如‘马贵荔’)顶芽刚萌动。

图2为早、晚花荔枝LcFT1基因启动子序列比对图；

其中，‘Z’为早花荔枝LcFT1基因启动子序列；‘W’为晚花荔枝LcFT1基因启动子序列；黑色方框为LcFT1基因开放阅读框(ORF)起始密码子ATG。

图3为根据早、晚花荔枝LcFT1基因启动子序列差异，分子标记引物ZW1和ZW2设计示意图；

图4为分子标记引物ZW1和ZW2对16份早、晚花荔枝种质资源检测电泳图；

其中，M-DL2000；1-早花荔枝种质资源‘三月红’；2-早花荔枝种质资源‘991’；3-早花荔枝种质资源‘褐毛荔’；4-早花荔枝种质资源‘99112’；5-早花荔枝种质资源‘白糖罂’；6-早花荔枝种质资源‘D13’；7-早花荔枝种质资源‘99111’；8-早花荔枝种质资源‘99113’；9-晚花荔枝种质资源‘怀枝’；10-晚花荔枝种质资源‘马贵荔’；11-晚花荔枝种质资源‘糯米糍’；12-晚花荔枝种质资源‘陈紫’；13-晚花荔枝种质资源‘白叶’；14-晚花荔枝种质资源‘及弟’；15-晚花荔枝种质资源‘下番枝’；16-晚花荔枝种质资源‘桂味’。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：分子标记快速定性鉴定早、晚花荔枝种质资源的方法

(1)引物的设计

基于早、晚花荔枝LcFT1基因启动子序列的差异，并根据晚、早花荔枝LcFT1基因启动子序列的特异性设计2对上下游引物对(见表1)，分别得到分子标记ZW1和分子标记ZW2。

表1 引物信息

注：ZW1-1和ZW1-2引物对用来检测是否含有晚花荔枝LcFT1基因；ZW2-1和ZW2-2引物对用来检测是否含有早花荔枝LcFT1基因。

(2)待检测荔枝基因组DNA的提取

选取16个不同早、晚花荔枝种质资源健康的叶片(包括8个早花种质资 源和8个早花种质资源)，采用改良CTAB法提取待检测荔枝叶片基因组DNA，具体步骤如下：(1)将叶片材料洗净放入液氮冷冻的研钵中，加少许不溶性的PVP，加液氮研磨成粉末；(2)取0.5g粉末转移至10mL离心管中并加入3mL 65℃水浴的CTAB提取液，剧烈震荡，65℃水浴30-60min，每隔10min轻轻震荡一次；(3)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(V/V/V：25：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；(4)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V：24：1)轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min；(5)取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(V/V：24：1)，轻柔颠倒混匀，12000rpm离心10min，取上清，加入2/3V预冷的异丙醇轻柔颠倒混匀，-20℃沉淀DNA 30min；(6)12000rpm离心20min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀2次；(7)加100-300μL TE缓冲液，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，紫外分光光度计检测其浓度与纯度，最终将DNA稀释到100ng/μL，放入-20℃冰箱备用。

(3)PCR扩增筛选

用分子标记ZW1的标记引物对待检测荔枝样品的DNA进行PCR扩增，其标准PCR反应体系为25μL，具体组成如下：

PCR具体扩增程序如下：

用分子标记ZW2的标记引物对待检测荔枝样品的DNA进行PCR扩增，其标准PCR反应体系为25μL，具体组成如下：

PCR具体扩增程序如下：

(4)扩增DNA片段检测

以上PCR扩增产物加入4μL 6×Loading Buffer用1.8％琼脂糖胶(每100mL加入5μL GoldViewTM DNA染料)电泳分离，D2000DNA Ladder作为标准分子量对照，电泳电压120v，电流48mA，在凝胶成像系统中观察拍照。

(5)早、晚花荔枝种质资源的鉴定

分子标记引物ZW1用于鉴定16个不同早、晚花荔枝种质资源，如图4-A所示，1-8号荔枝种质资源，引物ZW1扩增不出202bp的LcFT1基因启动子 片段，表明1-8号为早花荔枝种质资源且为纯合型，而9-16号荔枝种质资源，引物ZW1扩增出202bp的LcFT1基因启动子片段，表明9-16号为晚花荔枝种质资源，为纯合型或杂合型。

为进一步确定9-16号晚花荔枝种质资源是纯合型还是杂合型，分子标记引物ZW2用于鉴定16个早、晚花荔枝种质资源，如图4-B所示，1-8号荔枝种质资源，引物ZW2扩增出218bp的LcFT1基因启动子片段，进一步表明1-8号为早花荔枝种质资源，而9-16号晚花荔枝种质资源，引物ZW2扩增不出218bp的LcFT1基因启动子片段，则表明9-16号为纯合型晚花荔枝种质资源。

经鉴定，荔枝种质资源1-8号为早花荔枝种质资源，荔枝种质资源9-16号为纯合型晚花荔枝种质资源，实验结果与田间植株开花早、晚性状观察结果一致，表明分子标记的高准确性。