一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌假单胞菌NLX-4及其应用

摘要

本发明公开了一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌苏假单胞菌NLX‑4及其应用，该硅酸盐岩高效溶蚀细菌的分类命名为假单胞菌

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌假单胞菌NLX-4及其应用。

背景技术

客土喷播技术是将植物种子和生长基质材料的混合物均匀、高压喷播在岩土坡面上的绿化技术。该技术主要是针对岩石等硬质边坡研发的一种绿化技术。目前已广泛应用于水利、公路、铁路等工程的坡面绿化中。但是，该技术针对于岩坡实现绿化必须具备两个条件：一是岩面上有植物赖以持续生长的种植基质；二是种植基质能长久固定在岩面上，抗风吹、暴雨和流水的冲蚀。然而在实际工程中，目前的客土喷播技术，难以解决上述两个技术难题，喷播基质难以长久的维持在岩石坡面上，使得这一技术的利用受到很多的限制。显然喷播基质已经成为岩石边坡客土喷播技术的核心内容，这种基质不仅要求提供适宜护坡植被生长的土壤性质，还要求具有粘着在岩石坡面上的粘结功能，与坡面实现完全长久的融合。

岩石侵蚀微生物菌群能加速岩石的土壤化进程，快速形成适应植物生存所需的土壤，模拟自然生态环境，促进岩石侵蚀成土的演替，为植物生长源源不断地提供营养成分。在岩石侵蚀微生物菌群的作用下，在岩体和喷播基质间形成了一个界面——生育基盘。这种生育基盘，既解决了岩面上植物赖以持续生长的种植基质问题(包括提供营养元素)，也解决了种植基质能永久固定在岩面，实现岩面和种植基质的融合，促进了种植基质和岩石的物质循环。显然，筛选高效岩石侵蚀微生物菌株是客土喷播技术长期维持和广泛应用的关键。目前，国内针对不同岩石，筛选适宜的高效岩石侵蚀微生物菌株还未见报道。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌假单胞菌NLX-4，为岩石高效侵蚀微生物菌库的建立提供菌种支持。本发明的另一目的是提供上述硅酸盐岩高效溶蚀细菌假单胞菌NLX-4的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌，其分类命名为假单胞菌Pseudomonas protegensNLX-4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016238，保藏日期：2016年5月3日；保藏地址：中国武汉武汉大学。

所述的假单胞菌NLX-4在溶蚀岩石中的应用。所述的岩石为硅酸盐岩。

所述的液化假单胞菌NLX-4在解磷和/或钾和/或硅和/或铝中的应用。

所述的假单胞菌NLX-4在促进植物生长中的应用。

所述的假单胞菌NLX-4的培养液在溶蚀岩石中的应用。

所述的假单胞菌NLX-4的培养液在解磷和/或钾和/或硅和/或铝中的应用。

所述的假单胞菌NLX-4的培养液在促进植物生长中的应用。

假单胞菌NLX-4，是从江西庐山岩矿区岩石(其为硅酸盐岩，富含K、Al、Si元素)表面生物结皮组织中筛选获得的，能加速石灰岩石中K、Al、P等元素释放。

假单胞菌NLX-4菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨固体培养基上28℃条件下培养，营养体细胞为杆状，端圆，革兰氏染色阴性，有芽孢。

假单胞菌NLX-4菌株16S rDNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，假单胞菌NLX-4菌株与Pseudomonas protegens strain CY01的相似度为100％。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定为假单胞菌(Pseudomonasprotegens)NLX-4。

有益效果：与现有技术相比，本发明筛选出的高效侵蚀岩石菌株假单胞菌NLX-4，对硅酸盐岩有很强的侵蚀能力，能促进岩石中Ca、Al等主要离子的释放，加速石灰岩侵蚀成土；同时兼有很强的解K、P的潜能；同时，能促进喷播后植物的生长，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1是是假单胞菌NLX-4在电子显微镜下(1000X)的菌体图；

图2是假单胞菌NLX-4发酵培养15d，加菌发酵液与不加菌对照的Al²⁺和溶液中Si元素(在溶液中的存在形式为SiO₂)浓度的比较结果图；

图3是假单胞菌NLX-4发酵培养15d，加菌发酵液与不加菌对照的可溶性K、有效P的比较结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 菌株的获得和鉴定：

采集硅酸盐岩(江西庐山岩矿区)裸岩表面生物结皮中的菌落，采用稀释平板法，在28℃培养箱中，以筛选培养基(5.0g蔗糖，2.0g Na₂HPO₄，0.5gAlSO₄·7H₂O，0.005g>3，0.1g>3，1.0硅酸盐岩矿粉(清洗过的庐山岩矿区岩石，打磨为岩石粉，过200目筛，主要化学成分为：73.8％SiO₂、13.4％Al₂O₃、9.9％K₂O)，18g琼脂粉，1000mL蒸馏水)培养48h左右，挑取单菌落，反复划线纯化，并将所得菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，4℃冰箱保存，获得纯菌株。该菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨固体培养基上28℃条件下培养，营养体细胞为杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢(见图1)。

用接种环取少量纯菌株接种于装有50mL筛选培养基(培养基同上，不加琼脂粉)的250mL三角瓶中，28℃，180r/min震荡培养72h。按照常规方法，提取菌株DNA测序。得16S rDNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，该菌株与Pseudomonas protegens strain CY01的相似度为100％。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定为假单胞菌(Pseudomonas protegens)NLX-4。

实施例2 菌株的硅酸盐岩溶蚀能力：

用接种环取少量纯菌株接种于装有50mL筛选培养基(培养基同上，不加琼脂粉)的250mL三角瓶中，28℃，180r/min震荡培养72h，得到活化菌种。

取2.0mL培养24h的菌悬液(6.0×10⁶cfu·mL^-1)接入装有100mL缺钾培养液(10g蔗糖，2.0g>4，0.5g>4·7H₂O，0.1g>2O₂，70℃水浴30min后定容至10mL，过滤取滤液加1滴浓硝酸(65％)酸化，用ICP测定发酵液中K、Al离子的含量。

将细菌种子液(6.0×10⁶cfu·mL^-1)2.0mL接入100mL解磷(10g葡萄糖，0.5g(NH₄)₂SO₄，0.3g>4·7H₂O，0.3g>4·7H₂O，0.03g>4·4H₂O，1000mL去离子水每100mL培养基加入0.2g硅酸盐岩矿粉)培养基，同时接种等量灭活种子液，28℃，180rpm振荡培养。取15d的培养液，加入无磷活性炭脱色。离心后(4000rpm，20min)，取上清液定容至100mL。吸取样品5.0mL，稀释6倍后加入二硝基酚指示剂2-3滴，以5％的稀硫酸溶液调节样液至呈微黄色，再5.0mL钼锑抗显色剂，振荡混匀，加水定容至50mL。15℃静置30min，采用分光光度计进行比色测定(700nm，1cm光径比色皿)，以空白实验为参比液调节仪器零点，读取吸光度。从标准曲线查得读数，采用以下公式计算结果：发酵液有效P含量(μg/mL)＝显色液磷读数(μg/mL)×分取倍数。

取2.0mL培养24h的菌悬液(6.0×10⁶cfu·mL^-1)接入装有100mL缺钾培养液和0.2g硅酸盐岩石粉的150mL锥形瓶中，另取121℃高温灭活的菌悬液2.0mL接入培养液作为对照，每种处理方式做三个平行样品。28℃，180rpm振荡培养。取15d的培养液，离心取发酵上清液采用硅钼蓝比色法测定其中Si含量。

假单胞菌NLX-4对岩石的溶蚀结果如图2、图3和表1所示，与不加菌的对照相比，加菌后发酵液中可溶性K、Al、P以及溶液中存在的Si元素浓度分别是不加菌对照的5.6、2.5、8.3、7.3倍。

按照解钾率(％)＝{[(菌液中钾含量－对照液中钾含量)×菌液体积]÷(岩石粉量×岩石粉钾含量)}×100％，计算其解钾率为29.44％。

表1 假单胞菌NLX-4对硅酸盐岩主要元素的释放

处理钾(mg·L^-1)铝(mg·L^-1)磷(mg·L^-1)硅(mg·L^-1)加菌71.1184.0725.3432.18对照12.8233.343.064.40

注：P＜0.05。

由于目前国内尚无细菌对岩石侵蚀能力的评价标准，本发明依据农业部关于硅酸盐细菌生产菌种标准的要求，解钾能力≥20％的菌株为高效解钾菌株；同时依据郝晶等(2006年)关于高效解磷细菌菌株的分离、筛选等资料，确定接种试验菌株的培养液中P浓度是对照的8倍以上，即为高效解磷菌株。可见，该株菌对硅酸盐岩有很强的侵蚀能力，能促进岩石中K、Al、P等主要离子的释放，加速硅酸盐岩溶蚀成土，并将增加环境中可被利用的营养元素含量，是很有应用前景的高效硅酸盐岩溶蚀、高效解钾和高效解磷细菌菌株。

实施例3 菌株对植物生长的影响

将菌株活化后(方法同实施例2)，按照100mL·kg^-1拌入喷播基质(林地土壤，添加腐植酸有机肥25％、硅酸盐岩石粉(200目筛)4％、喷播木纤维0.3％、保水剂0.3％、绿化喷播粘合剂0.03％)，对照则在喷播基质中拌入相同体积的培养基，进行黑麦草盆栽试验(盆钵直径17cm，深15cm)。置于25℃温室中，在种子萌发后保留每盆中生长最为良好的三株幼苗，3个月后对植株(黑麦草)的株高与生物量进行测定。每组实验做3组平行处理。

株高是植物形态学调查工作中最基本的指标之一，指植株根颈部到顶部之间的距离。由表2可知，接入细菌后植株的平均株高比对照组增加了37.2％，说明细菌NLX-4对植株的增长具有良好促进作用。

单株植物的生物量是主要指其干重，反映了该状况下该植物积累有机物的量，是分析植物生产力的重要指标。由表3可知，，接入细菌后植株的生物量比对照组增加了41.5％，说明细菌NLX-4有利于植株生长过程中有机物的积累。

表2 假单胞菌NLX-4对喷播植株的影响

处理平均株高/cm生物量/g加菌29.832.32对照21.741.64

注：P＜0.05。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种硅酸盐岩高效溶蚀细菌假单胞菌NLX-4及其应用

<130> 100

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1404

<212> DNA

<213> Pseudomonas protegens

<400> 1

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