一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗脓毒症药物或者制剂中的应用

摘要

本发明公开了白介素‑1β（IL‑1β）优化的脐带间充质干细胞来源外泌体在治疗脓毒症中的应用，具体涉及用重组人的IL‑1β优化处理人脐带间充质干细胞，使其免疫抑制功能增强，提取其产生的外泌体用于脓毒症的治疗。所述外泌体能有效缓解脓毒症症状，增加脓毒症小鼠的生存率，且这种外泌体还具有保存和运输方便的优势，这就为脓毒症等难治性炎症相关疾病的治疗提供了新的策略。

说明书

技术领域

本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体、外泌体的制备方法及其用途，具体是用IL-1β优化处理后的间充质干细胞产生的外泌体在脓毒症治疗中的应用。

背景技术

脓毒症(sepsis)一种严重的由感染引起的系统性炎症。其发病过程包括全身性的炎症爆发，伴随多器官功能障碍综合症、急性呼吸窘迫综合症和循环系统崩溃等，最终导致死亡。对这种疾病目前仍缺乏有效的治疗手段，其死亡率在重症病人中居高不下。自从2011年撤销Xygris和Eritoran的使用后，目前还没有针对脓毒症的有效药物。因此，急需开发新的有效的治疗手段。

间充质干细胞(MSCs)是一群具有多向分化潜能的多能干细胞，几乎存在于所有组织中。除了分化功能外，MSCs还具有显著的免疫调节功能、低免疫源性、易于在体外分离培养和迅速扩增的特性，这使得MSCs在免疫性和炎症性相关疾病的细胞治疗方面备受关注。然而，最近的研究发现，静息状态的MSCs免疫调节功能很弱，疗效欠佳；在炎症因子如IFN-γ、TNF-α、IL-1β和NO等的刺激活化后，MSCs能更加有效地发挥其免疫调节功能。因此，可以在体外培养过程中用炎症因子对MSCs进行优化处理，以提高MSCs的免疫调节功能，改善其治疗效果。

然而MSCs的临床应用仍面临着许多挑战，包括体外培养MSCs的不均一性、细胞注射导致的血管阻塞、细胞移植后在体内存活有限、衰老引起的遗传不稳定性或功能丧失等。更为严重的是MSCs用于临床还存在恶性转变及致瘤的可能性。鉴于这些结果，潜在的MSCs临床转化的选择应慎重考虑。

值得关注的是，MSCs在静息或活化状态下能分泌大量的外泌体(exosome)，这些外泌体携带了MSCs的重要信号分子，如蛋白质、mRNAs、miRNAs和ncRNAs等，参与细胞间的通讯并调控细胞功能。许多研究证实MSCs来源的外泌体保持着与其母细胞相似的生物学功能。而外泌体的的直径足够小(30-150nm)，不仅可以快速通过毛细血管到达病损部位，还可以透过血脑屏障等其他屏障，其作用范围将比细胞更加广泛；且外泌体具有便于储存和运输的优势。同时也避免了直接注射MSCs的不利生物学效应，减少了临床风险。

我们首次提取了用IL-1β优化的MSCs产生的外泌体，应用于小鼠脓毒症的治疗中，取得了良好的治疗效果。与传统的细胞治疗相比，外泌体具有稳定性好、保存及应用方便快捷的特点。与静息状态MSCs来源的外泌体(MSC-exo)相比，IL-1β优化的MSCs来源外泌体(βMSC-exo)的治疗效果更强。

发明内容

本发明提供一种IL-1β优化的人脐带间充质干细胞来源的外泌体(βMSC-exo)、该外泌体的制备方法及其在治疗脓毒症中的应用。这种外泌体能有效增加脓毒症模型小鼠的生存率，加强体内细菌清除率，降低全身炎症反应，缓解组织器官损伤的作用。

本发明所述外泌体来源于体外优化的脐带间充质干细胞，并经过一定方法提取，可以在-80度冰箱中长期保持活性(至少1年)。

制备间充质干细胞之后，将间充质干细胞按以下方法进行IL-1β的优化：取第3-7代的间充质干细胞接种于10cm培养皿中，待细胞融合达到60-70％时，加10ng/ml重组人IL-1β(美国PeproTech公司)处理12-24小时。用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞两次，更换含无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时，无菌收集培养上清，用于提取外泌体。

所述的外泌体按以下方法制备而得：将收集的培养上清于4℃、2,000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒；小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入注射用生理盐水重悬，用Bradford试剂盒检测总蛋白浓度，-80℃分装保存。

所述的外泌体表达标志性蛋白CD63和Alix，平均直径在100nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。

本发明通过细胞实验证明：通过IL-1β优化的间充质干细胞(βMSCs)比静息状态的间充质干细胞(MSCs)免疫抑制功能更强，更有效地抑制T细胞增殖和活化，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。

进一步地，本发明首次证明βMSCs来源外泌体(βMSC-exo)比MSCs来源外泌体(MSC-exo)的免疫抑制功能更强，表现为更有效地抑制T细胞增殖和活化，抑制巨噬细胞炎性因子TNF-α的分泌，而促进抗炎因子IL-10的分泌。

盲肠结扎穿刺(CLP)诱导的小动物脓毒症症状比较接近临床病患的症状，该模型被认为是最经典的脓毒症模型，已被延用了超过20年。因此，我们采用此方法构建小鼠脓毒症模型，通过尾静脉注射βMSC-exo和MSC-exo，观察外泌体对脓毒症症状的改善作用。

本发明首次通过动物实验证明：βMSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。

本发明的有益效果是：

1.本发明用IL-1β对MSCs进行优化处理，使MSCs的免疫抑制功能增强，从而得到的外泌体(βMSC-exo)比静息状态的MSCs外泌体(MSC-exo)的免疫抑制功能更强，对小鼠脓毒症的治疗效果更佳：βMSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。因此，βMSC-exo在脓毒症等炎症相关疾病的临床治疗领域具有非常可观的应用前景。

2.与传统的细胞治疗相比，本发明提供的外泌体可在-80度长期保存(至少1年)，溶解后即可使用，避免了MSCs冻存和复苏的不便，以及可能造成细胞活力和功能改变的风险。

3.本发明制备的间充质干细胞外泌体原料是脐带，脐带的采集为无创性操作且属于废弃物再利用，不涉及法律伦理等问题，脐带数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。

附图说明：

图1为IL-1β处理不影响MSCs的形态。

图2为IL-1β处理不影响MSCs的表面标志：灰色为MSCs，黑色为βMSCs。

图3为IL-1β处理不影响MSCs的成骨和成脂分化能力：上图中被染成红褐色的为成骨细胞，下图中被染成橘红色的为脂肪细胞。

图4为IL-1β处理增强了MSCs对T细胞增殖和活化的抑制作用：(A)T细胞增殖；(B)T细胞表面活化标志CD69；(C)T细胞内活化标志IFN-γ。

图5为IL-1β处理增强了MSCs对巨噬细胞的抑制作用：(A)炎性因子TNF-α的分泌水平；(B)抗炎因子IL-10的分泌水平。

图6为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo的鉴定：(A)western-blot检测外泌体标志蛋白CD63和Alix；(B)透射电镜观察外泌体的形态，标尺为100nm；(C)外泌体粒径分布图。

图7为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对小鼠脾脏T细胞的抑制作用：(A)T细胞表面活化标志CD69；(B)T细胞内活化标志IFN-γ。

图8为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对小鼠骨髓诱导的巨噬细胞的抑制作用：(A)炎性因子TNF-α的分泌水平；(B)抗炎因子IL-10的分泌水平。

图9为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠的生存率的影响。

图10为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠体内细菌清除率的比较：(A)细菌培养图片；(B)菌落数的统计图。

图11为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠血清中炎症因子和炎因子的影响：血清中炎症因子TNF-α(A)和IL-6(B)的水平；(C)血清中抗炎因子IL-10的水平。

图12为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠血清中肝脏和肾脏功能相关生化指标的影响：血清谷丙转氨酶(A)、谷草转氨酶(B)和肌酐(C)的水平。

图13为两种外泌体βMSCs-exo和MSCs-exo对脓毒症小鼠肝脏和肺脏组织损伤的影响：HE染色观察两种脏器的组织损伤情况。

具体实施例：

实施例1用IL-1β对脐带间充质干细胞进行优化

1.分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)(实验室所用的试剂耗材均经过无菌处理)

经产妇知情同意，采集正常足月妊娠剖宫产胎儿的脐带。脐带采集之前产妇需经过严格的病原体检测，包括梅毒螺旋体、艾滋病病毒、巨细胞病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒和支原体等微生物，确认安全后使用。

剪取近胎盘端脐带20-30cm，置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中保存，4小时内使用。在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，置于含0.01％青霉素和链霉素(购于Sigma公司)的DMEM/F12培养基(购于Gibco公司，下同)中，用手术剪刀剪成2mm³左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，4℃、300g离心，小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37℃摇床中，200rpm振荡，消化1.5-2小时；其中混合消化酶含Ⅱ型胶原酶2mg/ml(购于Sigma公司)，中性蛋白酶0.8mg/ml(购于Amresco公司)，透明质酸酶0.03mg/ml(购于Sigma公司)，用DMEM/F12培养基配置。将消化后的组织液于4℃、400g离心10分钟，小心弃去上清；用PBS洗两次，每次4℃、400g离心10分钟，弃上清；最后将沉淀重悬于含有12％胎牛血清(购于Gibco公司，下同)的DMEM/F12培养基中，铺入T-25培养瓶(Corning公司)，在37℃、5％CO2培养箱中培养。3天后，弃去未贴壁的细胞与组织，加入新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基。待细胞长至80％融合度时(约7天)，用0.25％胰酶(购于Gibco公司)消化，传代至10cm培养皿(Corning公司，下同)中继续扩增培养，并记为第1代。以后每三到四天换液或消化后传代培养，每传代一次记为一代。

2.用IL-1β优化处理MSCs

取第3-7代的MSCs接种于10cm培养皿中，待细胞融合达到60-70％时，加入重组人IL-1β(购于PeproTech公司)，使得终浓度为10ng/ml，处理12-24小时。用PBS清洗细胞两次，更换含无外泌体牛血清的DMEM/F12培养基继续培养48-72小时。其中无外泌体的牛血清是通过100,000g超速离心18小时后去除沉淀的牛血清。无菌收集培养上清备用。

3.IL-1β优化处理的MSCs表型及分化功能鉴定

取上述IL-1β优化处理的MSCs(βMSCs)进行表型鉴定。在倒置显微镜下观察βMSCs的形态及贴壁性，如图1所示，IL-1β刺激后的βMSCs仍保持良好的贴壁性，且形态不变，呈长梭形，涡旋状排列。分别收集MSCs和βMSCs，用PBS洗两次，分成每管4×10⁵个细胞，分别加入抗人CD29-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD11b-PE、CD14-PE、CD19-APC、CD31-PE和HLA-DR-PE抗体，以及FITC-mouse-IgG1、PE-mouse-IgG1和APC-mouse-IgG1同型对照抗体(所有抗体全部购于eBioscience公司)，4℃避光孵育30分钟，PBS洗两次，流式细胞术检测细胞表面标志。如图2所示，βMSCs和MSCs均阳性表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，阴性表达CD11b、CD14、CD19、CD31和HLA-DR。

MSCs和βMSCs的成骨和成脂分化鉴定采用Gibco公司的成骨和成脂分化试剂盒，货号分别是A10072-01和A10070-01，实验操作按说明书进行。实验结果如图3所示，成骨细胞被茜素红染成红棕色，脂肪细胞被油红O染成橘黄色，βMSCs与MSCs的成骨和成脂分化能力没有显著差异。

4.IL-1β优化处理的MSCs的免疫抑制功能分析

本实验中获取T细胞和骨髓巨噬细胞所用的C57BL/6小鼠，雄性，6～8周龄，购于南京大学模式动物研究所。

对T细胞的抑制作用：

用美天旎公司的小鼠总T细胞磁珠分选试剂盒分选得到小鼠脾脏T细胞，铺于96孔培养板(购于Corning公司)中，每孔2×10⁵个细胞，总体积200μl。将βMSCs与静息MSCs分别与T细胞共培，MSCs与T细胞的数量比为1:10，同时加入刀豆蛋白A(ConA，终浓度5μg/ml，下同)刺激48小时，收集T细胞，加入[³H]后继续培养8小时，液闪计数检测细胞增殖情况。结果如图4A所示，IL-1β优化处理的MSCs更有效地抑制T细胞增殖。另外，在与上述同样的MSCs与T细胞的共培体系中，于收集细胞前4小时加入终浓度10μg/ml的细胞内蛋白转运抑制剂Brefeldin>

对巨噬细胞的抑制作用：

分离小鼠骨髓细胞，用含10％胎牛血清、25ng/ml巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF，购于PeproTech公司)的1640培养基(购于Gibco公司)诱导4天，得到巨噬细胞(BMDMs)。BMDMs铺于24孔培养板(购于Corning公司)中，每孔2.5×10⁵个细胞，总体积500μl。将βMSCs与静息MSCs分别与BMDMs以1:10的比例共培，LPS(终浓度100ng/ml)刺激24小时后，收集培养上清，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测培养上清中炎症因子TNF-α和抗炎因子IL-10的蛋白水平。所用的小鼠TNF-α和IL-10ELISA试剂盒购于Biolegend公司。结果如图5所示，βMSCs比MSCs更有效地抑制TNF-α的水平，而促进IL-10的水平。

本实施例中获取间充质干细胞的原料是脐带，脐带的采集为无创性操作且属于废弃物再利用，不涉及法律伦理等问题，脐带数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。该实施例结果表明，经过IL-1β处理之后，间充质干细胞的基本形状包括形态、表面标志和分化功能没有改变，而其免疫抑制功能显著增强。

实施例2 IL-1β优化的间充质干细胞外泌体(βMSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)的提取与鉴定

1.βMSC-exo及MSC-exo的提取

分别收集βMSCs与静息MSCs的细胞培养上清于500ml无菌离心瓶或50ml聚丙烯离心管中(购于Beckman公司)，于4℃、2000g离心10分钟，以去除死细胞和大的碎片。小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10,000g离心30分钟，以去除细胞器及小颗粒。小心将上清液转移到无菌超速离心管中，于4℃、110,000g(Beckman超速离心机)超速离心70分钟，小心弃去上清，再加注射用生理盐水清洗一次，于4℃、110,000g超速离心70分钟，得到的沉淀即为外泌体。根据最初收集的培养基的体积不同，酌情加入小体积的注射用生理盐水重悬，用Bradford试剂盒(购于Thermo公司)检测总蛋白浓度后，-80℃分装保存。

2.βMSC-exo及MSC-exo的鉴定

用western-blot法分析两种外泌体的标志性蛋白：加适量的蛋白裂解液裂解外泌体沉淀，充分漩涡震荡；测定蛋白质浓度后，每个样取20μg，加5×SDS上样缓冲液，99℃金属浴中加热10-15分钟；12,000g离心5分钟；上样，做10％SDS-PAGE；100V转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时；分别加入抗CD63和Alix的一抗(用TBS按1:500稀释，购于Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜；TBST洗膜5分钟×4次，加相应二抗，室温孵育1.5小时；TBST洗膜5分钟×4次，加ECL发光液(购于Millipore公司)，通过化学发光凝胶成像系统成像拍照。结果如图6A所示，CD63和Alix在MSCs和βMSCs来源的两种外泌体中均有表达。

用透射电镜观察两种外泌体的形态：将两种外泌体各自充分混匀，分别吸取20μl滴到直径2mm的载样铜网上，室温静置5分钟，用滤纸小心吸掉多余液体。滴加醋酸双氧铀负染2分钟，用滤纸吸掉多余液体，在白炽灯下烘干；透射电镜80-120kv成像并拍照。结果如图6B所示，可见直径为100nm左右的圆形囊泡状结构。

外泌体粒径检测：将两种外泌体送公司检测粒径分布，所用仪器是qNano(新西兰Izon science公司)。结果如图6C所示，MSC-exo的粒径为92±34.1nm，βMSC-exo的粒径为106±45nm。

该实施例结果说明，用差速离心法成功获取MSCs和βMSCs来源的外泌体，它们都表达标志性蛋白CD63和Alix，平均直径在100nm左右，透射电镜下观察到的形态都符合外泌体的特征。

实施例3 IL-1β优化的间充质干细胞外泌体(βMSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)对体外培养的T细胞和巨噬细胞的抑制作用

1.对T细胞的抑制作用

小鼠脾脏T细胞的获取和处理方法同实施例1。将βMSC-exo和MSC-exo分别加入T细胞中，外泌体终浓度为10μg/ml。同时加入5μg/ml ConA刺激48小时，于收集细胞前4小时加入细胞内蛋白转运抑制剂BFA，收集T细胞，流式细胞术检测T细胞内IFN-γ和细胞表面CD69的蛋白水平。结果如图7所示，βMSC-exo比MSC-exo更有效地抑制IFN-γ和CD69的蛋白水平。

2.对巨噬细胞的抑制作用

小鼠骨髓巨噬细胞BMDMs的获取和处理方法同实施例1。将βMSC-exo和MSC-exo分别加入BMDMs中，外泌体终浓度为10μg/ml。LPS(终浓度100ng/ml)刺激24小时后，收集培养上清，ELISA法检测培养上清中炎症因子TNF-α和抗炎因子IL-10的蛋白水平。结果如图8所示，βMSC-exo比MSC-exo更有效地抑制TNF-α的水平，而促进IL-10的水平。

该实施例结果表明，外泌体与其母细胞-MSCs的功能类似，具有免疫抑制作用，且βMSC-exo比MSC-exo的免疫抑制功能更强。值得注意的是，根据现有文献报道，外泌体可以在-80度保存，至少1年保持活性不变，溶解后即可使用。这就避免了传统细胞治疗所用的MSCs冻存和复苏的不便，以及由此带来的细胞活力和功能改变的风险。

实施例4 IL-1β优化的间充质干细胞外泌体(βMSC-exo)与静息状态的间充质干细胞外泌体(MSC-exo)对小鼠脓毒症的治疗作用

实验所用C57BL/6小鼠，雄性，8～10周龄，购于南京大学模式动物研究所。

参照Daniel Rittirsch等的方法(Daniel Rittirsch et al.Immunodesign ofexperimental sepsis by cecal ligation and puncture,Nat Protoc.2009；4(1):31-6)，用盲肠结扎穿刺(CLP)的方法诱导小鼠重度脓毒症模型。实验分组：假手术组：除了不进行结扎穿刺外，其余操作同模型组；模型组：CLP手术后4小时尾静脉注射150μl无菌生理盐水；βMSC-exo治疗组：CLP手术后4小时尾静脉注射30μgβMSC-exo(溶于150μl无菌生理盐水中)；MSC-exo治疗组：同样方法注射30μg MSC-exo。

1.小鼠生存率观察

CLP手术后每隔12小时观察小鼠生存状况，记录死亡情况，连续观察7天。采用GraphPad软件绘制生存曲线。结果如图9所示，与Daniel Rittirsch等报道的结果一致，假手术组小鼠全部存活，而模型组小鼠在4天内全部死亡。βMSC-exo治疗组小鼠生存率为69.2％，MSC-exo治疗组生存率为33.3％，可见βMSC-exo能更有效地增加脓毒症小鼠的生存率。

2.血液及腹腔灌洗液细菌培养及计数

血液细菌培养及菌落计数：CLP手术48小时后，小鼠眼球取血，滴于1.5ml无菌EP管中，立刻吸取5μl血，加入145μl无菌PBS中，混匀后涂布于血琼脂平板中。平板倒置于37℃细菌培养箱中，培养12小时，拍照，计算细菌集落数。腹腔灌洗液细菌培养及菌落计数：将处死的小鼠置于超净工作台内，用注射器吸取5ml无菌PBS打入腹腔，轻轻揉捏腹部2分钟，吸出灌洗液。吸取5μl血，加入145μl无菌PBS中，混匀后涂布于普通LB营养平板中。平板倒置于37℃细菌培养箱中，培养过夜，拍照，计算细菌集落数。结果如图10所示，βMSC-exo治疗组比MSC-exo治疗组更有效地清除腹腔和血清中的细菌。

3.血清细胞因子及肝肾功能相关生化指标检测

CLP手术48小时后，小鼠眼球取血，滴于1.5ml无菌EP管中，室温静置1小时后3000rpm、20℃离心10分钟，吸取血清置于无菌EP管中。用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6和IL-10的浓度。结果如图11所示，βMSC-exo治疗组比MSC-exo治疗组更有效地降低血清中炎症因子TNF-α(A)和IL-6(B)的水平，促进抗炎因子IL-10的水平(C)。另外，血清送至江苏省药物研究所检测肌酐、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度。结果如图12所示，βMSC-exo比MSC-exo更有效地降低血清谷丙转氨酶(A)、谷草转氨酶(B)和肌酐(C)的水平。

4.小鼠肝肺组织HE染色

采血后断颈处死小鼠，迅速摘取肝脏和肺，肝脏切取约1×1cm左右大小，肺取一叶，置于含4％多聚甲醛的EP管中固定过夜，送至南京市鼓楼医院病理科做HE染色。结果如图13所示，模型组小鼠的肝组织出现明显的组织松散、水肿和脂肪变性，肺组织出现充血和肺泡间隔增厚的现象，βMSC-exo比MSC-exo更有效地改善这些病变。

该实施例结果表明，βMSC-exo对小鼠脓毒症的治疗作用显著优于MSC-exo，主要表现为βMSC-exo比MSC-exo更有效地增加脓毒症小鼠的生存率、加强体内细菌清除率、降低全身炎症反应并缓解肝脏和肺组织的损伤。

统计学分析

统计数据以平均值±标准误的形式给出，用GraphPad Prism 5软件(美国圣地亚哥)进行统计分析并作图，组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t-test，p<0.05为具有显著差异，*p<0.05，**p<0.001，***p<0.0001。实验结果均重复三次以上。