用于图像地示出生物学的材料的装置的校准规范件

摘要

本发明涉及一种用于图像地示出生物学的材料(6)的装置(1)的校准规范件(7)，所述材料在检查期间至少局部地激励至发光。所述装置(1)具有包括辐射源的照明单元(2)，通过所述辐射源，可发射电磁的激发辐射(15)。此外设置接纳部(3)，所述接纳部保证，在承载体(5)上设置的生物学的材料(6)定位在激发辐射(15)的射线路径内。此外所述装置具有至少一个成像单元(4)，所述成像单元从生物学的材料(6)接收基于通过激发辐射(15)的激励发射的发光辐射(16)并且产生生物学的材料(6)的至少激发至发光的区域的图像。为了校准，所述装置具有校准规范件(7)，所述校准规范件基于通过激发辐射(15)的激励发射校准辐射，所述校准辐射由成像单元(4)接收并且在控制装置(18)中在考虑接收的校准辐射的情况下可生成校准信号。所述技术的解决方案的特征在于，校准规范件(7)具有壳体(9)，所述壳体具有其中包括的可激励至发光的材料(12)，并且校准规范件借助紧固机构(19)固定地与照明单元(2)或接纳部(3)连接。

说明书

技术领域

本发明涉及用于图像地示出生物学的材料的一种校准规范以及一种装置，对应的校准规范件集成到所述装置中。属于同类的装置的重要的构件的是具有辐射源的照明单元以及接纳部，通过所述辐射源发射电磁的激发辐射，所述接纳部用于将在承载体上设置的生物学的材料定位在激发辐射的射线路径内。此外设置成像单元，其从生物学的材料接收基于通过激发辐射的激励发射的发光辐射并且产生生物学的材料的至少激发成发光的区域的图像。此外设置校准规范件，所述校准规范件基于通过激发辐射的激励发射校准辐射，所述校准辐射由成像单元接收并且在控制装置中在考虑接收的校准辐射的情况下可生成校准信号。

背景技术

尤其是在体外诊断术的领域中，在检查人的或动物的样品时多次实施荧光分析。依赖于使用的分析方法在这里利用不同的系统接收并且评估荧光图像。为了使相应的结果尽管如果可以相互比较重要的是，确定对荧光信号的仪器特定的影响并且可以对其对应地纠正。在这里特别的意义的是用于仪器校准的校准或荧光标准的使用，其辐射强度可引回至认证的标准。

这样的标准的意义借助一个项目变得显著，所述项目共同由德国联邦物理技术研究院(PTB)、德国联邦材料研究和检测研究院(BAM)以及Firmen Gigahertz-Optik GmbH公司和Sigma-Aldrich GmbH公司实施。在该项目的范围中，发展用于荧光标准的辐射的追溯链，所述追溯链由三个重要的元件组成。一方面设置紧凑的、均一发光的乌布利希球辐射器，其光谱的辐射密度相对于钨带灯以多个数量级减少，从而其在其辐射特性方面比常规的辐射密度规范显著更好地与荧光的样品适配。第二元件是具有最小的光学的投影误差的参考荧光计，其追溯地通过辐射密度规范能够实现以足够小的辐射的测量不可靠性对荧光光谱的认证。校准组“Spektrale Fluoreszenzstandards BAM-F001sowie BAM-F005(光谱发光标准BAM-F001以及BAM-F005)”用作追溯链的第三部分，其纠正的发射光谱在2006年一月由BAM认证。这些标准对于使用者能够实现，在应用相关的条件下相对简单并且可追溯地确定并且纠正荧光测量系统的发射通道的相对的光谱的灵敏度。

为了研究的实际的实施，由现有技术已知用于接收并且评估发光图像、尤其是荧光图像的大量的装置，利用其检查生物学的材料的样品。这样的装置经常具有显微镜或照相机单元，利用所述显微镜或照相机单元分别产生以荧光颜料标出的生物学的样品的接纳部。此外已知微阵列扫描器，利用其可以检查在所谓的生物芯片上设置的荧光标记的DNA样品。

由WO 2009/127424已知不同的荧光标准，其对于荧光光谱学可使用。在已知的荧光标准中经常有问题的是，所述荧光标准在可使用的时间间隔上不是光稳定或容易退色，特别是在较长的曝光或在高强度的曝光时。此外使用的颜料在许多情况中只在窄的光谱范围内可使用。

其他的问题经常在于，其相对昂贵，机械、热和化学不稳定并且此外快速老化或干燥，这再次导致与照射相关的荧光强度的改变。

之前所述的文献在这里公开不同的荧光标准或荧光颜料，其特征在于，使用荧光的矿物或包含荧光的矿物的物质。所述矿物不仅是天然的而且是合成的矿物。

除了矿物的荧光颜料之外也使用其他颜料、例如聚合物作为荧光标准。由EP 1 373 870 B1已知一种用于引用荧光信号和/或用于校准荧光探测系统的装置，其依据特别的聚合物的应用。所述装置主要具有非荧光的承载体，在所述承载体上，在多个确定的区域中施加具有部分不同的厚度和/或组成的聚合物层。聚合物层这样施加到承载体上，使得其在对应的照射之后发荧光，从而涂敷的承载体可以作为荧光标准使用。

所述荧光标准用于实验的标准化使用，所述实验以探针阵列的评估为依据，其中，荧光标准连同包含生物学的材料的探针处于共同的承载体上。所述承载体是环氧化的载片，通过超声打孔将孔制出所述载片中，所述孔以荧光的聚合物填充并且随后粘接。

为了构建诊断，首先将PCR产品的一系列斑点施加到承载体上，其中，特别净化的并且荧光颜料标记的特别的cDNA(脱氧核糖核酸)通过杂交固定到各个PCR斑点上。随后这些样品借助共焦的激光扫描器读取并且分析结果，其中，所述评估在考虑以荧光标准的不同的区域的强度的补偿的情况下进行。

从用于接收发光图像、尤其是生物学的材料的荧光图像的已知的系统和用于校准这样的系统使用的标准出发，本发明的任务是，给出一种简单并且可重复地可制造的校准规范件，利用其可以相对简单并且准确地进行对应的检查装置的校准。在这里一方面重要的是，使用的发光材料通过特别的耐久性表征，尤其是避免快速的退色，尽管如此能够实现相对简单的操作并且此外是低成本的。尤其是校准规范件应该这样实施，使得对应的检查单元的校准在正常的实验室工作进程中可以没有大的花费地并且在短的时间中进行，在所述实验室工作进程中，大的数量的不同的样品必须在短的时间中处理。此外校准规范件应该能够实现检查单元的尽可能自动化的并且尽管如此高精度的校准。此外应该以优选的方式保证，也在制造许多检查单元时，对于相应的单元使用彼此可比较的校准规范件。给出的校准规范件到标准化的标准的可追溯性因此是另一个显著的特征。校准规范件应该此外在光谱上尽可能与在荧光应用中使用的荧光染料一致。

发明内容

前述的任务利用按照权利要求1所述的装置以及按照权利要求15所述的校准规范件解决。校准规范件的按照本发明的使用此外在权利要求17中给出。本发明有利的实施形式是从属权利要求的主题并且在接着的说明中在部分地参考所述图的情况下进一步解释。

本发明涉及一种用于图像地示出生物学的材料的装置，其包括照明单元，所述照明单元具有辐射源，通过所述辐射源，可发射电磁的激发辐射。此外设置接纳部，其保证，在承载体上设置的生物学的材料定位在激发辐射的射线路径内。此外所述装置具有至少一个成像单元，所述成像单元从生物学的材料接收基于通过激发辐射的激励发射的发光辐射并且产生生物学的材料的至少激发至发光的区域的图像。为了校准，所述装置具有校准规范件，所述校准规范件基于通过激发辐射的激励发射校准射线，所述校准辐射由成像单元接收并且在控制装置中在考虑接收的校准辐射的情况下可生成校准信号。本发明的特征在于，校准规范件具有壳体，所述壳体具有其中包括的可激励至发光的材料，并且校准规范件借助紧固机构固定地与照明单元或接纳部连接。

按照本发明的校准规范件因此是一个构件，所述构件构成用于生物学的材料的光学的检查的装置的重要的构件。尤其是校准规范件是所述装置的集成的组成部分，在所述装置上，校准规范件也在更换样品载体时保留并且这样对于长时间或许多检查可使用。

在本发明的特别的第一实施形式中，壳体具有窗口，所述窗口对于激励以及发光辐射至少部分透明。优选校准规范件的壳体作为钢托座实施，在其上侧上、亦即在校准规范件的朝向辐射源的一侧上引入窗口。在壳体的与窗口相对置的一侧上以有利的方式设置开口，通过所述开口，在校准规范件的制造期间，发光的材料、尤其是粉末，引入壳体中并且所述开口在引入发光的材料之后以塞子、优选也由钢制成的塞子闭锁并且粘接。

本发明的另一种有利的实施形式设置为，所述窗口具有用于确定接纳单元和标记部之间的限定的距离的标记部。优选所述标记部以十字线的形式实施，其用于利用接纳单元的物镜精确的并且可复现的调焦，其中，在该情况中，点精确的调焦沿所有三个运动方向(X-、Y-、Z-方向)是可能的。具有20倍或40倍放大的物镜特别适合用于在按照本发明的装置中。

备选或补充地在窗口的表面上设置其他结构。这些其他或另外的结构优选这样实施，使得其确保其他的功能、例如XY位置和/或原始位置的限定和校准和/或成像比例的确定。

按照本发明的一种特别的进一步构成，可激励至发光的材料是可激励至荧光的颜料，亦即所谓的荧光颜料。以有利的方式，发光的或荧光的颜料是粉末状的。荧光染料和二氧化硅(SiO₂)或石英的混合的使用是特别适合的。荧光染料与另一种材料混合，尤其是与之前提到的二氧化硅混合，以便相对于纯净的荧光染料以合适的方式减少从校准规范件出发的发光或荧光辐射的辐射强度。

在另一种实施形式中设置为，备选或补充于荧光染料以二氧化硅(SiO₂)的稀释，设置其他的衰减机构。尤其是在这里可设想，为校准规范件的壳体的窗口设置至少一个衰减机构，通过所述衰减机构，由发光的材料发射的发光辐射的强度在穿透通过窗口时减少。优选衰减机构设置在窗口的朝向发光的材料的表面上并且具有部分透明的灰色滤光器和/或孔栅结构。同样可设想，将所述窗口关于发射的发光辐射的光谱部分透明地实施，以便达到发光辐射的辐射强度的希望的缓冲。

备选于具有粉末状的荧光染料的校准规范件的使用可设想，设置所谓的纳米点作为发光的材料在照明单元的区域中或接纳部上，具有要检查的生物学的材料的承载体处于所述接纳部上。以有利的方式在这里可设想，产生光学纯净的环氧树脂并且填充比色计，其在该情况中形成校准规范件的壳体。优选将这样的比色计装入显微镜或微阵列扫描器的接纳单元的合适的保持部中。在该情况中，比色计也构成检查单元的集成的构件并且与其固定地连接。按照本发明的特别特定的进一步构成，比色计在校准情况中从外面输送或装入。

本发明重要的思想在于，提供用于光学地检查生物学的材料的装置的校准规范件，所述校准规范件构成所述装置的构件并且因此长期稳定并且特别是固定地与检查装置连接。以优选的方式，校准规范件壳体具有外螺纹，利用所述外螺纹，校准规范件可拧入用于定位包括生物学的材料的承载体设置的接纳部、例如显微镜或照相机单元的十字位移台或微阵列扫描器的接纳格层中。同样可设想，在校准规范件和检查装置的接纳或照明单元之间借助卡锁连接或过盈配合建立持久的、可脱开/固定的连接。

按照本发明的一种特别的进一步构成，校准规范件可追溯地实施，从而借助校准规范件产生的测量结果可追溯到认证的辐射源或通过认证的辐射源校准的规范。这可以实现，其方式为，校准规范件借助认证的辐射源或借助通过认证的辐射源校准的规范校准。按照特别的进一步构成为此在制造校准规范件时设置包括用于校准规范件的接纳部的特别的机械的构造。此外设置激光二极管，所述激光二极管备选地可以通过另一个合适的、窄带的辐射源、尤其是LED代替。按照一种特别的实施形式甚至可设想，装入宽带的辐射源并且借助光学的辅助工具产生合适的光谱。

之前所述曝光源的辐射功率优选以校准的探测器测量并且调节。只要激光二极管作为照明源使用，则其温度和辐射功率稳定调节地运行。在窄带的激励中有利的是，激励-(Excitations)和发射光谱不显著地重叠并且因此校准规范件的发射光谱能够几乎完全光谱地被测量。

为了测量发射光谱以有利的方式使用光谱仪系统，其之前以认证的辐射源可追溯地校准。在校准规范件的试验期间，所述校准规范件以优选使用的激光二极管激励成辐射。接着发射光谱以校准的光谱仪检测，从而确保至认证的辐射源的可追溯的照度测量。为了有效率的散射光抑制，光谱仪装备有适合的长通滤波器，所述长通滤波器阻断激发辐射并且传送发射辐射。基于这样实施的测量，可以也在使用者那里作为试验手段使用试验过的校准规范件。

本发明同样涉及一种用于对图像地示出生物学的材料的装置进行校准的校准规范件。所述校准规范件具有壳体，所述壳体至少局部地包围可激励至发光、尤其是荧光的材料。校准规范件的该壳体至少部分地由对于激励辐射以及对于由激发的材料发射的发光辐射透明的材料实施。此外在壳体的外侧上设置至少一个紧固机构，借助所述紧固机构，校准规范件可紧固在用于图像地示出生物学的材料的装置中或上。校准规范件因此这样构造，使得其可以成为检查装置集成的构件。按照本发明，校准规范件的特征在于，紧固机构具有螺纹、插头或卡锁元件，其分别适合，重复地紧固在所述装置的具有配合轮廓的配合件上。

要使用的发光颜料优选是荧光颜料，其设置在壳体内部并且是粉末状的和具有至少一种荧光染料以及石英(SiO₂)，或具有可激励至发光的环氧树脂或类似的聚合物。

按照一种特别的进一步构成，按照本发明实施的校准规范件能够利用显微镜、照相机单元或在微阵列扫描器的样品接纳部的区域中使用，其方式为校准规范件持久、并且更确切地说是可脱开地/固定地在显微镜或照相机单元的纵横调整台上或微阵列扫描器的样品接纳部的区域中紧固。

附图说明

接着没有一般的发明思想的限制地在参考附图的情况下进一步解释本发明。在此示出：

图1示出包括校准规范件的自动的荧光显微镜以及

图2示出按照本发明实施的校准规范件。

具体实施方式

图1示意性示出用于生物学的材料6的光学检查的装置1，其具有按照本发明实施的校准规范件7。要检查的生物学的材料6在该情况中是以病人血清以及至少一种荧光标记的标记部孵育的组织切片。组织切片6设置在载片5上，所述载片再次定位在检查单元1的接纳部3、在这里纵横调整台上。作为用于生物学的材料6的光学的检查的装置1使用荧光显微镜，其具有控制装置17，所述控制装置确保，样品6的检查可以可选地手动或至少半自动化地进行。为了拍摄要检查的以荧光颜料标出的生物学的材料6的图像，设置用于成像的照相机单元4，所述照相机单元在自动化的过程中首先对分别要接纳的样品6调焦并且随后产生样品6的至少一个荧光图像并且将其存储在数据存储器18中。

在第一次检查开始之前，自动的荧光显微镜1在通常的实验室工作进程的范围中首先被校准。为此在显微镜的纵横调整台3上设置校准规范件7，所述校准规范件具有在壳体9中包括的荧光的粉末12。优选使用的荧光的粉末12是荧光染料和二氧化硅(SiO₂)的混合，其中，一份荧光染料对至少300份的二氧化硅(SiO₂＝石英)。校准规范件7的壳体9在其配置给荧光显微镜1的辐射源2、在这里蓝色的LED的上侧上具有窗口8，所述窗口一方面对于激发辐射16是透明的并且另一方面对于由荧光颜料12在激发状态中发射的荧光辐射16是部分透明的。此外，在壳体9的窗口8上设置十字线形式的标记部13，所述十字线在实施校准过程之前借助拍照单元4调焦。以这种方式可以保证，也在荧光显微镜1校准时总是调节拍照单元4和校准规范件7之间的正确的距离(Z方向)并且因此获得可靠的测量结果。此外窗口8具有另一个标记部14，所述标记部能够实现初始位置以及校准规范件7在与纵横调整台3平行的平面中的位置(XY位置)的确定。

在校准规范件7调焦并且其相对于拍照单元4的位置确定之后，其方式为对应移动荧光显微镜1的纵横调整台3，拍照单元4确定由校准规范件7发射的荧光辐射16的辐射强度。通过所述校准保证，不同的生物学的样品6的紧接着校准实施的荧光测量总是导致类似的结果。借助使用的校准规范件7尤其是执行标准，所述标准确保并且检查荧光显微镜1的长期稳定性。使用的荧光颜料12、在这里荧光染料和二氧化硅的混合物的特征一方面在于其长期稳定性并且另一方面在于其光谱与通常用于生物学的材料6的荧光标记的IFT颜料、所谓的FITC(异硫氰酸荧光素)的光谱的类似性。

因为按照本发明使用的校准规范件7是可追溯的规范，所述规范光谱分析地相对于认证的照度规范被检查，所以校准规范件7可以用作为检验结构。除了稳定性、亦即不同的荧光显微镜1的可比较性，也可以借此检测系统彼此的补偿。

荧光显微镜1的照明单元2具有LED作为辐射源。借助LED的激励具有大的优点，即，通过滤波和成像直到以照相机4的探测，完整的成像链可以连续地借助使用的校准规范件7检测或控制或甚至调节。

图2在详细视图中示出用于校准使用的校准规范件7。校准规范件7具有钢壳体9，在其上侧上，窗口8引入其中。使用的粉末状的荧光标准12在校准规范件7的制造期间通过在校准规范件7的下侧上开口10引入其中并且开口10随后借助塞子11闭锁并且粘接。在下面的区域中，校准规范件7此外具有外螺纹作为紧固机构19，借助所述紧固机构，校准规范件7可拧入到检查单元1的纵横调整台3中的对应为此设置的内螺纹中，以用于产生荧光图像。校准规范件1因此固定地与检查单元1、尤其是包括照相机单元4的自动化可运行的荧光显微镜连接并且这样成为检查单元1的集成的构件。校准规范件7因此不是必须在每个测量中或在新的测量系列的每个开始时在激发辐射5的射线路径中重新定位。

在窗口8的上侧上此外设置十字线13作为标志。粉末状的发光颜料12、在这里荧光颜料处于窗口8之下，所述荧光颜料作为荧光染料的混合、尤其是基于掺杂的正硅酸盐-二氧化硅-混合物实施。

施加到窗口8的上侧上的十字线13用于校准规范件7借助物镜的精确的并且可重复的调焦，所述物镜在该情况中是自动化地可运行的荧光显微镜的成像单元4的一部分。优选使用具有20倍或40倍放大的物镜并且调焦沿X方向、Y方向以及Z方向实施。通过校准规范件7的这样进行的调焦，总是调节成像或拍照单元4、尤其是相应的物镜和校准规范件7之间的限定的距离，从而保证在拍照单元4、例如照相机的视野中的重复精确的并且均一的照明。由校准规范件7发射的荧光辐射16的强度的测量由此可重复。

只要其他的测量应该借助校准规范件7实施，例如成像比例尺的确定或XY位置以及原始位置的确定和校准，则将其他的为此合适的标志14施加到窗口的表面上。

因为使用的荧光颜料12具有高的亮度，所述辐射强度通过合适的措施在校准规范件7上缓冲。以这种方式，校准规范件7的荧光辐射12与通常用于生物学的材料6的标记部的荧光颜料(FITC)的亮度匹配。

粉末状的荧光染料与二氧化硅的混合对辐射强度的缓冲有最大的影响。通常在这里使用如下混合物，其中一份荧光染料以至少300份的二氧化硅混合。在校准规范件7的壳体9中可以设置180和220mg之间的荧光染料和二氧化硅的粉末状的混合物12。

补充荧光染料以二氧化硅的稀释，可以在校准规范件7上进行其他的缓冲措施。一方面窗口8可以在背侧上以部分透明的灰色滤光器占据，所述灰色滤光器减少激励和发射，从而由校准规范件7发射的荧光辐射16的辐射强度显著减少。发射的荧光辐射16这样缓冲，使得校准规范件7的荧光辐射16的辐射强度基本上与在检查期间由生物学的材料7发射的荧光辐射的辐射强度适配。

备选或补充于灰色滤光器的使用可设想，窗口8在背侧上具有孔栅结构，所述孔栅结构的宽高比限定透光度(Transmission)。在这里也再次实现校准规范件7的发射的荧光辐射16的辐射强度的减少。另一种变型设置为，窗口8对于由荧光标准7出发的荧光辐射16并且必要时也对于激发辐射15是光谱部分透明的。以这种方式可以结合荧光染料的发射光谱适配发射的光谱。

通过使用合适的长通滤波器，在这里校准规范件7的发射光谱与例如发射红色的光的其他荧光颜料的相应的光谱的适配也是可能的。

通过窗口厚度的非常狭窄的公差，此外规范相对彼此的制造扩散(Fertigungsstreuung)减少。不变的窗口厚度在制造中如下保证，即，窗口8在安装到壳体9中之前抛光到希望的最终尺寸上。

在图2中示出的并且之前解释的校准规范件7的特征特别是，其可追溯到标准或参考光源上。为了保证这一点，每个校准规范件7在其制造之后在机械的构造方面校准。机械的构造在这里具有用于校准规范件7的接纳部，所述校准规范件借助激光二极管激励成荧光辐射。在这里可设想，激光二极管通过另一种合适的窄带的辐射源代替。激发成荧光辐射的校准规范件7的辐射功率借助校准的探测器测量和调节。在这里激光二极管在温度和辐射功率方面稳定地调节地运行。基于窄带的激励的使用，可靠阻止激励和发射光谱的重叠，从而校准规范件7的发射光谱能够完全光谱地被测量。

用于测量的光谱仪系统同样首先利用认证的辐射源可追溯地校准。校准规范件7利用激光二极管激励至辐射，利用校准的光谱仪检测发射光谱，从而确保至认证的辐射源的可追溯的亮度测量。因此所述校准规范件7可以用作为检验机构。以优选的方式在制造中使用认证的亮度规范，所谓的“主规范”。其在检查单元1、例如自动化可运行的荧光显微镜的制造中用于利用其中装入的、从主体导出的校准规范件7对检查单元1彼此补偿。借助按照本发明实施的校准规范件7，可以因此提供荧光显微镜，所述荧光显微镜一方面可容易校准并且另一方面不仅长期稳定而且彼此类似。该优点如下实现，即，在校准规范件7的制造中，从通过LED的激励通过滤波和成像直到以照相机单元4的探测，完整的成像链可以连续地被检测或控制或甚至调节。另一方面按照本发明实施的校准规范件7是检查单元1的集成的组成部分并且优选在整个使用寿命中保持在仪器上。

附图标记列表

1 检查装置

2 照明单元

3 接纳部

4 成像单元

5 承载体

6 生物学的材料

7 校准标准

8 窗口

9 壳体

10 开口

11 塞子

12 发光颜料

13 用于调焦的标记部

14 另一个标记部

15 激发辐射

16 发光辐射

17 控制装置

18 数据存储器

19 紧固机构