一种基于低代PAMAM树状分子的两亲性纳米自组装胶束及其应用

摘要

本发明涉及一种基于低代PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束及其应用。具体的涉及一种基于低代PAMAM树状分子与疏水药物进行偶联后，通过超声震荡在水中自组装而得。其具备载药能力的活性分子或前体药，疏水性药物与低代PAMAM树状分子的化学偶联，可以改善疏水性药物溶解度差、生物利用率较低的缺陷，为解决临床传统化疗药物存在毒性大、安全系数低的问题提供新思路。同时其也可作为纳米载体，包载其他疏水药物，实现药物的联合用药，增强疗效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束及其应用。

背景技术

分子自组装（molecular self-assembly）是指在平衡条件下，分子通过分子间非共价键弱相互作用，如范德华力、氢键、疏水作用、静电作用、π-π相互作用等，自发组合形成具有一定结构和功能的稳定的聚集体或超分子的过程。分子自组装形成的聚集体或超分子通常具有单分子或低级分子聚集体所没有的一些特殊性能，如光、电、生物特性等。一般来说，分子的自组装具有结构放大效应，即分子结构的微小改变会导致整个分子的拓扑结构发生巨大变化，所以分子的自组装非但不会因为结构的的改变而影响其特性，反而赋予了自组装体一些更加新颖的特性，比如形貌和结构更加丰富、特殊的自组装机制、特殊的组装体性能和容易功能化和智能响应等特点，这些性能使得分子自组装极具发展前景。

树状分子（dendrimer）由于具有纳米尺度、高水溶性、单分散性以及结构可调性，可通过分子自组装形成大小适宜的纳米粒子，因此可用作抗癌药物和成像药物的输送载体。相比于脂质体，树状分子支架中的共价键提供了更稳定的载体结构，使之能够经受住生理条件的变化，并能保护药物分子不被快速地分解，保证其特定的药物特性，促使药物分子在肿瘤细胞中保持一定的药效浓度。研究发现基于树形分子的纳米载体系统相比于线性聚合物载体（如PEG）具有更优越的药物载体性能，这是由于树形分子的纳米尺寸和在溶液中紧密的球面结构所引起的。聚酰胺-胺（PAMAM）是一类由中心向外对称发散而高度分枝的新型纳米树状大分子化合物，具有规整、精细的结构，呈单分散性，有很好的溶解性，0~10代粒径范围为10～130nm。纳米级的粒径使PAMAM更容易透过血管壁、细胞膜等生物屏障，对其核心和表面进行修饰，可以连接基因、抗体和疫苗等物质，内层空腔可包裹药物分子，作为药物定向运输的载体。PAMAM 树状分子作为新一代药物载体，可通过静电作用、疏水相互作用或氢键作用把药物包载于其内部，也可通过静电、共价结合在其表面形成复合物，从而增加药物溶解度，提高药物生物利用度。PAMAM树状大分子的研究与应用得到了不断的发展，受到了从材料科学到生物医药等诸多领域日益广泛的关注。

目前对PAMAM 树状分子的应用主要集中在作为药物和基因的载体等方面，如专利CN201010142282中公开了一种新型 PAMAM 的衍生物及其应用，其所述衍生物为苯丙氨酸偶联修饰的 PAMAM树状大分子，用于 siRNA 的转染和基因的体内转染，它是利用PAMAM 树状分子表面上伯胺基团的正电荷对带负电荷的DNA 或RNA吸附作用来达到运载目的的，但静电吸附作用力和共价作用力相比偏弱，稳定性较差。CN201310404541中公开了一种基于PAMAM的自组装纳米基因载体复合物，其是由HA、PAMAM和gene通过相互静电作用自组装组成的复合体系，但静电吸附属于较弱的相互作用，利用此方式负载药物，药物负载量会比通过化学偶联与物理包埋两种方式要小，且稳定性差，缓释效果不明显。CN201410271351中公布了一种具有肿瘤靶向的叶酸-PAMAM-熊果酸纳米药物，该纳米药物所采用的初始材料是高毒性的G3和G5代聚酰胺-胺型树状大分子(PAMAM)，需先通过化学反应将PAMAM 表面的氨基置换成羟基以降低材料本身的毒性，再将叶酸和熊果酸与PAMAM 表面的羟基反应，最终合成目标产物。因此该反应过程复杂，生产成本较高，这在一定程度上限制了它的应用。综上所述，上述研究均采用高代数的PAMAM作为研究对象（PAMAM代数为3~6代），而高代PAMAM合成步骤繁琐，导致成本过高；此外，高代PAMAM表面携带大量氨基，易与生物体内带有负电的各种生物膜相互作用，因此存在较高的细胞毒性，更容易发生溶血现象。

为弥补现有技术的不足，本发明采用低代PAMAM 树状分子作为研究对象。相对于高代PAMAM，低代PAMAM树形分子表面的氨基数量大大减少，毒性也因此大大降低。而且低代PAMAM合成步骤简单，成本低廉，更适合大规模应用。此外，低代PAMAM的空间位阻效应远远小于高代PAMAM，这就为其末端修饰提供了便利。但低代PAMAM自身是不能成纳米胶束的，因此，利用疏水性药物与其偶联，使其具有两亲性特性，并进一步自组装成纳米胶束。从而能够在水性环境下形成稳定的纳米胶束结构。该纳米胶束不仅可独立作为活性分子或前体药用于治疗，还可作为药物载体，进一步包载其他疏水药物，实现对药物的联合治疗，以增强纳米胶束的治疗效果。

不同药物联合用药可以增加靶点，阻断信号转导通路上的多个靶点，也可降低肿瘤的耐药性。本发明首次以低代PAMAM为基础，通过与疏水药物的偶联，不仅改善了药物溶解度较差、生物利用度较低的缺陷，更重要的是构建了两亲性纳米运载体系，赋予其包载药物的潜力，以实现药物的联合应用，对低代PAMAM的此种运用方法还未见报道，具有极大的创新性，有非常大的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于低代PAMAM树状分子的两亲性自组装胶束及其应用，包括其制备方法及其在制药等领域的应用。该纳米胶束基于低代PAMAM（G₀如式III，G₁如式>

III

IV

为达上述目的，本发明提供一种基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束，其特征在于通过化学方法在低代PAMAM 树状分子G₀代（式III）、G₁代（式IV）上引入疏水性药物，增加树状分子的的疏水性，赋予其两亲性，使其在水性介质中可自组装为稳定的纳米胶束；所述的低代PAMAM树状分子，为聚酰胺-胺型树状分子，主要指G₀、G₁代，但不局限于此，符合上述原理即可；所述疏水性药物以羧酸类药物为主，可通过酰胺键与PAMAM树状分子进行偶联，但不局限于此，可与PAMAM树状分子进行化学偶联，使其成为两亲性树状分子即可，所述疏水性药物包括但不限于：抗肿瘤药物包括但不限于此：熊果酸、甲氨蝶呤、氨基喋呤、齐墩果酸、藤黄酸；心血管药物包括但不限于：阿托伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、亚油酸；抗炎药物包括但不限于：阿司匹林在内的水杨酸类、布洛芬在内的芳基烷酸类、甲氯芬那酸在内的芬那酸类；肝病药包括但不限于：熊去氧胆酸。

具体的，一种基于低代PAMAM 树状分子的两亲性纳米自组装胶束，其特征在于其由两亲性偶联物在水中自组装而得；所述的两亲性偶联物如式I或式II所示；

I

II

其中式I中Ra为疏水药物；Rb为氢或疏水药物；Rc为氢或疏水药物；

其中式II中Ra为疏水药物；Rb为氢或疏水药物；Rc为氢或疏水药物；Rd为氢或疏水药物；Re为氢或疏水药物；Rf为氢或疏水药物；Rg为氢或疏水药物；

所述的疏水药物为含有羧基的药物。

所述的疏水药物为熊果酸、甲氨蝶呤、氨基喋呤、培美曲塞、齐墩果酸、四氯芬那酸、苯丁酸氮芥、藤黄酸、雷替曲塞、亚油酸、依那普利、福辛普利、坎地沙坦、吉非贝齐、司帕沙星、阿托伐他汀、甲芬那酸、雷替曲塞、吲哚美辛、氟伐他汀、依达曲沙、匹伐他汀、依达曲沙、亚油酸、全反式维甲酸、9-顺式维甲酸、阿司匹林、水杨酸、布洛芬、甲氯芬那酸、芬那酸或熊去氧胆酸。

优选为熊果酸或阿司匹林。

其自组装的方式为超声震荡。

其在制备抗肿瘤药物中和作为药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束的制备步骤如下：

1. PAMAM-疏水性药物两亲性偶联物的制备

（1）疏水性药物活性中间产物的合成

将疏水性药物溶于有机溶剂中，加入催化剂a、催化剂b，得到活性中间产物；

（2）PAMAM-疏水性药物两亲性偶联物的合成

将低代PAMAM溶于有机溶剂中，加入催化剂c，与上述步骤中得到的活性中间产物进行进一步反应，控制温度至反应完全。然后将反应液在先后在有机溶剂、蒸馏水中透析，最后冻干即可得到两亲性偶联物。

（3）所述合成路线如下：

其中催化剂a、催化剂b包括但不限于：二环己基碳二亚胺（DCC）/ N-羟基丁二酰亚胺（NHS）化学法、1-乙基-（3- 甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）/ N-羟基丁二酰亚胺（NHS）法、亲和素（avidin) / 生物素 (biotin) 法和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）/顺丁烯二酰亚胺（maleimide）化学法；催化剂c包括但不限于：4-(N，N- 二甲基氨基) 吡啶(DMAP)，4-(N，N- 二烯丙基氨基)吡啶(DAAP)。

2. PAMAM-疏水性药物两亲性自组装纳米胶束的制备

取两亲性偶联物溶于水中，超声处理即可得到基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束。经稀释后采用粒度测定仪、扫描电子显微镜等测定自组装复合物在水溶液中的粒径分布和电荷分布进行表征。

3. 以PAMAM-疏水性药物偶联物作为载体，制备含难溶性药物的纳米胶束复合物

取PAMAM-疏水性药物两亲性偶联物及其他疏水药物共溶于有机溶剂中，N₂吹干，加入水，超声处理后即可得到包载药物的基于低代PAMAM>

制备方法为：

（1）将疏水性药物溶于有机溶剂中，加入催化剂a、催化剂b，得到活性中间产物；

（2）将低代PAMAM溶于有机溶剂中，加入催化剂c，与上述步骤中得到的活性中间产物进行进一步反应，处理后，既得基于低代PAMAM 树状分子的两亲性偶联物，其可在水性介质中自组装成为稳定的所述的基于低代PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束。

所述的催化剂a和催化剂b为二环己基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺、1-乙基-（3-甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、亲和素、生物素、N-羟基丁二酰亚胺或顺丁烯二酰亚胺中的两种；

所述的催化剂c：4-(N，N-二甲基氨基)吡啶或4-(N，N- 二烯丙基氨基)吡啶；

具体的：

（1）将疏水药物与NHS、DCC溶于四氢呋喃中，通过搅拌、除杂最后得到的疏水药物-NHS；

（2）取疏水药物-NHS添加到甲醇中，经过搅拌后，在甲醇中透析后、再在水中透析最后干燥可得到疏水药物-低代PAMAM；

（3）两亲性纳米胶束的自组装：取疏水药物-低代PAMAM溶于蒸馏水中，超声震荡后，既得所述的基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束。

更具体的：

（1）将疏水药物与NHS、DCC溶于四氢呋喃中按照摩尔比1:1:1~1:10:10的比例溶于，通过搅拌24~48h、过滤除杂、除去溶剂层析分离后得到的疏水药物-NHS；

（2）取疏水药物-NHS添加到甲醇中，与低代PAMAM 树状分子按照1:2的比例在室温下，磁力搅拌反应48h，后先在甲醇中透析12~24h，然后在水中透析24~48h，最后冷冻干燥可得疏水药物-低代PAMAM；透析所用的透析袋根据需要选择规格，规格为MWCO=500-2000；

（3）取疏水药物-低代PAMAM以1mg/mL的比例溶于蒸馏水，超声震荡后，既得所述的基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束。

其低代PAMAM 树状分子的自组装纳米胶束还可作为载体包载其他疏水药物。

其他疏水药物为：厄洛替尼、索菲替尼、甲氨蝶呤、阿霉素、紫杉醇、大黄素、米非司酮、美她司酮等药物。

制备方法为：将低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束与疏水药物共溶于有机溶剂中，通过挥发或者N₂吹干成膜，按与水质量比1~100：1000的比例来添加水，通过超声即可得到包载其他疏水药物的纳米胶束复合物。

所述的基于低代PAMAM 树状分子的两亲性自组装胶束，不仅可单独作为前体药物或活性分子发挥作用，也可作为纳米载体，包载其他疏水性药物发挥作用，实现药物的联合治疗。

本发明具有以下有益效果：

1. 本发明基于低代PAMAM，相对于而高代PAMAM，低代PAMAM合成步骤简单，成本低廉，更适合大规模应用。而且，低代PAMAM的空间位阻效应远远小于高代PAMAM，这就为其末端修饰提供了便利。此外，高代PAMAM表面携带大量氨基，易与生物体内带有负电的各种生物膜相互作用，因此存在较高的细胞毒性，更容易发生溶血现象。

2. 疏水性药物与低代PAMAM树状分子的化学偶联，可以改善疏水性药物溶解度差、生物利用率较低的缺陷，为解决临床传统化疗药物存在毒性大、安全系数低的问题提供新思路。

3. 合成制备的纳米胶束不仅可以作为活性分子或前体药独立用于疾病治疗，还可作为纳米载体，包载其他疏水药物，实现药物的联合用药，增强疗效。合理的联合用药不仅可以降低毒副反应，还可降低耐药性，提高疗效。

附图说明

图1 熊果酸修饰的基于G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束合成路线图；}

图2 熊果酸修饰的基于G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束合成路线图；}

图3 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束的粒径分布图；}

图4 G₀、G₁、G₅>

图5 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于肝癌细胞（HepG2）的MTT实验结果(4h)；}

图6 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于肝癌细胞（HepG2）的MTT实验结果(24h)；}

图7 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于黑色素瘤细胞(B16F10)的MTT实验结果(4h)；}

图8 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于黑色素瘤细胞(B16F10)的MTT实验结果(24h)；}

图9 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于皮肤鳞状癌细胞(SCL)的MTT实验结果(4h)；}

图10 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于皮肤鳞状癌细胞(SCL)的MTT实验结果(24h)；}

图11 所制备的基于熊果酸、G_{1>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于乳腺癌细胞(MCF-7)的MTT实验结果(4h)；}

图12 所制备的基于熊果酸、G_{1>PAMAM树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于乳腺癌细胞(MCF-7)的MTT实验结果(24h)；}

图13 所制备的基于熊果酸、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性偶联物包载厄洛替尼自组装纳米胶束作用于肺癌细胞(A549)的MTT实验结果(24h)；}

图14 所制备的基于阿司匹林、G_{0>PAMAM 树状分子的两亲性自组装纳米胶束作用于肺癌细胞（A549）的MTT实验结果(24h)；}

图15 所制备的基于阿司匹林、G_{0>PAMAM树状分子的两亲性偶联物包载厄洛替尼自组装纳米胶束作用于肺癌细胞(A549)的MTT实验结果(24h)；}

图16所制备的基于熊果酸、PAMAM树状分子的两亲性偶联物自组装及包载疏水药物过程。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 熊果酸修饰的两亲性树状分子偶联物的合成

（1）基于G₀>0-UA₂为例）

① UA-NHS的合成

取2.28g（5mmol）熊果酸（简称：UA，下同）于150mL圆底烧瓶中，加入50mL四氢呋喃，待UA溶解后，加入用10mL乙腈溶解的1.15g（10mmol）NHS，然后在10~15℃下逐滴滴加用25mL四氢呋喃溶解的2.06g（10mmol）DCC。室温下磁力搅拌24h。反应结束后，过滤除去沉淀物，然后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，得到白色粉末粗品产物。硅胶柱层析分离得到纯净的UA-NHS，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇（v/v）=50:1。其高分辨质谱见图1。

② G_O-UA₂的合成

取0.44g（0.8mmol）UA-NHS于50mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，冰浴滴加0.21g（0.4mmol）G_{0>PAMAM溶液。室温下，避光磁力搅拌48h。反应结束后，把反应液在甲醇中透析（MWCO=1000）24h,然后再在水中透析48h。透析结束后，进行冷冻干燥可到白色粉末，即G0-UA2产物。其高分辨质谱见图2。}

（2）基于G₁>1-UA₁为例）

① UA-NHS的合成

取2.28g（5mmol）熊果酸（简称：UA，下同）于150mL圆底烧瓶中，加入50mL四氢呋喃，待UA溶解后，加入用10mL乙腈溶解的1.15g（10mmol）NHS，然后在10~15℃下逐滴滴加用25mL四氢呋喃溶解的2.06g（10mmol）DCC。室温下磁力搅拌24h。反应结束后，过滤除去沉淀物，然后用旋转蒸发仪除去四氢呋喃，得到白色粉末粗品产物。硅胶柱层析分离得到纯净的UA-NHS，洗脱剂为二氯甲烷:甲醇（v/v）=50:1。其高分辨质谱见图1。

② G₁-UA₁的合成

取0.22g（0.4mmol）UA-NHS于50mL圆底烧瓶中，加入15mL甲醇，滴加到0.21g（0.4mmol）G₁>1-UA₁产物。

实施例2 甲氨蝶呤修饰的两亲性树状分子偶联物的合成（基于G₁>1-Me_>为例）

取0.182g（0.4mmol）甲氨蝶呤（Methotrexate简称：Me，下同）于150mL圆底烧瓶中，加入50mL N,N-二甲基甲酰胺溶解后，加入用10mL乙腈溶解的0.115g（10mmol）NHS，然后在10~15℃下逐滴滴加用25mL四氢呋喃溶解的0.206g（10mmol）DCC。室温下磁力搅拌24h。反应结束后，过滤除去沉淀物，得到活性中间产物的有机溶液；吸取反应液滴加到溶有0.571g（0.4mmol）G₁>

实施例3 阿司匹林修饰的两亲性树状分子偶联物的合成（基于G₀>0-ASP_>为例）

取72mg（0.4mmol）阿司匹林（Aspirin简称：ASP，下同）于150mL圆底烧瓶中，加入50mL二氯甲烷溶解后，加入用10mL乙腈溶解的0.115g（10mmol）NHS，然后在10~15℃下逐滴滴加用25mL四氢呋喃溶解的0.206g（10mmol）DCC。室温下磁力搅拌24h。反应结束后，过滤除去沉淀物，得到活性中间产物的有机溶液；吸取反应液滴加到溶有0.21g（0.4mmol）G₀>

实施例4 熊果酸修饰的两亲性树状分子纳米胶束的合成（以G₀-UA₂为例）

取1mg G₀-UA₂偶联物溶于1mL蒸馏水中，超声震荡15min~1h。超声过程中可以观察到溶液会由浑浊逐渐变为透明胶体的现象。超声结束后，取1uL稀释1000倍后，采用马尔文激光粒度仪测定自组装复合物在水溶液中的粒径。测定结果表明，G₀>

实施例5 熊果酸修饰的包载厄洛替尼的两亲性树状分子纳米胶束的合成

取1mg G₀-UA₂、1mg厄洛替尼共溶于1mL甲醇中，N₂吹干，加入1mL水，超声10min。超声结束即可得到包载厄洛替尼抗癌药物的自组装纳米胶束。取1uL稀释1000倍后，采用粒度测定仪、扫描电子显微镜等测定自组装复合物在水溶液中的粒径分布和电荷分布进行表征。此条件下测得包封率为30%，粒径分布表明，包载厄洛替尼的纳米胶束平均粒径大小为420nm。

实施例6 阿司匹林修饰的包载厄洛替尼的两亲性树状分子纳米胶束的合成

取1mg G₀-ASP₁、1mg厄洛替尼共溶于1mL甲醇中，N₂吹干，加入1mL水，超声10min。超声结束即可得到包载厄洛替尼抗癌药物的自组装纳米胶束。取1uL稀释1000倍后，采用粒度测定仪、扫描电子显微镜等测定自组装复合物在水溶液中的粒径分布和电荷分布进行表征。

实施例7 熊果酸修饰的两亲性纳米胶束作为前体药对肿瘤增殖的抑制作用

MTT法检测药物对肝癌细胞HepG2、黑色素瘤细胞B16F10、皮肤鳞状癌细胞SCL和乳腺癌细胞MCF-7、4T1、肺癌细胞A549的增殖抑制作用

① 取处于对数生长期状态的肿瘤细胞一瓶,消化后制成1×10⁵个/ml>

② 将细胞悬液移入96孔板，每孔100uL，置37℃,5% CO₂培养箱中培养24h。

③ 移去培养基，按照浓度梯度加入自组装复合物，每孔 100uL，另设UA组和PAMAM组。作用24h后(或4h)，去除含药培养基，于每孔中加入无血清、无酚红培养基100uL，再加入MTT溶液10uL，继续孵育4h。

④ 弃去板内上清液，每孔加入100uL DMSO，振荡10min，使用酶标仪检测各孔光吸收值(OD值)，并计算细胞的增殖抑制率：细胞存活率（%）=用药组平均OD值÷空白对照组平均OD值×100%，用 GraphPad Prism 软件进行数据处理，结果见图4~12。

图1、图2为熊果酸修饰低代PAMAM，制备两亲性偶联物的合成路线。图3表明，制备的G₀-UA₂两亲性树状分子自组装纳米胶束粒径分布均匀，平均大小为222nm；由图4可知，G₅PAMAM的毒性远高于低代PAMAM（G₀、G₁代）；图5~12、14表明，经熊果酸、阿司匹林修饰后的G₀PAMAM和G₁>0-UA₂、厄洛替尼，联合用药后的药效明显提高，表明在制备治疗肿瘤的药物方面具有极大的应用前景。