具有抗血栓形成的涂层的聚氨酯

摘要

本发明涉及具有抗血栓形成的涂层的聚氨酯(PUR)，其中所述抗血栓形成的涂层包括经由至少2个键共价结合到PUR表面的至少一种抗血栓形成的物质，其中第一个键是PUR表面和聚乙烯亚胺(PEI)之间的酰胺键，第二个键在PEI和抗血栓形成的物质之间，其中在形成第一个键之前，PUR表面已通过使用二氧化碳等离子体或通过加入二氧化碳改性的等离子体而被激活。

说明书

技术领域

本发明涉及具有抗血栓形成的涂层的聚氨酯(PUR)，其中所述抗血栓形成的涂层包括共价结合到PUR表面的至少一种抗血栓形成的物质。

从http://publica.fraunhofer.de/documents/N-141596.html已知，聚碳酸酯-氨基甲酸乙酯由于其生物和血液相容性、生物稳定性和在高应力植入物中的韧性和平滑性而被应用于医疗技术中。高度的表面改性能力允许抗菌或抗血栓形成的涂层的应用。

Trzaskowski M.等人(The Challenges of Modern Technology 2(1),2011,第19-22页)公开了一种包覆在用于人工心脏植入物的聚氨酯表面上的聚乙烯吡咯烷酮水凝胶。聚乙烯吡咯烷酮是在水中形成水凝胶的高亲水性聚合物。预期会增加包覆材料的生物相容性并防止血液在PUR表面上凝结。此外，公开了先前已经通过用有效防止血液凝固的蛋白质如肝素、尿激酶或凝血调节蛋白包覆PUR表面来改善血液相容性。提及它们的主要缺点是这些改性的耐久性不足。

Sask,K.N.等人(Langmuir 2012,28,第2099-2106页)公开了用抗凝血酶-肝素复合物对聚氨酯表面改性以用于血液接触。它被描述为使用异氰酸酯化学将聚环氧乙烷(PEO)共价偶联到聚氨酯的表面。随后将抗凝血酶-肝素复合物共价偶联到PEO。

经由PEO用抗凝血酶-肝素复合物共价地包覆聚氨酯导管已知于Du,Y.J.,et al.,Journal of Biomedical Materials Research Part A(生物医学材料研究杂志A部分)，2007年第80A卷第1期第216-225页。

从US 6491965 B1已知包括糖胺聚糖-抗凝血酶III/肝素辅因子II的缀合物的医疗装置。缀合物共价连接到该装置的聚合物。该聚合物可以是聚氨酯或聚碳酸酯型聚氨酯。该装置可以是心导管、心肺旁路回路、透析回路或体内假体。

WO 2011/147409描述了具有由紧密网状聚合物纤维组成的涂层的内假体涂层。聚合物可以是聚氨酯。内假体可包含抗再狭窄活性物质，例如抗血栓物，例如抗凝血酶。活性物质可以共价地、粘附地或以离子键合形式包含在聚合物纤维网中。

从WO 03/034944 A1已知用于预防再狭窄的支架涂层。该涂层可包含抗血栓形成的活性物质，例如抗凝血酶。该支架包覆有第一血液相容性涂层和包含活性物质的至少一个第二涂层。该血液相容涂层可以由肝素、寡糖和多糖、聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮和其它聚合物组成。

从博士论文“von Polyvinylidenfluorid zur Minimierung der Proteinadsorption”(Ademovic Zahida,2002,Institute of Technology Aachen)已知，通过使用碳二亚胺将聚丙烯酸结合到PVDF的表面，并将聚乙烯亚胺(PEI)结合到聚丙烯酸的羧基。随后将聚乙二醇醛、羧基甲基化的葡聚糖(dextran)或羧甲基化的羟乙基淀粉共价偶联到PEI的氨基。这种涂层旨在产生减少或防止非特异性蛋白结合和所导致的细胞粘附的表面涂层。用聚丙烯酸的涂层需要在约90℃的长期温育。这可能导致经涂覆的基底的性质的变化。较低的温度会导致涂层失效。

从US 4521564已知抗血栓形成的聚氨酯聚合物。该聚合物包括聚氨酯基底、共价结合到所述聚氨酯基底的聚合胺和共价结合到所述聚合胺的抗血栓形成剂。该聚合胺可以是聚乙烯亚胺。

从US 5132108已知具有生物相容性聚合物表面的医疗装置。所述生物相容性聚合物表面包括已经通过使聚合物表面在具有约40至约90体积％的水蒸汽的等离子体介质内经受射频放电处理而改性的表面，该等离子体介质的平衡为基于等离子体介质的总体积约10至约60体积％的氧气。等离子体处理之后，用偶联剂和具有与(已用所述等离子体介质进行射频放电处理的)聚合物表面形成共价连接的胺基的间隔剂(spacer)成分进行处理，然后用具有酸官能团接触并与间隔剂成分处理的聚合物表面共价结合的抗血栓形成剂、纤维蛋白溶解剂或血栓溶解剂进行处理。聚合物表面可以是聚氨酯表面。提供用于连接抗血栓形成剂的反应位点的间隔剂分子可以是聚乙烯亚胺。聚合物表面上的反应位点和间隔剂分子的胺基之间的共价连接可以通过使用适合的偶联剂如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)或二环己基碳二亚胺(DCC)来提供。于室(chamber)内提供等离子体介质。首先从射频处理室排出空气或其它气体，直到其内几乎没有空气或其它气体。然后将水蒸气泵送或以其它方式注入到室内，并在反应室内产生射频电场，从而引起聚合物表面的处理。

本发明所要解决的问题是提供适于生产待被临时或永久地插入哺乳动物尤其是人的血流或身体的医疗装置的替代材料。此外，应提供该材料的医疗用途、医疗装置以及生产该材料的方法。

本发明的问题是通过权利要求1、8、9、10和11的主题来解决。本发明的实施方案在权利要求2-7和12-15中公开。

根据本发明提供了具有抗血栓形成的涂层的PUR。该抗血栓形成的涂层包括经由至少两个键共价结合到PUR表面的至少一种抗血栓形成的物质，其中第一个键是PUR表面和聚乙烯亚胺(PEI)之间的酰胺键，第二个键是在PEI和抗血栓形成的物质之间。第二个键也可以是酰胺键。在形成第一个键之前，已通过使用等离子体激活PUR表面。等离子体是二氧化碳等离子体或通过加入二氧化碳改性的等离子体。等离子体的改性不但导致结合到PUR表面的PEI的量增加，而且导致抗血栓形成的作用增强。这种作用的原因尚不可知。对于结合的PEI的量的增加，据认为加入二氧化碳会导致在PUR表面上 形成额外的羧基。羧基基团可用于PEI的共价结合。此外，已经发现PEI和抗血栓形成的物质的组合非常有利。当与水或体液接触时PEI会形成水凝胶。在PEI和抗血栓形成的物质组合时，等离子体处理显示对凝血细胞具有积极的抗血栓形成作用和抗粘附作用以及对内皮细胞的粘附支撑作用。

二氧化碳等离子体和通过加入二氧化碳改性的等离子体可以是低压等离子体，特别是常压等离子体，即其中该压力与周围环境的压力匹配或近乎匹配的等离子体。它可以通过在10-250千赫的频率下高电压放电而产生。通过加入二氧化碳改性的等离子体可以是氮等离子体(N₂-等离子体)或氩等离子体。

根据本发明的PUR克服了由植入的医疗装置引起的血栓形成的问题。业已发现，它在抑制血液凝固的引发、凝血细胞的粘附以及凝血细胞和白细胞的激活方面非常有效。此外，已经发现抑制细菌的定殖以及所导致的菌膜在植入的医疗装置上的形成。菌膜的形成特别是由表皮葡萄球菌的定殖引起的，是与植入物有关的慢性感染的主要病因。由于这些慢性感染在大多数情况下不能通过抗生素得到成功的治疗，因此迫切需要防止或抑制菌膜形成的植入物的表面。根据本发明的PUR在抑制细菌的粘附、细菌的生长和菌膜的形成方面非常有效。

PUR可以是PUR弹性体。PUR弹性体是由“硬”段和“软”段的交替嵌段组成的多相嵌段共聚物，并因此被称为分段聚合物。特别是，PUR可以是聚碳酸酯型PUR弹性体。这样的PUR可以由聚碳酸酯多元醇、亚甲基二异氰酸酯、乙二胺和二氨基环己烷合成。聚碳酸酯多元醇可以是聚碳酸酯二元醇。PUR可在作为溶剂的二甲基乙酰胺(DMAC)中合成。DMAC也可用于溶解PUR以根据需要使其成形。PUR弹性体可以购自AdvanSource生物材料,229 Andover Street,Wilmington,MA 01887,USA，商品名称为ChronoFlexChronoFlexChronoFlex或其也可购自Lubrizol公司,29400 Lakeland Boulevard,Wickliffe,Ohio 44092,USA，商品名称为TPU或购自DSM Biomedical B.V.,Koestraat 1,6167 RA Geleen,荷兰，商品名称为TSPCU、SPU、PCU和Elasthane^TM>

在一个实施方案中，PEI是分枝聚合物或树枝状聚合物。在这种情况下，可用于结合抗血栓形成的物质的键特别是酰胺键的数目以及抗血栓形成的作用会大大增加。

抗血栓形成的物质可以是肝素，其被改性为在未结合状态包含反应性基团或在未结合状态包含抗凝血酶III(AT III)或具有至少一个羧基、酮基、醛基或氨基的任何其它抗血栓形成的物质。改性肝素的反应性基团可以是羧基、酮基、醛基或氨基。肝素可以通过与NaNO₂/HCl反应而改性。在该反应中，肝素分子被缩短并形成醛基。该改性肝素分子可以借助于NaBH₃CN通过还原胺化经由醛基结合到PEI的氨基。如果该抗血栓形成 的物质包括氨基，则结合到PEI的氨基可以通过经由戊二醛的偶联来实现。本领域技术人员知晓将提到的反应性基团偶联到PEI的氨基的其它方法和机制。PEI肝素与AT>

本发明还涉及根据本发明的PUR作为药物的用途。

本发明还涉及根据本发明的PUR在治疗血栓症或患血栓症的风险中的用途。根据本发明的PUR可以抑制血栓形成和血液凝固的引发。它也可以抑制凝血细胞的粘附以及凝血细胞和白细胞的激活。

本发明还涉及待被临时或永久地插入或接触哺乳动物或人的血流或身体的医疗装置，其中所述医疗装置的表面包括根据本发明的PUR。该医疗装置可以是导管、用于血液流过的管、人造心脏瓣膜、人造心脏、或骨或关节的替代物，或骨或关节的一部分的替代物。

本发明还涉及生产本发明的PUR的方法，包括以下步骤：

a)激活PUR表面，

b)第一偶联，其中PEI偶联到PUR表面，和

c)第二偶联，其中抗血栓形成的物质偶联到PEI。

在每种情况下第一偶联和/或第二偶联可以是碳二亚胺介导的偶联。在每种情况下碳二亚胺介导的偶联需要氨基和羧基的存在。在第一偶联和第二偶联的情况下，氨基是由PEI提供。表面的激活包括在PUR表面上形成自由基，然后形成羧基。这可以通过与空气中存在的O₂或CO₂的反应而产生。该方法允许物质共价偶联到PUR，而没有暴露于聚丙烯酸的有效偶联所需的相对高温的缺点。

激活是通过使用等离子体即电离气体来进行。等离子体可以是冷等离子体。冷等离子体是其中仅小部分气体分子被电离的等离子体。

已经表明，该PUR表面的激活足以在经由酰胺键可被PEI共价结合的表面上产生足够的羧基。等离子体可以是二氧化碳等离子体、氮等离子体或氩等离子体。如果等离子体不是二氧化碳等离子体，则通过加入二氧化碳将其改性。可以仅通过加入空气或加入纯的或医用级二氧化碳来加入二氧化碳。等离子体的改性增加了可结合到PUR表面的PEI的量。据认为，加入二氧化碳会导致在PUR表面上形成额外的羧基。羧基可被用于PEI的共价结合。此外，已发现等离子体的改性会提高根据本发明的PUR的抗血栓形成作用。

根据该方法的另一实施方案，在步骤a)和b)之间将PUR表面暴露于空气或氧气。这种暴露使得另外的共价结合到PUR表面。据认为，该温育(incubation)的效果是PUR 表面上产生了过氧化氢。

在步骤a)和b)之间，可以将PUR表面温育在水、缓冲液或盐溶液中，特别是等渗盐溶液中。在步骤a)和b)之间将PUR表面暴露于空气或氧气的情况下，在步骤a)和b)之间和在暴露于空气或氧气之后，将PUR表面温育在水、缓冲液、盐溶液或等渗盐溶液中。通过这种温育，PUR表面发生变化并且PUR膨胀。在随后的去离子水中的洗涤步骤中PUR变得混浊。该改性表面允许PEI的结合增加。该温育可以在室温下进行，但是如果温度稍微升高例如升高至约50℃则效果会增强。

用于增加共价结合的PEI的量的步骤b)可至少进行两次。

第一偶联和/或第二偶联可以通过使用N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)来进行。EDC可以以EDC的盐酸盐获得并应用。这种碳二亚胺介导的偶联已被证明是非常有效的。本发明人发现在步骤c)之后可以对PUR进行干燥，特别是用脱矿质水清洗后。再润湿干燥的PUR后，它仍具有很好的抗血栓形成的活性并防止蛋白质和细胞的粘附。干燥促进根据本发明的PUR的处理、储存和配送。

本发明实施方案：

图1示出碳二亚胺介导的聚乙烯亚胺的偶联的示意图。

图2示出分枝PEI的式。

图3示出PUR和PUR-PEI-AT III上的表皮葡萄球菌(STEP)的粘附的图表。

图4示出温育8小时后PUR和PUR-PEI-AT III上的STEP增殖的图表。

图5示出温育120小时后PUR和PUR-PEI-AT III上的STEP增殖的图表。

图6示出由PUR和PUR-PEI-AT III的四种负载引起的凝结形成的图表。

图7示出凝血细胞结合到PUR和具有几种涂层的PUR的图表。

图8示出在悬浮液中用凝血细胞温育、洗涤和对粘附的凝血细胞用若丹明-鬼笔环肽染色后，PUR和PUR-PEI-AT III表面的显微照片。

图9示出与PUR和PUR-PEI-AT III接触之前和接触90分钟后凝血细胞激活的图表。

图10示出与PUR和PUR-PEI-AT III接触之前和接触90分钟后全血的凝血酶含量的图表。

图11示出与PUR和PUR-PEI-AT III接触之前和接触90分钟后全血中白细胞的激活的图表。

图12示出由PUR-AT III诱导的血栓形成的图表，其中在AT III结合之前用不同的等离子体处理PUR。

为了生产根据本发明的PUR，使用购自AdvanSource生物材料的ChronoFlex来生产PUR的小圆片。用纯乙醇或异丙醇洗涤圆片10分钟，然后在室温下干燥至少24小时。之后通过使用在4.5千伏所产生的以每分钟20Nl(标准升)气流量的冷氮等离子体来激活圆片，其中向冷氮等离子体中以1.5-2.0NI/分钟气流量加入医用级二氧化碳。等离子体束以5厘米/分钟的速度移动过PUR表面。等离子体处理后，将圆片在室温下暴露于空气中45分钟。之后将圆片于50℃在等渗盐溶液中温育2小时。在该处理过程中圆片的表面发生变化。用等离子体激活的圆片在随后的去离子水中的洗涤步骤中变得混浊，而没有激活的圆片在相同的过程中保持清澈。

用去离子水清洗圆片后，将PUR在水中的0.1M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)中温育20分钟。之后将圆片用脱矿质水再次清洗，并立即在50℃下用在碳酸盐缓冲液中的0.3％分枝聚乙烯亚胺温育2小时。在此过程中聚乙烯亚胺通过氨基共价结合到PUR的-COOH基团。该反应在图1中示意性示出。图2示出分枝聚乙烯亚胺(PEI)的式。用脱矿质水清洗所得的产物PUR-PEI。用在水溶液中的0.2M EDC和0.1M NHS活化4IU/ml的抗凝血酶III 20分钟。之后将三份碳酸盐缓冲液加入到一份该溶液中。将PUR-PEI在得到的溶液中在4℃下温育至少19小时。在反应结束时，用脱矿质水清洗所得的PUR-PEI-AT III圆片并将其在4℃下干燥。

菌膜形成的第一阶段是细菌在材料表面上的粘附和细菌的增殖。表皮葡萄球菌是一种可形成菌膜的细菌。就表皮葡萄球菌(STEP)的粘附和增殖对PUR-PEI-AT III和PUR进行测试。为此目的，将PUR和PUR-PEI-AT III圆片于37℃在细菌的悬浮液中温育30分钟。之后将圆片洗涤5次。然后将圆片的暴露于细菌的面放置在血琼脂平板上并保留在血琼脂上。之后将血琼脂在37℃下温育过夜。然后将圆片取出。在将细菌施加至血琼脂的位置，它们开始增殖并在血琼脂中形成腔，其可以以菌落形成单位而计数，以定量粘附在圆片上的细菌的数量。所得的粘附在PUR上的细菌与粘附在PUR-PEI-AT III的细菌的比示于图3。在该实验中，在两个独立的试验中检验PUR和PUR-PEI-AT的两种不同负载，各进行四次。这表明STEP对PUR-PEI-AT III的粘附相对于对PUR的粘附降低约80％。

为了检验细菌的增殖，在37℃下在PUR和PUR-PEI-AT III圆片上生长细菌8小时和120小时。之后通过使用纯甲醇将细菌固定并用0.2％结晶紫染色。经过多个洗涤步骤，通过使用乙醇将结晶紫从细菌溶出。通过测定595nm处的吸光度进行定量。结果示于图4和图5。在增殖的早期阶段，很少的细菌从圆片分离。在菌膜形成的后期阶段，数块菌膜从圆片分离。在这两个实验中，在独立的试验中测试PUR和PUR-PEI-AT III的两种 不同负载(各三次)。

结果表明，PUR-PEI-AT III相比PUR不允许STEP的显著增殖。

在进一步的实验中，用EDTA-血(使用CaCl₂再激活)温育PUR和PUR-PEI-AT>

在进一步的试验中检验凝血细胞的粘附性。为此目的，在37℃、5％CO₂下将未涂覆的PUR圆片或涂覆有PEI、PEI-肝素K(PEI-HepK)、AT>

图8的左图显示凝血细胞粘附和若丹明-鬼笔环肽染色后PUR-PEI-AT III圆片的四个视野，右图显示血细胞粘附和若丹明-鬼笔环肽染色后PUR圆片的四个视野。

结果表明，PUR-PEI-AT III排斥凝血细胞。图7的结果还表明，该作用不仅是PEI的作用也不仅是AT III的作用，而是PEI和AT III的组合的协同作用。

在动态方法中将五种不同供体的肝素化血液填充在涂覆有PUR-PEI-AT III的管的内表面上。将管旋转由此使血液暴露于确定的剪切力。将该结果与用未处理的肝素化血液获得的结果进行比较。用电子显微镜检验管的内表面。该实验表明，相比未涂覆的PUR管，少得多的凝血细胞粘附到涂覆有PUR-PEI-AT III的管。在该方法中，已通过测量所释放的β-凝血细胞球蛋白(β-TG)，来确定凝血细胞的激活。β-凝血细胞球蛋白储存在凝血细胞中并在激活后释放。结果示于图9。图9示出在动态方法中在与未涂覆(PUR)或涂覆(PUR-PEI-AT III)的管接触之前(对照)和接触90分钟后β-凝血细胞球蛋白的释放。每个值被测定五次。图9显示相比PUR由PUR-PEI-AT III激活的凝血细胞少得多。

在进一步的试验中，通过测量凝血酶-抗凝血酶III(TAT)-复合物的形成来确定动态方法中温育之前(对照)和温育90分钟后全血中凝血酶的浓度，由此检验凝血酶形成的程度。五个独立的测量结果示于图10。这表明PUR-PEI-AT III相比PUR显著抑制凝血酶的形成以及血栓的形成。

在另一实验中检验白细胞的激活。存在于中性粒细胞中的PMN弹性蛋白酶在炎症期间释放。PMN弹性蛋白酶的释放表明白细胞被激活。在五个独立的测定中，测定动态 方法中温育之前(对照)和温育90分钟后全血中PMN弹性蛋白酶的浓度。结果示于图11。这表明在这种动态方法中PUR-PEI-AT III相比于PUR显著抑制白细胞的激活。

进行另一试验以比较不同等离子体对血栓形成的影响。为此目的，如上所述制备PUR。然而，PUR要么没有经等离子体激活(在图12中“对照”和“无等离子体”的情况下)，要么经氩等离子体、N₂-等离子体或CO₂改性的N₂-等离子体激活。氩等离子体是在4.5千伏产生的以每分钟10标准升气流量的冷氩等离子体。氮等离子体是在4.5千伏产生的以每分钟20标准升气流量的冷氮等离子体。在改性的N₂-等离子体的情况下，将医用级二氧化碳以每分钟1.7标准升的气流量加入至以每分钟20标准升气流量的氮气流。在等离子体处理的每种情况下，等离子束以5厘米/分钟的速度移动过PUR表面。在除了“无等离子体且无氯化钠”之外的所有情况下，将圆片在50℃在等渗盐溶液中温育2小时。用去离子水清洗圆片后，将PUR在水中的0.1M>

在对照的情况下，圆片的唯一处理包括用纯乙醇洗涤圆片10分钟并在室温下空气干燥圆片。

对于该试验，将圆片用ETDA血(使用CaCl₂再激活)温育两天。在此期间，圆片表面上可形成血栓。两天后，将圆片从血中取出、彻底洗涤并称重。获得的结果示于图12。结果表明，通过加入CO₂改性的N₂-等离子体对PUR具有积极的抗血栓形成效果。

结合所有这些数据表明，根据本发明的PUR具有突出的抗血栓形成效果并具有其它有利的特征。