一种有效靶向至三叉神经节的羟基酪醇滴眼液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种有效靶向至三叉神经节的羟基酪醇滴眼液及其制备方法。所述滴眼液包括羟基酪醇为主药以及防腐剂、等渗调节剂，聚乙烯己内酰胺‑聚乙酸乙烯酯‑聚乙二醇共聚物和利多卡因或其药学可接受的盐，羟基酪醇主药和聚乙烯己内酰胺‑聚乙酸乙烯酯‑聚乙二醇共聚物药物辅料质量比为1:18，利多卡因和聚乙烯己内酰胺‑聚乙酸乙烯酯‑聚乙二醇共聚物药物辅料质量比为1:18‑1:90。本发明具有良好的溶解性和稳定性，且胶束粒径可控，分布范围均一，储存稳定性良好。本发明通过眼表滴眼给药，药物有效靶向吸收至三叉神经节，从而提高了治疗糖尿病性角膜病变和神经病变的安全性，有效性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种滴眼液，特别涉及一种能有效靶向至三叉神经节的羟基酪醇滴眼液及其制备方法。

背景技术

我国的糖尿病患病率近几年快速增长，糖尿病已成为我国重大的公共卫生问题。患者长期的高血糖状态导致全身各组织器官发生病变，引起严重的糖尿病相关并发症，包括糖尿病性角膜病变。此外，糖尿病患者在角膜外伤或接受角膜手术时极易出现角膜上皮愈合延迟甚至不愈，临床表现为持续性角膜上皮损失、反复性角膜上皮糜烂、浅层角膜溃疡形成、继发严重角膜感染甚至失明，治疗棘手，预后差，患者的经济和精神负担严重。目前糖尿病性角膜病变的临床治疗手段有限，因此，研究糖尿病性角膜病变新的治疗靶标和有效防治措施具有重要的临床意义。

角膜神经来源于三叉神经节眼支，角膜内正常的神经分布对于维持角膜敏感度和角膜上皮完整性具有非常重要的作用。糖尿病引起的角膜神经病变是糖尿病性角膜病变的重要发病根源，与糖尿病性角膜病变的发生及预后密切相关。已有研究发现（Gao J, Wang Y, Zhao X, Chen P, Xie L. MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas. Investigative ophthalmology & visual science. 2015;56:1493-504.）：糖尿病病理状态不仅引起角膜/神经病变，也可引起三叉神经节（即角膜神经的神经元）的病变，糖尿病引起的角膜/神经病变与三叉神经节病变存在联系，而治疗三叉神经节病变可能有助于糖尿病性角膜病变的临床防治。

对于如何在糖尿病性角膜病变治疗中有效纠正三叉神经节的病变，已有研究报道和本专利申请发明人研究结果均表明目前眼科临床常规治疗药物（如滴眼给药）难以有效到达三叉神经节（Neubert JK, Mannes AJ, Keller J, Wexel M, Iadarola MJ, Caudle RM. Peripheral targeting of the trigeminal ganglion via the infraorbital foramen as a therapeutic strategy. Brain Res Brain Res Protoc. 2005;15:119-26.）。

本专利申请的发明人选用链脲佐菌素（STZ）诱导型Ⅰ型糖尿病模型小鼠为动物模型，检测了糖尿病病理状态下角膜和三叉神经节组织的氧化应激水平。结果表明糖尿病模型小鼠三叉神经节与角膜均检测到氧化应激水平失衡，且各氧化应激指标失衡趋势一致。因氧化应激失衡是包括糖尿病性角膜病变在内的周围神经病变发病的重要发病机制，研究结果提示糖尿病病理状态不仅可引起角膜/角膜神经的损伤（糖尿病性角膜病变），还可引起三叉神经节的损伤，同时结合角膜神经来源于三叉神经节这一解剖学特点，提示糖尿病病理状态引起三叉神经节损伤与糖尿病性角膜病变可能存在关联。即：在糖尿病性角膜病变中，“树根”三叉神经节同样受到损害，由此引起神经营养功能下降，角膜上皮修复延迟。

羟基酪醇是橄榄油的主要有效成分，药理研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗HIV、降血脂等多种药理活性，且毒副作用小，是一种具有良好发展前景的药物。发明人的研究表明羟基酪醇可促进糖尿病性角膜病变的角膜上皮和神经损伤后的修复。但是羟基酪醇的溶解度极低，生物利用度低，且羟基酪醇分子稳定性差，在水溶液中会快速降解。通过采用发明专利“一种环孢素A胶束滴眼液及其制备方法”（ZL201210529616.9）技术制备了羟基酪醇胶束滴眼液，在治疗效果性评价研究中，羟基酪醇胶束眼表给药可有效纠正角膜中的氧化还原失衡，但其对三叉神经节组织中的氧化还原失衡纠正有限，这是因为通过眼局部给药后，角膜组织吸收药物，但进一步转运至三叉神经节的药物量则显著下降，因此对三叉神经节中的氧化还原水平失衡调节作用弱。由此提示我们：眼科常用的眼表给药主要对“树梢”进行药物治疗，但药物通过受损的“树梢”有效转运至“树根”有限，尤其在外伤、眼科手术等进一步引起“树梢”损伤情况下，将眼表给药后的药物通过角膜神经吸收转运至三叉神经节受限，三叉神经节的病理状态得不到有效纠正，则会进一步影响角膜神经/上皮的修复。因此，在糖尿病性角膜病变治疗中，如能将药物有效递送至三叉神经节，纠正三叉神经节病理状态，将有助于角膜神经/上皮病变的治疗。因此，很有必要进一步探索既安全，又经济又有效的眼部治疗糖尿病性角膜病变和角膜神经病变的羟基酪醇药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种眼表滴眼给药后具有三叉神经节特异性靶向作用的羟基酪醇胶束滴眼液，通过提高羟基酪醇经眼表给药后靶向三叉神经节的效率，从而提高羟基酪醇治疗药物吸收糖尿病性角膜病变和神经病变的疗效，并弥补现有基于聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物构建的胶束溶液的稳定性差的不足，同时弥补常规的羟基酪醇水溶液的稳定性差的不足。

本发明的技术构思：将羟基酪醇制备成合适的制剂可有效用于治疗糖尿病性角膜病变和神经病变，但如何改善羟基酪醇的水溶性，又能保证其稳定性，是该制剂问题的难点。滴眼等眼表给药是眼科最常用的给药方法，但是糖尿病患者发生角膜和角膜神经损伤等病变后，药物不能够有效吸收至三叉神经节。聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物在溶液中能自组装形成一种核-壳结构的超分子有序聚集体—胶束。研究发现，这种特殊结构使得胶束能够在水溶液中良好分散，疏水端内核提供了疏水微环境，可增溶难溶性的羟基酪醇，并提高羟基酪醇分子稳定性。利多卡因为眼科常用的表面麻醉药，分子结构特点为含有苯环芳香基团的疏水端和含有氨基的亲水端的两亲性结构，聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物胶束滴眼液中加入利多卡因，利多卡因分子镶嵌在胶束结构中，使胶束结构更为紧密，使胶束包封的药物不易泄露，进一步提高胶束的稳定性。此外，研究还发现在羟基酪醇纳米胶束滴眼液中加入利多卡因，可有效促进滴眼后的三叉神经节的吸收。其作用机制可能为利多卡因对神经起到麻痹作用，短暂可行性使神经失去主动传输功能，从而加快了药物浓度梯度差引起的被动吸收与转运，将滴眼后角膜神经吸收的药物快速有效地转运至角膜神经的神经节—三叉神经节，从而提高了治疗作用。

本发明具体的技术方案：一种有效靶向至三叉神经节的羟基酪醇滴眼液，包括羟基酪醇为主药以及防腐剂、等渗调节剂，聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物和利多卡因或其药学可接受的盐，羟基酪醇主药和聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物药物辅料质量比为1:18，利多卡因和聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物药物辅料质量比为1:18-1:90。

所述聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物中聚乙烯己内酰胺、聚乙酸乙烯酯、聚乙二醇三者的质量比为57:30:13，共聚物总分子量118000。

本发明的羟基酪醇胶束滴眼液的制备方法如下：先将主药羟基酪醇和药物辅料聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇共聚物溶解在无水乙醇中，通过40℃水浴真空旋转蒸发有机溶剂在容器内部均匀成膜，再加入预先溶解有利多卡因的磷酸盐缓冲液以充分洗膜，水浴超声，充分溶解后再继续孵育30分钟，调整羟基酪醇最终质量百分浓度为0.5%，最后加入防腐剂、pH调节剂，等渗调节剂之后无菌过滤分装即可。其中防腐剂、pH调节剂，等渗调节剂可以按照已有技术添加。

所述羟基酪醇胶束滴眼液的制备方法，制得的羟基酪醇胶束粒径范围在35~70nm之间。

所述羟基酪醇胶束滴眼液的制备方法，使用的缓冲液为常用磷酸盐缓冲液，pH值调节为7.4。

本发明制备的羟基酪醇胶束滴眼液，使得羟基酪醇在水溶液中有良好的溶解性和稳定性，且胶束粒径可控，分布范围均一，羟基酪醇胶束滴眼液的储存稳定性良好。该羟基酪醇胶束滴眼液通过眼表滴眼给药，药物有效靶向吸收至三叉神经节，治疗糖尿病引起的三叉神经节病变，而三叉神经节病变有效治疗又有助于糖尿病性角膜病变的治疗。其制备方法，不但解决了羟基酪醇的水溶性、提高了羟基酪醇分子稳定性，提高了胶束水溶液的稳定性，并提高了给药后的三叉神经节靶向性，从而提高了治疗糖尿病性角膜病变和神经病变的安全性，有效性。

附图说明

图1是裂隙灯观察不同羟基酪醇胶束滴眼液对糖尿病小鼠角膜损伤修复作用图。

图2是不同羟基酪醇胶束滴眼给药对糖尿病小鼠角膜上皮缺损面积定量分析图。

图3是不同羟基酪醇胶束滴眼给药对糖尿病小鼠角膜神经缺损后修复作用图。

图4是不同羟基酪醇胶束滴眼给药对糖尿病小鼠角膜神经缺损后修复作用的定量分析图。

图5是不同羟基酪醇胶束滴眼液滴眼给药后三叉神经节中羟基酪醇浓度测定与比较图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来进一步详细说明本发明。

实施例1：

将50mg羟基酪醇和900mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇（分子量118000）置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，将50mg利多卡因溶解于10mL磷酸盐缓冲液，然后将该磷酸盐缓冲液倒入圆底烧瓶中，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液，继续40℃孵育30min，加入防腐剂苯扎氯铵使其终浓度为0.005%~0.02%，加入等渗调节剂氯化钠至溶液渗透压至270~330mOsm/kg，使用盐酸或者氢氧化钠将pH调节为6.8~7.4，将胶束溶液过0.22µm微孔滤膜后，无菌分装即可。激光粒度仪测得羟基酪醇胶束平均粒径为50.1nm，分散指数PDI=0.051，分散均一性良好。将该羟基酪醇胶束滴眼剂在室温条件下保存180天，稳定性没有明显改变。

实施例2：

将50mg羟基酪醇和900mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇（分子量118000）置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，将10mg利多卡因溶解于10mL磷酸盐缓冲液，然后将该磷酸盐缓冲液倒入圆底烧瓶中，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液，继续40℃孵育30min，加入防腐剂苯扎氯铵、等渗调节剂氯化钠，pH调节为7.4，将胶束溶液过0.22µm微孔滤膜后，无菌分装即可。激光粒度仪测得羟基酪醇胶束平均粒径为50.3nm，分散指数PDI=0.052，分散均一性良好。将该羟基酪醇胶束滴眼剂在室温条件下保存180天，稳定性没有明显改变。

实施例3：

将50mg羟基酪醇和900mg聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇（分子量118000）置于100mL圆底烧瓶中，加入20mL无水乙醇，充分溶解后，40℃水浴旋转真空蒸发无水乙醇，得到药物和共聚物的均匀分散薄膜，将25mg利多卡因溶解于10mL磷酸盐缓冲液，然后将该磷酸盐缓冲液倒入圆底烧瓶中，充分洗膜，300w功率水浴超声10min，得胶束溶液，继续40℃孵育30min，加入防腐剂苯扎氯铵、等渗调节剂氯化钠，pH调节为7.4，将胶束溶液过0.22µm微孔滤膜后，无菌分装即可。激光粒度仪测得羟基酪醇胶束平均粒径为49.8nm，分散指数PDI=0.048，分散均一性良好。将该羟基酪醇胶束滴眼剂在室温条件下保存180天，稳定性没有明显改变。

实验效果例1：本发明的0.5%羟基酪醇胶束滴眼液有效性试验。

实验药物：0.5%羟基酪醇胶束滴眼液（实施例1制备，称为溶液1）。

对照药物：未用利多卡因的0.5%羟基酪醇胶束滴眼液（除在制备过程中不加入利多卡因外，余同实施例1制备，称为溶液2）。

实验动物与实验方法：因链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠作为较公认的类似于人非增殖期糖尿病视网膜病变模型，本部分内容采用此模型进行研究。选用C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，体重18~25克（购买自北京维通利华实验动物技术有限公司）。动物随机分为两组，一组采用新鲜配置的柠檬酸盐缓冲液（pH 4.5）配制STZ溶液后对小鼠进行腹腔注射，连续注射5天，在最后一次（第五次注射）后的第8天（一周后）对每小鼠测量血糖，连续测量3天，STZ注射组血糖值大于300mg/dL（16.7mmol/L）认为Ⅰ型糖尿病模型成功。在12周实验取材时，对小鼠进行同样的体重和血糖监测，符合各参数指标和取组织材料的条件的小鼠用于实验。另一组注射不含STZ的柠檬酸缓冲液作为正常对照。实验结果表明，STZ腹腔注射建模的小鼠逐渐表现出多饮、多食、多尿、体重下降等糖尿病典型症状，其血糖稳定维持在较高水平，体重较正常小鼠偏低（表1），表明造模成功。

小鼠成模12周后行角膜上皮刮除术建立糖尿病角膜/神经损伤模型，分别采用滴眼给药给予空白磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）、溶液1和溶液2进行治疗1周，观察和比较小鼠角膜上皮和神经的修复。研究发现：给药溶液1有效促进模型小鼠角膜上皮（图1和图2）和神经（图3和图4）的修复且疗效优于空白PBS溶液组和溶液2组。

PBS溶液对照组的角膜修复为24 h: 62.5±3.54%; 48 h: 4.25±2.47%;72 h: 0。溶液1组的角膜修复为24 h: 72.11±4.24%; 48 h: 21.07±6.36%; 72 h: 2.92±1.35%。溶液2组的角膜修复为24 h: 81.50±0.71%; 48 h: 49.50±2.12%; 72 h: 19.09±3.13%，相比于PBS溶液对照组，给药溶液2有效促进模型小鼠角膜上皮（各时间点P < 0.05）（图1和图2），而相比于给药溶液2，给药溶液1有效促进模型小鼠角膜上皮（各时间点P < 0.05）（图1和图2）。在神经修复方面，PBS溶液对照组的角膜外周神经和角膜中央区神经密度分别为46.36±13.07%和38.84±15.83%，溶液2组的的角膜外周神经和角膜中央区神经密度分别为66.37±20.65%和54.55±8.74%，溶液1组的的角膜外周神经和角膜中央区神经密度分别为88.18±8.59%和68.60±12.48%，相比于PBS溶液对照组，给药溶液2有效促进模型小鼠角膜上皮（各时间点P < 0.05），而相比于给药溶液2，给药溶液1有效促进模型小鼠角膜上皮（各时间点P < 0.05）（图3和图4）。

表1 正常和糖尿病模型小鼠在取样点时体重及血糖检测（±SD，n=30）

实验效果例2：本发明的0.5%羟基酪醇胶束滴眼液滴眼给药后三叉神经节吸收试验。

实验药物：0.5%羟基酪醇胶束滴眼液（实施例1制备，称为溶液1）。

对照药物：未用利多卡因的0.5%羟基酪醇胶束滴眼液（除在制备过程中不加入利多卡因外，余同实施例1制备，称为溶液2）。

选用C57BL/6小鼠，雄性，6-8周龄，体重18~25克（购买自北京维通利华实验动物技术有限公司）。动物随机分为两大组，每一大组又分为8小组。两大组小鼠分别给予溶液1和溶液2滴眼给药，5微升/眼/次，双眼给药，每次给药后间隔10分钟，连续给药4次，最后一次给药结束后开始计时，分别在给药后的15分钟、1、2、3、4、6、8、10小时处死小鼠，分离角膜和三叉神经节组织，每只小鼠的两个角膜和两个三叉神经节组织合并为一个样本，称重，使用甲醇按每毫克组织60微升甲醇的量进行匀浆，匀浆后10000g进行高速离心，取上清，0.45微米微孔滤膜过滤后使用高效液相色谱仪进行测定羟基酪醇的含量。研究结果表明给药治疗溶液1实验组三叉神经节中羟基酪醇浓度远远明显高于溶液2实验组，最大浓度提高了10.3倍（图5）。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。