一种靶向hedgehog通路和细胞自噬的抗肿瘤药物组合物

摘要

本发明属药物技术领域，涉及靶向hedgehog通路和细胞自噬的抗肿瘤药物组合物，该药物组合物包含Hedgehog信号通路抑制剂和细胞自噬抑制剂，经药效学试验证明，该药物组合物在实体瘤和非实体瘤的治疗方面具有显著的协同作用，尤其是对耐药性的慢性髓性白血病有非常显著的抗肿瘤效果。本发明公开的药物组合物具有广泛的抗肿瘤活性，有很好的临床应用前景。

说明书

技术领域

本发明属药物技术领域，涉及靶向hedgehog通路和细胞自噬的抗肿瘤药物组合物，该药物组合物包含Hedgehog信号通路抑制剂和细胞自噬抑制剂，能用于治疗实体瘤和非实体瘤。

背景技术

研究公开了Hedgehog(Hh)信号通路是调节动物胚胎发育的主要信号通路之一，在哺乳动物细胞存活、增殖和细胞命运的调节中起关键作用，是目前最受关注的抗肿瘤靶点之一(Briscoe J，Thérond PP.[J].Nat Rev Mol Cell Biol 2013，14(7)：418-431)。越来越多的研究表明，Hh信号通路的异常激活与基底细胞癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、前列腺癌和消化道肿瘤等有密切关系(Briscoe J，Thérond PP.[J].Nat Rev Mol CellBiol 2013，14(7)：418-431；Jagani Z，Dorsch M，Warmuth M.[J]；Cell Cycle 2010，9(17)：3449-3456.Long B，Zhu H，Zhu C，Liu T，Meng W.[J].Journal of Experimental&Clin Cancer Res 2011，30(1)：8.)。Vismodegib是国际上第一个被批准上市的Hh通路抑制剂，口服给药用于基底细胞癌的治疗。目前，多种Hh信号通路抑制剂正在进行癌症治疗的临床评价，包括CML和骨髓瘤等(David A.Irvine and Mhairi Copland.Blood 2012，119(10)：2196-2204.)。

研究表明Hh信号通路主要由信号分子Hh配基、跨膜蛋白受体Patched(PTCH1)、跨膜蛋白Smoothened(SMO)、融合阻抑蛋白SUFU和锌指转录因子GLI等组成；其中PTCH1会抑制SMO，从而关闭Hh信号通路；当Hh与配体PTCH1结合后，PTCH1就会失去对SMO的抑制作用，从而激活Hh信号通路、阻止GLI2和GLI3的剪切；激活的GLI2与细胞核内的GLI启动子结合，刺激GLI1、PTCH1、HHIP、Bcl-2和Cyclin等基因的转录(DereckAmakye，Zainab Jagani&Marion Dorsch.Nature Medicine 2013，19(11)：1410-1422.)。目前已经上市或正处于临床研究阶段的Hedgehog信号通路抑制剂分为如下三类：(1)SMO抑制剂；包括vismodegib、环巴胺、saridegib(IPI-926)、sonidegib(LDE225)、BMS-833923、PF04449913、LEQ506、TAK-441、LY2940680；2)Hh蛋白抑制剂；包括Robotnikinin；(3)GLI抑制剂；包括GANT61、GANT58、HIP-1、HIP-2、HIP-3、HIP-4、 三氧化二砷。

细胞自噬是真核生物细胞中一种高度遗传保守的蛋白质水解途径。外界压力如营养或生长因子剥夺、氧化压力和药物处理等均能诱导细胞发生自噬(Choi AMK，Ryter SW，Levine B.[J].N Engl J Med 2013，368(7)：651-662.)；研究表明，细胞自噬在肿瘤发生、发展和治疗中起着重要的作用(Cheong H，Lu C，Lindsten T，Thompson CB.[J].Nat Biotechnol 2012，30(7)：671-678.)。在大多数情况下，细胞自噬在抗肿瘤药物杀伤肿瘤细胞的过程中起细胞保护作用。此外，研究表明肿瘤细胞可通过上调细胞自噬水平来削弱抗肿瘤药物的效果，引起肿瘤耐药。因此，近年来细胞自噬在癌症治疗中的作用受到了越来越多的关注，调控细胞自噬也成为了最热门的抗肿瘤策略之一。氯喹和羟基氯喹作为抗疟药物已经在临床上使用了几十年之久，其安全性的诸多因素已久经考验。同时，氯喹和羟基氯喹是又一种有效的细胞自噬抑制剂，已经被美国FDA批准作为细胞自噬抑制剂在临床上使用。目前，通过调节细胞自噬来增强抗肿瘤药物的疗效的多项临床试验正在进行之中(Rosenfeld MR，Ye X，Supko JG，Desideri S，Grossman SA，Brem S，et al.Autophagy 2014；10；PMID：24991840；Rangwala R，Leone R，ChangYC，Fecher L，Schuchter L，Kramer A，et al.Autophagy 2014；10；PMID：24991839；Vogl DT，Stadtmauer EA，Tan KS，Heitjan DF，Davis LE，Pontiggia L，et al.Autophagy 2014；10；PMID：24991834；Mahalingam D，Mita M，Sarantopoulos J，WoodL，Amaravadi R，Davis LE，et al.Autophagy 2014；10；PMID：24991835；BarnardRA，Wittenburg LA，Amaravadi RK，Gustafson DL，Thorburn A，Thamm DH.Autophagy2014；10；PMID：24991836；)。

研究还显示Hh信号通路与细胞自噬具有密切联系。例如：在Hela细胞中，激活Hh信号通路能减弱细胞自噬的程度，抑制Hh信号通路则可以诱导细胞自噬(Jimenez-Sanchez M，Menzies FM，Chang Y-Y，8imecek N，Neufeld TP，RubinszteinDC.The Hedgehog signalling pathway regulates autophagy[J].Nat Commun 2012，3：1200.)。在肝癌细胞中，Hh信号通路与细胞自噬相互调节。Hh抑制剂GANT61能诱导肝癌细胞自噬，抑制细胞自噬则能削弱GANT61对肝癌细胞的细胞毒性(Wang Y，Han C，Lu L，Magliato S，Wu T.[J].Hepatology 2013，58(3)：995-1010.)。Gli1蛋白是Hh信号通路里的关键调节蛋白，抑制Gli1会导致软骨肉瘤细胞发生细胞凋亡和细胞自噬(Sun Y，Guo W，Ren T，Liang W，Zhou W，Lu Q，Jiao G，Yan T.[J].Cell DeathDis 2014，5(1)：e979.)；等等

目前，尚未见任何关于hedgehog信号通路抑制剂和细胞自噬抑制剂为活性成分的组合物或二者联合用于抗肿瘤的临床研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前临床上现有的肿瘤治疗药物或策略的缺点如毒副作用大、耐药性和治疗成本高等，提出一种毒副作用较小、能逆转肿瘤耐药性和较为廉价的治疗肿瘤的药物组合物，具体涉及一种靶向hedgehog通路和细胞自噬的抗肿瘤药物组合物。

为了实现本发明的目的，本申请通过一系列的设计并经科学试验验证，提出了含有如下组分的肿瘤治疗药物组合物：1)Hedgehog信号通路抑制剂；2)细胞自噬抑制剂。

具体而言，本发明提供了一种靶向hedgehog通路和细胞自噬的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，该药物组合物由Hedgehog信号通路抑制剂和细胞自噬抑制剂组成。

本发明中，所述的Hedgehog信号通路抑制剂包括但不限于如下三类：(1)SMO抑制剂；(2)Hh蛋白抑制剂；(3)GLI抑制剂；

具体的，所述的Hedgehog信号通路抑制剂选自vismodegib、环杷明(cyclopamine)、sonidegib(LDE225)、BMS-833923、PF04449913、LEQ506、TAK-441、LY2940680、Robotnikinin、GANT61、GANT58、HIP-1、HIP-2、HIP-3、HIP-4、三氧化二砷或其组合物。

本发明中，所述的细胞自噬抑制剂选自氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine)、3-MA(3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)、NH4Cl或其组合物；本发明的实施例中，优选的细胞自噬抑制剂为氯喹、羟基氯喹或巴伐洛霉素A1。

本发明所述的药物组合物中，Hedgehog信号通路抑制剂与细胞自噬抑制剂的给药剂量比为1∶0.001-1000。

本发明所述的药物组合物可制成为口服制剂或注射制剂，在本发明的实施例中，所述的药物组合物以选自以下一组中的形式进行配方：固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体、纳米微球等。

本发明的另一目的是提供所述的组合物在治疗实体瘤和非实体瘤中的用途。

本发明经药效学试验证明，所述的药物组合物在实体瘤和非实体瘤的治疗方面具有显著的协同作用，尤其是对耐药性的慢性髓性白血病有非常显著的抗肿瘤效果。

本发明的药物组合物具有广泛的抗肿瘤活性，可用于治疗各种实体瘤和非实体瘤，所述实体瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、基底细胞癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、大肠癌、前列腺癌或头颈癌等恶性肿瘤；所述非实体瘤包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等恶性肿瘤。

附图说明

图1.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib对淋巴瘤和白血病肿瘤细胞的生长抑制作用。

图2.显示vismodegib和CQ联合使用能显著降低CML细胞活力，

其中，*p＜0.05，**p＜0.01。

图3.显示vismodegib和Bafi A1联合使用能显著降低CML细胞活力，

其中，*p＜0.05，**p＜0.01。

图4.vismodegib和CQ联合使用能显著降低淋巴瘤细胞活力，其中，***p＜0.001。

图5.通过基因沉默抑制Hedgehog信号通路与CQ联合应用能显著降低CML细胞活力，其中，**p＜0.01.

图6.通过基因沉默抑制细胞自噬与vismodegib联合应用能显著降低CML细胞活力，其中，**p＜0.01.

图7.vismodegib和CQ联合使用能显著逆转CML的耐药性。

图8.Vismodegib与CQ联合使用能显著地诱导了CML细胞凋亡，

其中，**p＜0.01，与vismodegib单独给药组相比；***p＜0.001，与vismodegib单独给药组相比。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过对本发明中典型的具体实施例的描述，详细解释说明本发明，但不以任何形式限制本发明的保护范围。

实施例1.肿瘤细胞培养

体外试验中所用的肿瘤细胞包括淋巴瘤细胞(Raji)和慢性髓性白血病(CML)细胞(K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F)。

需要做出特别说明的是：K562是CML研究中使用最普遍的细胞模型，对CML的 现有临床治疗一线用药伊马替尼(Imatinib)敏感；而BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F细胞是CML耐药性研究中使用最普遍的细胞模型，所述三株细胞分别由如下本领域已知的方法获得：向BaF3细胞中分别转入野生型BCR-ABL基因、T315I位点突变的BCR-ABL基因和Y253F位点突变的BCR-ABL基因，建立稳定转染细胞株而得；其中，BaF3-BCR-ABL细胞为伊马替尼敏感型细胞株，BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F为伊马替尼耐药性细胞株；

所述的Raji、K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F细胞均使用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的PRMI-1640培养基培养于37℃、含5％二氧化碳的细胞培养箱中。

实施例2.体外药效研究中自噬抑制剂的配制方法

(1)氯喹的配制：取适量氯喹溶于双蒸水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验临用时用细胞培养基稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

(2)羟基氯喹的配制：取适量羟基氯喹溶于双蒸水配成10mmol/L的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于4℃，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；

(3)巴伐洛霉素A1的配制：取适量巴伐洛霉素A1干粉配制成0.5μg/ml的储存液，用0.1μm的滤器过滤除菌后保存于-20℃，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬；

(4)自噬抑制剂与Hedgehog信号通路抑制剂联合应用于体内或体外抗肿瘤时，自噬抑制剂CQ的使用浓度范围为0-50mol/L，羟基氯喹的使用浓度范围为0-50mol/L，巴伐洛霉素A1的使用浓度范围为0-10mol/L。

实施例3.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib对淋巴瘤和白血病肿瘤细胞的生长抑制作用实验

分别将2.5、5、10、20和40μM的vismodegib与Raji、K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F细胞共孵育48h，用CCK-8法检测细胞活力，结果显示，vismodegib能有效降低5种肿瘤细胞的活力，且这种生长抑制效果呈现一定的剂量依赖性(如图1所示)。

实施例4.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib和细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)联合使用能显著降低CML细胞活力

分别将2.5、5或10μM的CQ与20μM的vismodegib联合使用与K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F细胞共培养48h，用CCK-8方法检测细胞活力或在倒置相差显微镜先观察细胞形态并拍照，结果，与单独使用vismodegib相比，各个浓度的CQ与vismodegib联合使用均能显著降低肿瘤细胞活力(如图2(A)所示)；图2(B)显示了具有代表性的相差显微镜图片，其中vismodegib和CQ的使用浓度分别为20μM和10μM。

实施例5.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib和细胞自噬抑制剂巴伐洛霉素A1(BafiA1)联合使用能显著降低CML细胞活力

分别将1.25、2.5或5nM的Bafi A1与20μM的vismodegib联合使用与K562、BaF3-BCR-ABL、BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F细胞共培养48h，用CCK-8方法检测细胞活力，结果显示，与单独使用vismodegib相比，各个浓度的Bafi>

实施例6.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib和细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)和巴伐洛霉素A1(Bafi A1)联合使用能显著降低淋巴瘤细胞活力

分别将CQ或Bafi A1和20μM的vismodegib联合使用与淋巴瘤Raji细胞共孵育48h，用CCK-8法检测细胞活力，或在倒置相差显微镜先观察细胞形态并拍照，结果显示，与单独使用vismodegib相比，各个浓度的CQ或Bafi A1与vismodegib联合使用均能显著降低肿瘤细胞活力，联用组细胞非常稀少且形态异常(如图4所示)，图中还显示了具有代表性的相差显微镜图片，其中vismodegib、CQ和Bafi A1的使用浓度分别为20μM、10μM和2.5nM。

实施例7.通过基因沉默抑制Hedgehog信号通路与细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)联合应用能显著降低CML细胞活力

采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默Hedgehog信号通路中的关键调节基因SMO，从而使肿瘤细胞中Hedgehog信号通路受到抑制；与此同时，给予肿瘤细胞CQ处理，用CCK-8法检测细胞活力：运用lipofactamine 2000转染试剂将对照siRNA或SMOsiRNA瞬时转入K562细胞中，转染24h后，用10μM的CQ处理细胞48h，用CCK-8 法测定细胞活力；或者转染siRNA48h后，检测细胞内SMO基因的mRNA表达水平，结果如图5(A)所示，与转染对照siRNA的细胞相比，转染SMO siRNA的细胞内SMO基因的mRNA表达水平显著降低，表明本试验中运用的siRNA技术成功地抑制了K562细胞的SMO的表达，表明着Hedgehog信号通路被成功抑制；结果还显示，与单独转染SMO siRNA组相比，SMO siRNA转染和CQ联用组的细胞活力显著下降，表明Hedgehog信号通路抑制与细胞自噬抑制剂同时运用能显著降低肿瘤细胞的细胞活力(如图5(B)所示)；

实验结果表明，通过基因敲除手段抑制Hedgehog信号通路的同时，联合使用细胞自噬抑制剂能显著杀伤CML细胞。

实施例8.通过基因沉默抑制细胞自噬与Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib联合应用能显著降低CML细胞活力

采用小干扰RNA(siRNA)技术沉默细胞自噬的关键调节基因ATG5或ATG7，从而使肿瘤细胞中细胞自噬受到抑制。与此同时，给予肿瘤细胞Hedgehog信号通路抑制剂处理，用CCK-8法检测细胞活力：运用lipofactamine 2000转染试剂将对照siRNA或ATG5 siRNA或ATG7 siRNA瞬时转入K562(图6A、B和C所示)或BaF3-BCR-ABL^T315I(图6D、E和F所示)细胞中，转染24h后，用20μM的vismodegib处理细胞48h，用CCK-8法测定细胞活力或者提取细胞总蛋白检测细胞自噬标志性蛋白MAP1LC3B-II的表达情况，结果如图6(A、B、D和E)所示，与转染对照siRNA的细胞相比，转染ATG5>

实验结果进一步验证了抑制细胞自噬在Hedgehog信号通路与细胞自噬抑制剂联合使用抗肿瘤中的关键作用。

实施例9.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib和细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)联合使用能显著逆转CML的耐药性

分别将10μM的CQ与10或20μM的vismodegib联合使用与伊马替尼敏感型白血 病细胞(K562、BaF3-BCR-ABL)或伊马替尼耐药性白血病细胞(BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F)细胞共培养48h。以上四株细胞用0.1或1μM的伊马替尼处理相同时间作为对阳性照组，用CCK-8方法检测细胞活力，结果如图7所示，vismodegib与CQ联用能显著降低伊马替尼敏感型白血病细胞(K562、BaF3-BCR-ABL)，此时伊马替尼作为阳性药物也能达到相似的效果；对于伊马替尼耐药性白血病细胞(BaF3-BCR-ABL^T315I和BaF3-BCR-ABL^Y253F)，vismodegib与CQ联用依然能显著降低其细胞活力，而阳性药物伊马替尼则不具有类似效果，图中的相差显微镜图片将实验结果更直观地呈现了出来；

实验结果证明Hedgehog信号通路抑制剂和细胞自噬抑制剂联合使用能有效逆转CML的耐药性，具有非常重要的临床意义。

实施例10.Hedgehog信号通路抑制剂vismodegib和细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)联合使用能显著诱导CML细胞发生细胞凋亡

将10μM的CQ与20μM的vismodegib联合使用与K562、BaF3-BCR-ABL和BaF3-BCR-ABL^T315I细胞共培养12h、24h或48h。提取细胞总蛋白用western>

本发明的上述实验结果表明，CQ与vismodegib联合使用能显著地诱导肿瘤细胞凋亡。