一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系

摘要

本发明公开了一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系，包括以下步骤：1)弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液对MDCK细胞进行消化；待细胞变圆后终止消化；然后将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬，获得细胞重悬液；3)将步骤2)中获得的细胞重悬液置于摇床中并放入培养箱中培养，用无血清培养基将细胞重悬液稀释，进行传代，得到MDCK细胞系；该MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞系培养驯化领域，具体涉及一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法及通过该制备方法获得的MDCK细胞系。

背景技术

犬肾脏上皮细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)被视为最适用于甲、乙型流感病毒疫苗生产的细胞系之一，可被用于代替鸡胚培养流感病毒。目前已经开发了利用MDCK细胞系代替鸡胚培养流感病毒的微载体贴壁培养生产工艺方法，虽然此工艺方法以可达到的一定的生产规模，然而还是存在一定的缺陷：1、微载体难以多次重复使用，造成生产成本提高；2、贴壁细胞的培养密度受到贴壁面积的限制，致使病毒产量的下降；3、贴壁培养通常需添加血清以帮助细胞贴附和生长，需要进行换液，工艺复杂，并且会引入支原体、衣原体或动物蛋白的污染，对疫苗产品的安全性造成潜在威胁。而采用无血清全悬浮培养MDCK细胞的技术，可以克服贴壁培养的缺点，但是需要对MDCK细胞进行驯化。间接法驯化无血清悬浮培养MDCK细胞分为两个阶段进行，首先，用无血清培养基驯化贴壁MDCK细胞，使其可在无血清条件下贴壁生长；然后用无血清培养基继续驯化，使其在不需要载体的悬浮状态下生长。现有技术中有采用SIMF8商品化的培养基，以间接替代有血清培养基的循环驯化方法进行MDCK细胞悬浮培养的驯化，经过20周以上的驯化法，获得MDCK.SUS2悬浮生长的细胞；此外，采用SFM4Mega Vir商品化的无血清培养基分别用直接适应无血清法(耗时3周)和间接适应无血清法(耗时2个月)驯化使得MDCK细胞能在悬浮培养模式下生长。但是通过以上方法驯化获得的MDCK悬浮细胞都经过适应无血清培养后再驯化悬浮培养的过程，大都存在驯化时间长、步骤繁琐、细胞结团、或细胞大小不均一等缺陷，达不到高密度生长要求。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，该制备方法以更短的周期和更少的代次驯化得到全悬浮培养的适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系，该MDCK细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物制品的大规模生产。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系。

作为本发明的一种优选的方案：所述用于培养MDCK细胞的培养基为含10％新生牛血清的DMEM培养基。

作为本发明的一种优选的方案：步骤1)中，所述含胎牛血清的培养基为含10％胎牛血清的培养基。

作为本发明的一种优选的方案：所述步骤3)中，将MDCK细胞至少传代至第6代。

作为本发明的一种优选的方案：所述无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

作为本发明的一种优选的方案：所述剪切力保护剂为嵌段式聚醚F68。

作为本发明的一种优选的方案：所述抗细胞结团剂为硫酸葡聚糖。

作为本发明的一种优选的方案：所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到无血清培养基。

本发明的另一个目的在于提供一种MDCK细胞系，该MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：通过上述制备方法获得。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的制备方法采用一步法，以更短的周期和更少的代次直接将需要血清贴壁的培养的细胞驯化成无血清的全悬浮细胞，驯化过程只需2周，在效率上远远优于已有技术；

2、本发明的制备方法所使用的无血清培养基不含动物血清、成本低；支持MDCK单细胞高密度全悬浮培养，其成分明确、容易配制并且使用方便；

3、本发明的无血清培养基配合本发明的制备方法，有效地缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间，提高了生产的效率，获得了高质量的全悬浮细胞；

4、本发明的MDCK细胞系的细胞密度高，呈单个分散生长，形态饱满，大小均一，活性大，适用于生物反应器无血清悬浮培养。

附图说明

图1为实施例1中贴壁状态下MDCK细胞形态图；

图2为实施例1中经无血清培养基驯化下的MDCK细胞形态图；

图3为实施例1中采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞形态图；

图4为实施例1中采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMI F8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞形态图；

图5为实施例2MDCK细胞的活细胞密度和细胞活性曲线图。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DMEM培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含10％胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，至少传代至第6代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系。

其中，无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 500～2500mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 20～150mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

其中，核苷酸中选用次黄嘌呤和胸苷，能促进MDCK细胞的核苷酸合成，保证细胞的生长；次黄嘌呤和胸苷成分太高，会抑制细胞生长；

其中，其他添加物中选用柠檬酸铁铵，用以替代转铁蛋白发挥其原有作用，不影响细胞生长与铁代谢，且能减少无血清培养基中的动物蛋白成分，降低培养基成本和对生产的不确定性和不安全性；柠檬酸铁铵依靠二价金属离子通道DMT1吸收铁，转铁蛋白通过转铁蛋白受体吸收铁，前者比后者提高了MDCK细胞对铁的吸收速率；柠檬酸铁铵成分浓度过高会抑制MDCK细胞生长；浓度太低，MDCK细胞对铁的吸收不足；

其中，其它添加物中胰岛素的浓度在2～15mg/L，能促进葡萄糖代谢，保证MDCK细胞的生长和维持MDCK细胞的活性；

其中，其它添加物中大豆水解物的浓度在1000～5000mg/mL，能保证维生素、金属离子、氨基酸等其他辅因子的供给，提高MDCK细胞对氨基酸的摄取；

所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.3～6.7，定容后得到无血清培养基。

具体实施例：

实施例1

一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DMEM培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含10％胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代，传代到第6代，获得适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系。

其中，无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 500～2500mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 20～150mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 1000～3000mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 5～15mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.5，定容后得到无血清培养基。

通过贴壁培养和通过本实施例获得的MDCK细胞形态比较如图1-4所示：

图1为贴壁状态下MDCK细胞贴附于培养介质表面，呈铺路石状；

图2为本实施例无血清培养基驯化得到的全悬浮培养的MDCK细胞的形态，细胞呈单个分散状，无结团现象，细胞形态完整，边界光滑清晰，大小均一；

图3为采用Hyclone公司无血清培养基SFM4 Mega Vir通过直接驯化法得到的悬浮培养的MDCKS细胞，图片来源：张良艳,姚志东,等.MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用.生物技术通讯.2013,24(3):382-384；图中可见，多个细胞聚集成团，少见单个细胞，细胞大小不均一；

图4为采用Gibco公司开发的商业无血清培养基SMIF8间接法驯化得到的MDCK.SUS2细胞；图片来源：V.Lohr,Y.Genzel,et al.A new MDCK suspension linecultivated in a fully defined med ium in stirred-tank and wavebioreactor.Vaccine.2010,28(3):6256-6264；图中所见，在该无血清培养基中悬浮培养时细胞形态也呈聚集状，但聚团较小，细胞大小不均一，状态略欠。

在本实施例将贴壁培养的MDCK细胞驯化为悬浮培养状态，该细胞呈单个分散生长，细胞形态饱满，大小均一；细胞质量高。

实施例2

一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DMEM培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含10％胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代。

其中，无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1600mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 50mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.5，定容后得到无血清培养基。

本实施例得到的MDCK细胞的活细胞密度和细胞活性如图5所示:需血清贴壁培养的MDCK细胞在无血清培养基中驯化6代以后(驯化后第13d)，细胞生长逐渐稳定，细胞活性保持在95％以上。由此可以证明，通过本实施例的制备方法使需血清贴壁培养的MDCK细胞适应悬浮培养并稳定生长只需2周，大大缩短了MDCK细胞由贴壁细胞驯化成无血清的全悬浮细胞驯化时间。

实施例3

一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DMEM培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含10％胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，经过2代培养后将培养的细胞重悬液转入摇瓶，转速提升至120rpm；每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代。

其中，无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 1000mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 25mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

其它添加物：

所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.4，定容后得到无血清培养基。

实施例4

一种适应无血清全悬浮培养的MDCK细胞系的制备方法，包括以下步骤：

1)将需血清贴壁培养的MDCK细胞用10％新生牛血清的DMEM培养基培养至细胞汇合度达到80～90％时，弃去培养MDCK细胞的培养基，用胰酶溶液清洗细胞层后弃去溶液；再次加入胰酶溶液至覆盖MDCK细胞进行消化5～15min；待细胞变圆后加入含10％胎牛血清的培养基终止消化；然后收集细胞悬液，并将细胞悬液离心后弃上清，获得细胞团；

2)将步骤1)中获得的细胞团用无血清培养基进行重悬至细胞密度1.3～1.6×10⁶cells/mL，获得细胞重悬液；

3)将步骤2)中获得的细胞重悬液加入方瓶，在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂的条件下置于摇床中并放入培养箱中培养，每隔48h用新鲜的无血清培养基将细胞重悬液稀释至细胞密度为1.3～1.6×10⁶cells/mL，进行传代。

其中，无血清培养基中，各组分的浓度为：

基础代谢营养物:

核苷酸:

维生素:

无机盐：

剪切力保护剂：

嵌段式聚醚F68 2200mg/L；

抗细胞结团剂：

硫酸葡聚糖 100mg/L；

酸碱度缓冲剂：

碳酸氢钠 2200mg/L；

酸碱度指示剂：

酚红 8mg/L；

流感病毒增殖促进剂：

胆固醇 6.26mg/L；

其它添加物：

所述无血清培养基通过以下步骤制得：

1)制备混合液：将原料混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10～30℃溶剂中溶解，得到混合液；

2)调节pH：调节混合液的pH至6.7，定容后得到无血清培养基。

将实施例2-4获得的培养基进行特性试验：

1、仪器：Bio-Bundle生物反应器(购自荷兰Applikon Biotechno logy公司)，罐体体积为3L；

2、用于对照的MDCK细胞系通过商品化无血清培养基SFM4 Mega Vir(购自Hyclone公司)培养得到；

3、培养方法：以0.5×10⁶cells/mL的细胞密度接种细胞至生物反应器中，在37℃、5％CO₂的条件下进行批培养，每24h取样进行活细胞计数，并计算细胞生长速率；结果如表1、表2所示：

表1最高活细胞密度(10⁶cells/mL)

表2细胞生长速率及倍增时间

与对照组商业化无血清培养基SFM4 Mega Vir悬浮培养的MDCK细胞相比，采用本发明所提供的无血清培养基，在培养过程中支持的活细胞密度有大幅度的增长；此外，在非指数生长期细胞的比生长速率从对照的0.57d^-1最大增长到实施例2中的0.91d^-1，细胞倍增时间则从对照的0.79d最大缩短至实施例2中的0.32d。可见采用本发明的制备方法获得的MDCK细胞，在细胞生长速率和细胞活性均有较大的提高。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。