新型8,10-去二氮杂-N5-酰基四氢叶酸类化合物作为抗肿瘤药物的应用

摘要

本发明涉及通式新型8，10‑去二氮杂‑N5‑酰基四氢叶酸类化合物I在制备抗肿瘤药物或药物组合物中的用途，式中各个基团的定义如权利要求书所述。本发明还涉及所述化合物的制备方法。

说明书

发明领域

本申请涉及8，10-去二氮杂-N⁵-酰基取代四氢叶酸类衍生物、其光学纯异构体或非对映异构体混合物、其可药用盐、含有所述化合物的药物组合物在制备具有叶酸代谢蛋氨酸合成酶抑制作用的用途。本发明还涉及此类化合物在制备具有诱导肿瘤细胞凋亡的抗肺癌，胃癌，皮肤癌，肝癌，宫颈癌，乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，鼻咽癌，食管癌，脑神经胶质瘤，和胰腺癌药物中的用途。

技术背景

癌症是危害人类生命和健康的重大疾病，全世界因癌症死亡人数每年在700万以上，是仅次于心血管疾病的第二大杀手。由于目前尚无有效的预防、早期诊断和治疗方法，化疗(化学疗法)成为临床三种主要治疗方法中的一种。现代的化疗起始于20世纪40年代，经过60余年的发展，目前临床上应用的抗癌药物已有相当数量，然而特异性好、专属性强的抗肿瘤药物不多，离不同癌症特异性治疗的目标相去甚远。因此，特异性强、选择性高的抗肿瘤药物成为药物学家关注的重点。

蛋氨酸合成酶(MS)作为叶酸代谢中的关键酶，催化如下的反应：以甲基四氢叶酸(CH3-THF)为底物，通过SN2反应将甲基四氢叶酸分子中的甲基转移到酶分子中，然后再将甲基转移到高半胱氨酸(Hcy)分子中，生成蛋氨酸(Met)，即(1)CH₃-THF+MS→CH₃-MS+THF(2)CH₃-MS+Hcy→Met+MS。即通过两次亲核取代反应，将甲基四氢叶酸的甲基转移到高半胱氨酸中，生成蛋氨酸，同时恢复四氢叶酸的活性体形式，重新参与叶酸循环。

过去数年的研究证明：①MS是人类细胞中唯一以甲基四氢叶酸为底物的蛋白酶，在催化形成蛋氨酸过程中，同时提供叶酸进入细胞的代谢途径，也为嘌呤及嘧啶的合成提供单碳单位；②快速裂分的癌细胞所需的蛋氨酸是正常细胞所需要的5～6倍；③癌细胞中蛋氨酸合成酶的活性要比正常细胞中该酶的活性高21倍左右；④抑制蛋氨酸合成酶可能会使癌细胞的快速生长受到抑制，而对正常细胞无大的影响。从研究结果可以看出，蛋氨酸合成酶是肿瘤细胞生长的重要催化启动因子，抑制其活性，可干扰癌细胞的生长、代谢和增殖过程，诱导肿瘤细胞调亡，达到治疗目的。

虽然肿瘤细胞中的蛋氨酸合成酶活性都有所提高，但是不同肿瘤细胞中蛋氨酸合成酶活性也有很大差距，利用不同肿瘤细胞中蛋氨酸合成酶的活性不同，提高肿瘤抑制剂的选择性，降低毒副作用，对不同肿瘤特异性用药具有重要意义。根据蛋氨酸合成酶的作用机理，我们设计了8位和10位去二氮杂的四氢叶酸类似物，以增加稳定性，提高在体内的溶解度和转运到细胞中的速度。在N5上连接有酰基，是为了能够与蛋氨酸合成酶中强亲核性的钴胺素反应，生成稳定的碳钴键，从而使蛋氨酸合成酶失活，达到抑制细胞快速分化和肿瘤生长的目的。对本实验室合成的8，10-去二氮杂-N5-酰基取代的四氢叶酸类似物进行蛋氨酸合成酶抑制活性测定，证明该类化合物对蛋氨酸合成酶的抑制活性很好，其IC50值小于10μM.

本实验室对正常体细胞和20种不同种类肿瘤细胞中蛋氨酸合成酶的活性进行测定和筛选，最终确定八种蛋氨酸合成酶活性最高的肿瘤细胞为肺癌细胞、皮肤癌细胞、宫颈癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、和胰腺癌细胞。通式I化合物N5酰基取代四氢叶酸类似物对蛋氨酸合成酶活性最高的七种肿瘤细胞进行抑制活性测定，其中对皮肤癌细胞A431NS和胰腺癌细胞PANC-1的抑制活性最好，其IC50分别为3.7nm和5.5nm，对肺癌细胞H460、宫颈癌细胞株Hela、结肠癌细胞COL0205、前列腺癌细胞DU145和食管癌细胞TE-1的IC50为10nm-90nm之间，因而可以确定N5酰基取代四氢叶酸类似物为蛋氨酸合成酶的良好抑制剂，并且对于蛋氨酸合成酶活性高的肿瘤细胞具有显著抑制作用。尤其对胰腺癌细胞和皮肤癌细胞的高选择性，为解决当前胰腺癌临床用药种类少和降低皮肤癌用药副作用的难题具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型8，10-去二氮杂-N5取代四氢叶酸类化合物的抗肿瘤药物的应用。

本发明已经发现通式I 8，10-去二氮杂-N5-酰基取代四氢叶酸类衍生物可以抑制叶酸代谢中的蛋氨酸合成酶，并且能够选择性抑制蛋氨酸合酶活性高的肿瘤细胞，因此通式I可以用于治疗和/或预防肿瘤的药物，包括胰腺癌和皮肤癌，以及肺癌、宫颈癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌和人食管癌。

根据本发明的一个实施方案，本发明涉及通式I，即N5位具有酰基取代的新型四氢叶酸衍生物、其光学纯异构体、其非对映体混合物或其药学上可接受的盐。

其中：

R1为NH₂或OH，

R2为选自H、、烷基、链烯基、炔基、酰基、-C(O)-烷基、-C(O)-链烯基或-C(O)-炔基，

R3为选自H、烷基、链烯、炔烃、烷氧基、羟基或卤素，

R4和R5分别独立选自羟基、烷氧基、氨基、氨基酸或羧酸保护基。

另一方面，本发明还涉及药物组合物，其包括至少一种通式I类化合物或其光学异构体或其药学上可接受的盐以及药用载体或赋形剂。

本发明化合物的药物组合物可采用下面的任意方式使用：口服、喷雾吸入、直肠用药、鼻腔用药、颊部用药、局部用药、非肠道用药，如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心内室、胸骨内或静脉内给药方式。本发明的药物组合物可单独给药也可与其它神经保护药物联合用药。被治疗动物包括哺乳动物、爬行动物、甲壳动物、两栖类、鱼类、家禽类。主要范围为哺乳动物特别是人。

当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体可包括填充剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂。填充剂可包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、糊精、糖粉、乳糖、甘露醇、微晶纤维素。润滑剂包括但不限于硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、氧化植物油、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、微粉硅胶、滑石粉。崩解剂可包括但不限于交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、淀粉及其衍生物、低取代羟丙基纤维素、泡腾崩解剂。粘合剂可包括但不限于羟丙基纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精、糖粉、糖浆、胶浆、纤维素及其衍生物。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬乳液制剂则是将活性成分与适宜的悬浮剂混合使用，悬浮剂可包括但不限于润湿剂、絮凝剂、反絮凝剂。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤或下肠道神经性疾病时，可根据不同的患面或器官将本发明的化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：

当皮肤局部使用时，本发明化合物可制成适当地软膏、洗剂或霜制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。

本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮或无菌注射溶液。其中，可使用的载体或溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速度、病症的严重程度，具体剂量和使用方法由主治医师根据患者的具体病情判断。

制备方法通式

本发明化合物可选择多种反应路线制备，通过下述实施例将将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。

R1为NH₂或OH，

R2为选自H、、烷基、链烯基、炔基、酰基、-C(O)-烷基、-C(O)-链烯基或-C(O)-炔基，

R3为选自H、烷基、链烯、炔烃、烷氧基、羟基或卤素，

R4和R5分别独立选自羟基、烷氧基、氨基、氨基酸或羧酸保护基。

本发明所述的工艺中，化合物1与芳香醛(酮)在取代的苯磺酰胺的催化作用下高温反应直接制备化合物3，通过一步反应快速构建基本结构骨架，从而避免了类似化合物结构骨架构建方法中用Wittig反应中的诸多不足。化合物3与谷氨酸酯在缩合剂的作用下得到化合物4，在催化氢化条件下转化为化合物5，随后在N5位进行不同的取代反应获得目标化合物I。本合成方法合成步骤少、简便、试剂廉价易得、环境友好，利于方便快捷地获得该类目标化合物。

在不脱离此发明主要思想的情况下，一些具体操作步骤可做一些改变或修正。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1：(E)-4-[2-(2，4-二氨基吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙烯基]苯甲酸的合成

将1mmol 2，4-二氨基-6-甲基吡啶并[3，2-d]嘧啶(1)、1mmol对甲酰基苯甲酸乙酯(2)以及1mmol对甲基苯磺酰胺溶于5mL N，N-二甲基乙酰胺中，氮气保护下加热回流12h，TLC监测反应原料消失，向反应液中加入适量的1N NaOH至pH＝12，用二氯甲烷萃洗溶液三次，收集水层，加入1N HCl调节至pH＝5，析出白色固体，抽滤后干燥得到化合物3，产率90.5％。m.p.＞250℃；¹H>6，400MHz)δ：6.37(s，2H，2-NH2)，6.45(d，J＝16.0Hz，1H，CH＝CHPh)，7.57(d，J＝8.4Hz，1H，CH-7，py)，7.74～7.78(m，2H，C₆H₄and>13C>6，100MHz)δ：127.008(2×Ph)，127.667(Py，C-7)，128.290(Ph-CH＝CH)，128.498(2×Ph)，129.798(Py，C-8)，130.952(Ph-CH＝CH)，133.218(py，C-6)，140.317(Ph-CH＝CH)，148.192(Py，C-8a)，160.943(Py，C-2)，162.572(Py，C-4)，166.715(COOH)。

实施例2：(E)-4-[2-(2，4-二氨基吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙烯基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的合成

将1mmol化合物(E)-4-[2-(2，4-二氨基吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙烯基]苯甲酸、1mmol谷氨酸二乙酯及1mmol 1，3-二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二氯甲烷中，室温下搅拌24h，TLC监测反应原料消失，母液用CH₂Cl₂和饱和食盐水萃洗、有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压蒸馏至少量，柱层析分离，洗脱剂为CH₂Cl₂∶CH₃OH＝15∶1，得到5g化合物1.9，黄绿色荧光固体，产率31.5％，m.p.133～134℃。¹H>6)δ：1.160～1.204(m，J＝7.2Hz，6H，2×CH₃)，2.019～2.058(m，1H，CH_aH_bCH₂CO)，2.111～2.184(m，1H，CH_aH_bCH₂CO)，2.448～2.485(t，2H，CH2CO)，4.036～4.089(q，J＝7.2Hz，2H，-OCH₂-)，4.100～4.151(q，J＝7.2Hz，2H，-OCH₂-)，4.439～4.469(m，1H，NCHCO)，6.373(s，2H，2-NH₂)，6.427～6.467(d，J＝16.0Hz，1H，-CH＝CHph)，7.559～7.580(d，1H，CH-7，py)，7.743～7.776(m，J＝8.0Hz，2H，C₆H₄and>Hph)，7.926～7.946(d，J＝8.0Hz，2H，C₆H₄)，8.740～8.758(d，1H，CONH)；¹³C>6)δ：14.524(2×CH₃)，29.459(CH₂CH₂CO)，30.663(CH₂CH₂CO)，52.505(NCHCO)，60.379(OCH₂)，61.021(OCH₂)，127.008(2×ph)，127.667(py，C-7)，128.290(ph-CH＝CH)，128.498(2×ph)，129.798(py，C-8)，130.952(ph-CH＝CH)，132.225(ph-CONH)，133.218(py，C-6)，140.317(ph-CH＝CH)，148.192(py，C-8a)，160.943(py，C-2)，162.572(py，C-4)，166.715(CONH)，172.213(CHCOO)，172.649(CH₂COO)；

实施例3：4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的合成

100mg(0.201mmol)(E)-4-[2-(2，4-二氨基吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙烯基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯溶于10mL无水乙醇中，加入2mg PtO₂和1mL>2，用5％的NaHCO₃水溶液中和，减压蒸馏除去乙醇，用CH₂Cl₂和饱和食盐水萃洗，有机层用无水Na₂SO₄干燥后减压蒸馏至少量，柱层析分离，洗脱剂为V(CH2Cl2)∶V(CH3OH)＝12∶1，得到80mg化合物4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯，淡黄色固体，产率79.0％.m.p.90～91℃；¹H>6，400MHz)δ：1.18(t，J＝7.2Hz，6H，CH3)，1.51～1.538(m，1H，CH_aH_b-7)，1.75～1.84(m，2H，CH2-9)，1.90～1.95(m，1H，CH_aH_b-7)，1.99～2.06(m，1H，CH_aH_bCH₂CO)，2.09～2.10(m，1H，CH_aH_bCH₂CO)，2.45(t，J＝7.5Hz，2H，CH₂CO)，2.48～2.60(m，2H，CH₂-10)，2.78～2.87(m，2H，CH₂-8)，3.04～3.06(m，1H，NCH-6)，4.08(q，J＝7.2Hz，4H，OCH₂)，4.41～4.50(m，1H，NCHCO)，6.59(s，2H，2-NH2)，7.37(d，J＝8.0Hz，2H，C₆H₄)，7.57(s，2H，4-NH2)，7.83(d，J＝8.0Hz，2H，C₆H₄)，8.67(d，J＝7.4Hz，1H，CONH)；¹³C>6，100MHz)δ：14.512(2×CH3)，24.360(C-7)，26.180(C-8)，26.545(CH2CH2CO)，30.659(CH₂CH₂CO)，31.527(C-10)，36.884(C-9)，50.907(NCHCO)，52.432(C-6)，60.356(OCH2)，60.968(OCH₂)，116.617(C-4a)，128.022(2×Ph)，128.656(2×Ph)，131.723(Ph-CONH)，146.442(Ph-CH2CH2)，152.212(C-4)，157.705(C-2)，167.026(CONH)，172.238(CHCOO)，172.649(CH2COO)；HRMScalcd>

实施例4：4-[2-(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯的合成

243mg(0.488mmol)化合物4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯溶于5ml CH₂Cl₂，加入0.1ml甲酸(2.67mmol)，室温下搅拌1h，加入0.2ml(2.10mmol)乙酸酐，室温下继续搅拌0.5h，停止反应，加入饱和NaHCO₃中和至pH＝7，用饱和食盐水和CH₂Cl₂萃洗，有机层用无水Na₂SO₄干燥，过滤，减压蒸馏除去CH₂Cl₂，得到的粗产物柱层析分离，洗脱剂为CH₂Cl₂∶CH₃OH＝15∶1，得到250mg化合物4-[2-(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸二乙酯，产率97.3％，m.p.88～89℃。¹H>3)δ：1.206～1.242(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃)，1.284～1.320(t，J＝7.2Hz，3H，CH₃)，1.686～1.752(m，1H，CH_aH_b-7)，1.791～1.861(m，1H，CH_aH_b-7)，1.892～1.945(m，1H，CH_aH_b-9)，2.115～2.231(m，2H，CH_aH_b-9，CH_aH_bCH₂CO)，2.269～2.352(m，1H，CH_aH_bCH₂CO)，2.392～2.511(m，2H，CH₂CO)，2.516～2.607(m，2H，CH₂-10)，2.627～2.747(m，2H，CH₂-8)，3.910～3.922(m，1H，NCH-6)，4.084～4.143(m，J＝7.2Hz，2H，OCH₂)，4.207～4.263(m，J＝7.2Hz，OCH₂)，4.763～4.814(m，1H，NCHCO)，5.083(s，2H，4-NH₂)，5.332(s，2H，2-NH₂)，7.125～7.143(d，1H，CONH)，7.176(d，J＝7.8Hz，2H，C₆H₄)，7.736～7.756(d，J＝7.8Hz，2H，C₆H₄)，8.039～8.051(d，1H，NCHO)；¹³C>3)δ：14.117(CH₃)，14.137(CH₃)，26.183(C-7)，27.216(C-8)，27.985(CH₂CH₂CO)，30.526(CH₂CH_２CO)，31.945(C-10)，32.088(C-9)，52.363(NCHCO)，54.134(C-6)，60.804(OCH₂)，61.712(OCH₂)，107.160(C-4a)，127.522(2×ph)，128.514(2×ph)，131.884(ph-CONH)，144.512(ph-CH₂CH₂)，159.032(C-8a)，159.366(C-4)，160.388(C-2)，160.713(NCHO)，166.818(CONH)，172.050(CHCOO)，173.233(CH₂COO)；HRMS>26H₃₅N₆O₆>

实施例5：4-[2-(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸的合成

20mg(0.038mmol)4-[2-(2，4-二氨基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸溶于3mL无水甲醇中，加入3mg(0.118mmol)KOH，室温下搅拌24h，停止反应，减压蒸馏除去甲醇，加入1mL蒸馏水溶解残余物，用1mol/L的HCl水溶液小心中和到pH＝6左右，析出淡黄色沉淀，放入冰箱中静置24h，抽滤并用蒸馏水和乙醚淋洗，真空干燥后得到4-[2-(2，4-二氨基-5-甲酰基-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，2-d]嘧啶-6-基)乙基]苯甲酰-L-谷氨酸12mg，淡黄色固体，产率67.1％.m.p.169～170℃；¹H>6，400MHz)δ：1.65(brs，1H，CH_aH_b-7)，1.77(brs，1H，CHaHb-7)，1.93～1.97(m，1H，CH_aH_b-9)，2.05～2.07(m，2H，CH_aH_b-9，CH_aH_bCH₂CO)，2.31～2.39(m，3H，CH2CO，CHaHbCH2CO)，2.47～2.67(m，2H，CH2-10)，2.77～2.82(m，2H，CH₂-8)，3.01(brs，1H，NCH-6)，4.34～4.36(m，1H，NCHCO)，6.01(s×2，2H，2-NH₂)，7.25～7.30(m，1H，CONH)，7.33～7.40(m，2H，C₆H₄)，7.77～7.82(m，2H，C6H4)，8.38(s×2，1H，CHO)；¹³C>6，100MHz)δ：26.566(C-7)，27.447(C-8)，28.279(CH₂CH₂CO)，31.108(CH₂CH₂CO)，31.621(C-10)，36.927(C-9)，50.892(NCHCO)，53.314(C-6)，116.140(C-4a)，127.800(2×Ph)，128.607(2×Ph)，132.378(Ph-CONH)，145.389(Ph-CH2CH2)，158.098(C-8a)，159.123(C-4)，161.696(C-2)，163.124(NCHO)，166.329(CONH)，175.012(CHCOO)，175.133(CH2COO)；HRMS>

实施例6：对11种肿瘤细胞株的抑制实验

一、实验方法

体外培养人肺癌细胞株H460，人胃癌细胞株BGC823，人皮肤癌细胞株A431NS，人宫颈癌细胞株Hela，人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，人结肠癌细胞株COLO205，人前列腺癌细胞株DU145，人鼻咽癌细胞株KB，人食管癌细胞株TE-1，人脑神经胶质瘤细胞株U87MG，人胰腺癌细胞株PANC-1细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3.5×104/ml～8×104/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，加入待测药物，阴性对照组加入终浓度为0.5％DMSO，各组均设3个复孔。培养箱中培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃放置4h。每孔加入150μl DMSO，37℃摇床振荡5min，492nm/620nm测吸光度(OD)。运用Prism Graphpad统计软件计算EC50值。

二、实验结果(见表1)

表1.化合物对11株肿瘤细胞增殖的影响

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。