抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列及其抗卵巢癌增殖和转移的用途

摘要

本发明公开了抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列及其抗卵巢癌增殖和转移的用途，属于靶向基因药物研发与细胞生物学技术领域。这两对siRNA均能够在卵巢癌细胞株中与PARD6A基因的mRNA结合，有效的干扰它的转录后翻译，从而抑制细胞的增殖活性及吸附能力，达到控制卵巢癌细胞生长和转移及治疗卵巢癌的目的。本发明的两对siRNA有望用于制备高效、特异性、副作用小的抗卵巢癌药物。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体涉及沉默分离缺陷蛋白6家族细胞极性调节因子阿尔法的编码基因(Par-6Family Cell Polarity Regulator Alpha,PARD6A)的小干扰核糖核酸(Small interfering RNA,siRNA)序列及其在抑制卵巢癌生长、增殖和转移等方面的用途。

背景技术

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，其发病率在女性生殖恶性肿瘤中位居第二，且其死亡率在妇科肿瘤中高居榜首,是妇科恶性肿瘤中最致命的一种。根据2012年全球癌症数据统计，在全球范围内，每年约有20万人被诊断为卵巢癌，12.5万人死于此病。由于卵巢深居盆腔，早期症状很不明显，患者难以察觉，同时又缺乏有效的普查和早期诊断方法，70％～80％患者就诊时已经处于中晚期，病灶通常不再仅仅局限于卵巢，而是扩散到了腹腔其它器官，治疗效果及预后均极差，5年生存率低于20％。

卵巢癌因病理类型不同而治疗方案不同，但传统治疗手段一般用手术治疗联合化疗等进行综合治疗，但治疗效果并不尽如人意，且大多数病人的卵巢癌都会复发，而复发的卵巢癌大都对多种化疗药物产生抗性，故而缺乏有效的治疗方法和手段，寻求新的方法已成为该领域亟待解决的重要课题。大量的研究发现卵巢癌的高发病率和高死亡率的主要原因是恶性肿瘤的无限增殖和转移，因此寻找能够有效抑制卵巢癌细胞增殖和转移的方法，是提高卵巢癌患者生存率的关键。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，近年来该技术已被广泛用于探索基因功能及恶性肿瘤的基因治疗领域。

分离缺陷蛋白6阿尔法(PAR6α，编码基因PARD6A)属于分离缺陷蛋白6(PAR6)家族，是一种重要的细胞极性蛋白，位于细胞前角质或上皮角质。目前研究表明，PAR6α蛋白在细胞极性的控制、细胞间紧密连接的形成、细胞不对称分裂、上皮间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)及肿瘤发生与进展等一系列生理与病理学过程中起关键作用。如在肿瘤的发生过程中，PAR6α蛋白可通过转化生长因子-β(TGFβ)在丝氨酸345上依赖的磷酸化，导致Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1,Smurf1)介导的大鼠肉瘤蛋白RAS同源家族成员A蛋白(RhoA蛋白)降解，从而引起EMT现象；或被α蛋白激酶C(αPKC)磷酸化，通过表皮生长因子受体2(ErbB2)激活，与ErbB2受体和αPKC形成复合物，最终导致EMT以及肿瘤的发生。与此同时，也有文献指出以siRNA干扰PARD6A基因的表达，以及过量表达Smurf1和RhoA会阻碍EMT过程，进而达到抑制肿瘤生长的作用。

到目前为止，PAR6α蛋白主要是作为细胞极化和细胞不对称分裂的一个重要的分子支架蛋白来研究，但是也有少量文章显示了PAR6α的表达影响着某些肿瘤细胞的增殖、吸附、细胞的极化和不对称分裂等。肿瘤细胞的增殖能力直接影响肿瘤的大小；吸附能力在肿瘤的转移中起重要作用：包括从其原发灶的解吸附开始转移与借从连续的粘附基质和解除粘附中获得移动的牵引力移动；而细胞的极化对细胞分化、细胞迁移、细胞质分裂、以及组织器官的形成等众多生物学过程起着关键性的作用。

因此，PAR6α有望成为包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的基因治疗靶点。但是目前还没有应用RNA干扰技术，以小分子RNA为靶向药物，有针对性地对PARD6A基因的转录后表达进行干扰，从而达到抑制卵巢癌细胞增殖和转移效果的专利发表。

发明内容

本发明通过用设计、实验筛选出的两对siRNA(分别以PAR1，PAR2命名)沉默PARD6A基因，验证其对人卵巢癌细胞株A2780的细胞增殖活性、吸附能力的影响，来判断沉默PARD6A基因的siRNA序列的特异性、靶向性，并验证其在抑制卵巢癌生长、增殖和转移等方面的用途。

抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列，为下列两种序列中的任意一种或一种以上：

PAR1：5′-CCAACAGCCAUAACCUCAUTT-3′/5′-AUGAGGUUAUGGCUGUUGGTT-3′

PAR2：5′-GGGCUUCUACAUCCGAGAUTT-3′/5′-AUCUCGGAUGUAGAAGCCCTT-3′

上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，可有效地沉默卵巢癌细胞中的PARD6A基因，使该基因mRNA和蛋白质表达显著降低，从而达到治疗卵巢癌的目的。

上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，,其特征在于可有效地抑制卵巢癌细胞的增殖活性及吸附能力。

上述的抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列的用途，用于制备抑制卵巢癌细胞生长和肿瘤转移的药物。

通过细胞增殖实验表明PAR1和PAR2干扰PARD6A基因的表达后可显著抑制卵巢癌A2780细胞的增殖活性；吸附实验表明这两对siRNA均能抑制A2780细胞的吸附能力。从而证明通过利用设计筛选的两对siRNA通过抑制PARD6A基因的表达，可对卵巢癌细胞株A2780的增殖、吸附产生显著影响，进而抑制肿瘤的生长和转移。因此，应用RNAi技术，以小干扰RNA(siRNA)为靶向药物，有针对性地对PARD6A基因的转录后表达进行干扰，在今后的卵巢癌治疗研究中的具有潜在应用价值。

本发明的有益效果

本发明针对PARD6A基因设计了一系列siRNA序列，经脂质体逆转染使各对siRNA进入人卵巢癌细胞株A2780，以逆转染siGL2(与目的基因的序列无同源性)的A2780细胞为阴性对照，通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验来验证靶基因PARD6A的沉默效率并筛选出两对能高效干扰PARD6A基因的表达的siRNA，并通过蛋白免疫印迹(western blotting)实验进一步对筛选出的两对siRNA的沉默效果进行验证。接下来，再通过细胞活性检测实验和吸附实验，来检验本发明中的两对siRNA通过干扰PARD6A基因的表 达以抑制A2780细胞的增殖活性和吸附能力的效果。最终证明，本发明提供的两种siRNA序列，能有效地抑制PARD6A基因的表达，达到抑制卵巢癌细胞株A2780增殖和吸附活性的效果，从而抑制卵巢癌细胞的增殖和转移，在未来卵巢癌靶向治疗中具有非常大的潜在价值。

附图说明：

图1为qRT-PCR技术检测siPARD6A对PARD6A基因的信使RNA(mRNA)水平的抑制。图为实验组1-6(分别逆转染PAR1、PAR2、PAR3、PAR4、PAR5、PAR6)与对照组(逆转染siGL2)相比，PARD6A基因信使RNA(mRNA)表达的相对值。与对照组相比，PAR1和PAR2显著抑制PARD6A基因mRNA水平的表达，(**表示P<0.01，试验次数≥3)。

图2为代表性Western blotting检测siPARD6A对PARD6A蛋白水平的抑制。对照组逆转染的是siGL2；实验组1和实验组2逆转染的分别为PAR1、PAR2。

图3为PAR1、PAR2及PE1、PE2对A2780细胞的增殖活性影响，对照组逆转染siGL2；实验组1、实验组2、实验组3、实验组4分别逆转染PAR1、PAR2、PE1、PE2(**表示P<0.01，试验次数≥3)。

图4为PAR1和PAR2对细胞吸附能力的影响。图为对照组(逆转染siGL2)与实验组1、实验组2(分别逆转染PAR1、PAR2)从种板0.5h(即siRNA处理细胞72.5h)后至种板11.5h(即siRNA处理细胞83.5h)，细胞相对吸附数随时间的变化(以种板11.5h后对照组实验测得的吸光度为1计算所得相对值)，(**表示P<0.01，试验次数≥3)。

具体实施方式

本发明所提供的PARD6A siRNA是根据发明人在美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中查到的人PARD6A mRNA序列，通过美国IDT公司(Integrated DNA Technologies)的siRNA设计平台设计所得。在初始设计时，设计选择了6对siRNA序列进行化学合成，如表1所示。再通过qRT-PCR实验筛选得到两组使A2780细胞中PARD6A mRNA相对表达水平显著降低的siRNA 序列[siPARD6A-1(PAR1)和siPARD6A-2(PAR2)]，如表1所示。并且，通过Western blotting实验验证这两组siRNA干扰PARD6A蛋白水平表达的效果。

表1. siRNA的序列

名称序列1(5′-3′)序列2(5′-3′)PAR1CCAACAGCCAUAACCUCAUTTAUGAGGUUAUGGCUGUUGGTTPAR2GGGCUUCUACAUCCGAGAUTTAUCUCGGAUGUAGAAGCCCTTPAR3GGACCGTGCTACTTGGCTATTTATAGCCAAGTAGCACGTCCTTPAR4GGGCTTCTACATCCGAGATTTATCTCGGATGTAGAAGCCCTTPAR5CCAGGTTTCCTCAGTCATATTTATGACTGAGGAAACCTGGTTPAR6GCCATAACCTCATTGTCACTTGTGACAATGAGGTTATGGCTTGL2CGUACGCGGAAUACUUCGATTUCGAAGUAUUCCGCGUACGTT

实施例1:qRT-PCR实验检测siPARD6A的mRNA水平沉默效果

人卵巢癌细胞株A2780细胞(美国菌种保藏中心，American type culture collection，美国)用含10％胎牛血清及10U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium，DMEM)(美国生命科技公司，Life Technologies，美国)培养基，在5％CO₂、37℃细胞培养箱(赛默飞公司，Thermo>

实验步骤：将订购的六管siPARD6A粉末和一管siGL2粉末(上海吉玛制药技术有限公司，中国)用无DNA酶/RNA酶的蒸馏水(DNase/RNase-Free Distilled Water)(Life Technologies公司，美国)按说明书要求配制成浓度为20μM储存于-20℃冰箱，分别标记为PAR1、PAR2、PAR3、PAR4、PAR5、PAR6、GL2。

siPARD6A逆转染实验：用DNase/RNase-Free Distilled Water将20μM的7管siRNA分别稀释成2μM的工作浓度。再取7支EP管，分别用减血清培养基(OPTI-MEM)(Life Technologies公司，美国)将各siRNA稀释成终浓度为 25nM，含2μl脂质体2000(lipofectamine 2000)(Life Technologies公司，美国)的100μl混合液，室温下孵育15min。此时，开始处理细胞，取出培养A2780细胞的T25培养瓶，类似细胞传代处理重悬细胞后取10μl细胞悬液至细胞计数板上计数。按每孔细胞悬液体积为900μl，需种4.5×10⁵个细胞，来计算配制细胞悬液。取两块六孔板，于其中7个孔中分别加入100μl孵育好的各siRNA与脂质体的混合液，之后再分别加入900μl调整好细胞密度的细胞悬液，轻轻摇匀后放入细胞培养箱培养72h。72h后取出六孔板，按一般传代步骤用胰蛋白酶(西格玛奥德里奇贸易有限公司，上海)分别将7个孔中的细胞消化下来，转至EP管中，标记好，400g离心5min，吸弃上清液，每个EP管中加1ml>

表2. PCR引物序列.

引物引物名称序列(5′-3′)上游引物PARD6A-Fggctatacggatgctcatgg下游引物PARD6A-Raaacctggcggaaatcttgg

qRT-PCR实验：用Trizol法提取分离细胞中的总RNA，再用Invitrogen逆转录试剂盒(英潍捷基贸易有限公司，上海)逆转录合成第一链DNA。然后配置qRT-PCR反应体系(体积20μl，含无DNA酶RNA酶的超纯水、10×PCR缓冲液、dNTP、SYBR Green I染料、ROX染料、Pfu DNA聚合酶，细胞总RNA逆转录得到的第一链DNA模板、前引物PARD6A-F、后引物PARD6A-R)，使用ABI7300(美国伯乐公司，BioRad公司，美国)进行检测，比较试验组和对照组中PARD6A基因的相对表达量。反应程序为：95℃预变性2分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，40个循环，在PCR反应的循环延伸期间收集荧光信号。最后用2^-△△CT法计算试验组和对照组的PARD6A基因相对表达水平差异。

如图1所示，实时荧光定量RT-PCR实验结果表明，与对照组相比，PAR1和PAR2实验组的沉默效率分别达到58.79±8.31％、59.10±7.27％，而其余4种siRNA的沉默效率远不如PAR1和PAR2。(**表示P<0.01)

实施例2:Western验证PAR1、PAR2蛋白水平的沉默效果

实验步骤：逆转染实验同实施例1中步骤，但仅做逆转染PAR1、PAR2、GL2三组，且每组做两组以备提蛋白。

Western blotting实验：首先用SDS蛋白裂解液处理各组细胞，收集处理相应蛋白样品，再配制SDS-PAGE凝胶、上样、电泳，然后转膜、用5％脱脂牛奶封闭，接着用1xTBS洗膜，剪膜，用稀释过后的第一抗体抗PARD6A(Anti-PARD6A)(西格玛奥德里奇公司，Sigma-Aldrich，美国)反应1h，继续加第二抗体抗兔免疫球蛋白G酶联抗体(Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody)(美国细胞信号转导公司，Cell signaling technology，美国)以及化学发光剂反应5min，最后压片，观察分析实验结果。

如图2所示，实验组PAR1和PAR2相对于对照组，PARD6A基因的蛋白表达量明显减弱，说明本发明的两种siRNA能够有效的干扰PARD6A基因的表达。

实施例3:siPARD6A影响细胞增殖活性

细胞增殖活性检测即通过MTT染色法检测siPARD6A作用72小时后的细胞相对存活率，以判断siPARD6A对A2780细胞的增殖能力影响。

实验步骤：siRNA逆转染实验类似实施例1，但规模相应调整，按每个条件3个复孔，每孔加10μl孵育好的相应siRNA与lipofectamine2000的混合液与90μl调整细胞密度至5×10⁵个/mL的细胞悬液，轻轻摇匀，放入细胞培养箱培养72h。72h后，取出96孔板，每孔加10μl>

我们之前的研究发现，PRKCE基因编码的蛋白激酶C(PKCε)对细胞极性也有重要影响，且已有研究表明沉默PRKCE能影响细胞的增殖和迁移，因此，我们想验证一下，在增殖方面，沉默PRKCE是否与我们现在的siPARD6A有同样或类似的效果。于是，我们用沉默PRKCE的siRNA(表3)同样进行了上述实验。

表3.沉默PRKCE的siRNA的序列

名称序列1(5′-3′)序列2(5′-3′)PE1GAACACUACCAUGGUCGGGUUCCCGACCAUGGUAGUGUUCUUPE2ACACAUGAAUAUGAUGGGCUUGCCCAUCAUAUUCAUGUGUUU

如图3所示，与对照组相比，PAR1和PAR2组中两对siRNA对A2780细胞的杀伤力较强，细胞相对存活率均仅分别为28.35±5.99％、22.53±1.19％，(**表示P<0.01)。而沉默PRKCE影响卵巢癌A2780细胞增殖的效果远不如siPARD6A，经PE1和PE2siRNA相同处理后，两组细胞相对存活率高达79.42±2.09％、90.37±2.86％。

实施例4:siPARD6A影响细胞吸附能力

肿瘤细胞的粘附能力直接影响其转移。粘附在肿瘤的发生和发展过程中起双重作用：一方面，肿瘤细胞必须先从其原发灶的粘附部位脱离才能开始转移；另一方面，肿瘤细胞又需借粘附才能移动，肿瘤细胞从连续的粘附基质和解除粘附中获得移动的牵引力，所以肿瘤细胞转移运动的过程就是粘附的过程，检测细胞的吸附能力有助于研究肿瘤细胞的转移。

实验步骤：siRNA逆转染实验同实施例1。PAR1、PAR2、GL2每组要检测6个时间段后细胞的吸附能力，每个条件需要种3个复孔，按每孔种2×10⁴个细胞,100μl细胞悬液操作。种完96孔板后，即为0h，分别从0h、0.5h、1.5h、4.5h、8h、12h开始，弃去96孔板中的上清培养基，重新加入100μl培养基和10μl>

如图4所示，从siRNA处理细胞72h(即种板0h)之后，PAR1和PAR2实验组细胞吸附能力开始低于对照组，随着时间推移，这种吸附能力差距越来越大；图曲线反映了相应siRNA处理细胞后72h至83.5h(即种板后0h至11.5h)内，PAR1和PAR2对A2780细胞的吸附能力的影响。(**表示P<0.01)。

<110>江苏大学

<120>抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列及其抗卵巢癌增殖和转移的用途

<160>1

<170>Patent In version 3.3

<210>1

<211>33

<212>RNA

<213>人工序列

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1 CCAACAGCCAUAACCUCAUTT/AUGAGGUUAUGGCUGUUGG>

<110>江苏大学

<120>抑制人PARD6A基因表达的小干扰核糖核酸序列及其抗卵巢癌增殖和转移的用途

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<170>Patent In version 3.3

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<211>48

<212>RNA

<213>人工序列

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1 GGGCUUCUACAUCCGAGAUTT/AUCUCGGAUGUAGAAGCCCTT42