一种新的TGF-β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法

摘要

本发明公开了一种新的TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞工程、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化研究不仅为研究生殖细胞发生、增殖及分化等分子机制和遗传修饰提供了最佳的细胞模型，也为家畜遗传资源保护、转基因动物生产、生殖疾病的治疗及再生医学提供新的思路与途径。目前，研究者们已通过细胞因子、化学试剂、转基因等方法将ESCs诱导分化成的原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)和精原干细胞(Spermatogonial Stem cells,SSCs)，但关于这一过程的调控信号网络知之甚少，有关生殖细胞发生和分化机制的研究已成为近年来备受关注的焦点。ESCs向生殖细胞的分化受到许多内源因子和外源因素的调控，这些因子通过不同的信号通路，构成调控网络，直接或间接地调控生殖细胞的形成。目前，对参与生殖细胞的形成的信号调控已有一定认识，研究表明TGF-β/BMP、Notch、Wnt、MAPK、PI3K/AKT、GDNF、hedgehog等信号参与了生殖细胞的分化和发育过程。

TGF-β(transforming growth factorβ，转化生长因子)蛋白超家族包括TGF-βs、骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)和细胞活素(Activin)等，是一类有保守结构域的二聚体蛋白，其受体均为丝氨酸/苏氨酸激酶受体，其中Smads(mothersagainstdecapentaplegic)信号蛋白是其下游重要的信号分子，在胚胎发育、细胞增殖、分化和细胞基质形成等方面发挥重要的生物学功能。目前对TGF-β信号通路在生殖细胞形成、维持与分化等过程中的作用已有报道。E.Kawase等研究表明，TGF-β经典通路对雄性生殖干细胞维持起到关键作用；Y.Ohinata等报道BMP/smad对生殖细胞发育发挥重要的作用，BMP4基因敲除可导致PGCs缺失；X.J.Zhang等研究表明Smad4蛋白在睾丸生殖细胞的细胞质中广泛表达，并通过BMP信号调控睾丸发育和精子发生；C.M.Denise等通过抑制TGF-β下游信号ALK4，ALK5和ALK7，表明TGF-β信号对睾丸索的形成起关键作用，ALK4和ALK7通过Activin/NODAL受体的信号，可以促进雄性生殖细胞的分化。虽然大量研究表明TGF-β信号通路在哺乳动物生殖细胞分化过程中起重要作用，但是鸟类的相关研究较少。

尽管TGF-β信号通路在生殖细胞的发生等方面的研究已取得一定进展，但它们如何参与生殖细胞的体内发生机制还未阐明且在鸟类尚未有研究。本方法首先利用RNA-seq技术分析了TGF-β信号在鸡ESCs、PGCs和SSCs三种细胞中的表达情况，并从体内和体外水平分别对TGFβ通路进行抑制，通过Western blot、QRT-PCR检测下游分子的表达情况，并采用免疫荧光化学、流式细胞术等方法检测生殖细胞体内及体外分化情况，探讨了TGFβ信号通路在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中的作用，为构建鸡雄性生殖细胞分化的调控网络，揭示生殖细胞形成机制提供实验基础。

鸟类有别于哺乳动物的生殖方式是本方法成功应用的前提:鉴于鸡独特的胚胎发育过程，可从囊胚中获得大量的ESCs，极大满足了人类研究和生产实践的需要,而且鸡为卵生动物，可以在发育的任何时期，进行鸡胚注射等多种体外操作。

然而有优点就会有缺陷，本方法中鸡胚注射实验的效果取决于抑制剂注射后的随机扩散程度，这可能会影响部分实验进程。

发明内容

本发明目的在于为人们提供一种新的TGF-β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法。

本发明包括以下步骤：

(1)基于RNA-seq数据对TGF-β信号通路富集；

取新鲜受精蛋，依次用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面，用镊子将蛋钝头敲碎，药勺法无菌取出胚盘，将胚盘放入PBS中漂洗3遍获取ESC细胞；

取孵化至4.5d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获鸡胚，PBS中漂洗3次，体视显微镜下剥取生殖脊，利用胰酶进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1000×g离心6min，因子培养基悬浮，获取PGC细胞；

取孵化至18d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获取睾丸，PBS中漂洗3次，通过胶原酶、胰酶两步消化法对睾丸进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1 000×g离心8min，因子培养基悬浮，获取SSC细胞；

并分别提取ESC、PGC和SSC的RNA，构建测序文库并用Illumina HiSeqTM2000进行测序；对测序后的差异基因进行pathway富集并对TGF-β信号通路进行筛选；

(2)TGF-β信号通路初步分析；

对TGF-β信号信号通路上差异基因在ESC,PGC和SSC中的表达变化进行分析，初步确定该信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程调控作用以及该信号通路信号传递机制；

(3)体外验证TGF-β信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的功能；

取正常发育的鸡胚，分组情况如下：对照组：正常ESCs，添加普通培养基；实验组：①BMP4(40ng/ml)；②BMP4(40ng/ml)+TGFβ受体抑制剂(LY2109762)；③BMP4(40ng/ml)+BMP4受体抑制剂(LDN193189)；④BMP4(40ng/ml)+TGFβ受体抑制剂+BMP4受体抑制剂。细胞在诱导培养过程中每个1天取样一次同时进行如下实验：

a.形态观察及鉴定：采用倒置显微镜，比较实验组与对照组细胞的分化情况的差异。间接免疫荧光对诱导后的细胞进行表面蛋白检测；b.基因检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，QRT-PCR检测生殖细胞的表达情况和TGF-β信号通路受体基因的表达情况；c.蛋白检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，western检测生殖标记蛋白的表达情况和TGF-β信号通路受体蛋白的表达情况；d.流式细胞分析：收集将各组诱导后的细胞，流式细胞法统计细胞的分化效率(生殖细胞标记基因阳性细胞)。

(4)GFβ信号通路调控ESCs向雄性生殖细胞分化功能的体内验证；

取正常发育的鸡胚，分组情况如下，空白组：正常鸡胚，不经任何处理，直接孵化；对照组：通过开窗将胚盘暴露，注射等量ddH2O，再将窗口封闭，进行孵化；实验组：将候选信号通路抑制剂注射到胚盘中，再将窗口封闭，进行孵化；①TGFβ受体抑制剂(LY2109762)；②BMP4受体抑制剂(LDN193189)；③TGFβ受体抑制剂+BMP4受体抑制剂。鸡胚孵化过程中于0h，132h以及18d取样并进行如下实验。a.免疫组织化学：同时分别收集鸡胚发育过程中0h(对照)、72h(PGCs开始迁移至生殖嵴)、132h(PGCs已全部迁移至生殖嵴)、以及18d的睾丸样本，通过组织切片法结合免疫组织化学法统计鸡胚发育至0h、132h PGCs的数量及形态变化，以及18d SSCs的数量及形态变化，并与正常发育条件下进行比较。b.基因检测：对上述收集的样本通过QRT-PCR检测生殖标记基因表达情况和TGF-β信号通路受体基因的表达情况。c.蛋白表达：对上述收集的样本通过western检测生殖标记蛋白表达情况和和TGF-β信号通路受体蛋白的表达情况。

本方法的发明，主要为了提供一种新的TGF-β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法。

采用本方法，能够实现在鸡胚胎干细胞水平完成信号通路功能的验证，这是目前在其他物种中无法完成的一种新方法。

本发明的优越性在于：

1、能够较快的在的鸡生殖细胞水平完成信号通路功能的验证。

2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。

3、开辟了一条新的在未建系的鸡胚胎干细胞水平进行信号通路功能验证的方法。

4、该方法体外实验适用于其他物种，但是体内实验不适用于其他。

通过本发明，首先基于RNA-seq数据源进行关键信号通路富集并筛选，对筛选的TGF-β信号通路中差异表达基因进行分析，初步确定该信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的调控作用以及信号转导方式；利用TGFβ受体抑制剂(LY2109762)，BMP4受体抑制剂(LDN193189)在体内和体外两个水平对TGF-β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；在体外实验过程中以本实验室前期建立的BMP4诱导体系为阳性对照，自分化体系为空白对照，设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。采用qRT-PCR和Western Blot实验检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，同时利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；在体内实验过程中以正常孵化过程为阳性对照，采用鸡胚注射的方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，采用qRT-PCR和Western Blot实验检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，同时利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。

本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效在短时间内完成一条信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中调控功能的验证。

附图说明

图1为基于RNA-Seq数据中差异表达基因对鸡雄性生殖细胞分化过程中关键信号通路进行富集并筛选图。

图2为LY2109762和LDN193189抑制剂对TGF-β信号通路抑制示意图。

图3为TGFβ信号抑制后smads在不同处理组诱导细胞中的表达图。

图4为TGFβ信号通路体外验证，不同处理组诱导不同天数细胞形态变化图。

图5为TGFβ信号通路体外验证免疫细胞化学检测蛋白表达情况图。

图6为TGFβ信号通路体外验证，QRT-PCR检测不同处理组诱导不同天数相关基因变化情况图。

图7为TGFβ信号通路体外验证，流式细胞检测体外诱导过程中相关蛋白表达图。

图8为TGFβ信号抑制后smads在体内发育5.5d、18d性腺中的表达图；

图9为TGFβ信号通路体内验证，QRT-PCR检测法鸡胚发育5.5d和18d生殖细胞标记基因的表达情况图。

图10为TGFβ信号通路体内验证，式细胞检测图。

具体实施方式

(1)基于RNA-seq数据对TGF-β信号通路富集；

取新鲜受精蛋，依次用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面，用镊子将蛋钝头敲碎，药勺法无菌取出胚盘，将胚盘放入PBS中漂洗3遍获取ESC细胞；

取孵化至4.5d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获鸡胚，PBS中漂洗3次，体视显微镜下剥取生殖脊，利用胰酶进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1000×g离心6min，因子培养基悬浮，获取PGC细胞；

取孵化至18d的受精蛋，用新洁尔灭、75％酒精洗蛋表面；无菌获取睾丸，PBS中漂洗3次，通过胶原酶、胰酶两步消化法对睾丸进行消化，消化液用400目滤布过滤入离心管中，1 000×g离心8min，因子培养基悬浮，获取SSC细胞；

并分别提取ESC、PGC和SSC的RNA，构建测序文库并用Illumina HiSeqTM2000进行测序；对测序后的差异基因进行pathway富集并对TGF-β信号通路进行筛选；

(2)TGF-β信号通路初步分析；

对TGF-β信号信号通路上差异基因在ESC,PGC和SSC中的表达变化进行分析，初步确定该信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程调控作用以及该信号通路信号传递机制；

(3)体外验证TGF-β信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的功能；

取正常发育的鸡胚，分组情况如下：对照组：正常ESCs，添加普通培养基；实验组：①BMP4(40ng/ml)；②BMP4(40ng/ml)+TGFβ受体抑制剂(LY2109762)；③BMP4(40ng/ml)+BMP4受体抑制剂(LDN193189)；④BMP4(40ng/ml)+TGFβ受体抑制剂+BMP4受体抑制剂。细胞在诱导培养过程中每个1天取样一次同时进行如下实验：a.形态观察及鉴定：采用倒置显微镜，比较实验组与对照组细胞的分化情况的差异。间接免疫荧光对诱导后的细胞进行表面蛋白检测；b.基因检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，QRT-PCR检测生殖细胞的表达情况和TGF-β信号通路受体基因的表达情况；c.蛋白检测：各组细胞处理0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d后，收集细胞，western检测生殖标记蛋白的表达情况和TGF-β信号通路受体蛋白的表达情况；d.流式细胞分析：收集将各组诱导后的细胞，流式细胞法统计细胞的分化效率(生殖细胞标记基因阳性细胞)。

(4)TGFβ信号通路调控ESCs向雄性生殖细胞分化功能的体内验证；

取正常发育的鸡胚，分组情况如下，空白组：正常鸡胚，不经任何处理，直接孵化；对照组：通过开窗将胚盘暴露，注射等量ddH2O，再将窗口封闭，进行孵化；实验组：将候选信号通路抑制剂注射到胚盘中，再将窗口封闭，进行孵化；①TGFβ受体抑制剂(LY2109762)；②BMP4受体抑制剂(LDN193189)；③TGFβ受体抑制剂+BMP4受体抑制剂。鸡胚孵化过程中于0h，132h以及18d取样并进行如下实验。a.免疫组织化学：同时分别收集鸡胚发育过程中0h(对照)、72h(PGCs开始迁移至生殖嵴)、132h(PGCs已全部迁移至生殖嵴)、以及18d的睾丸样本，通过组织切片法结合免疫组织化学法统计鸡胚发育至0h、132h PGCs的数量及形态变化，以及18d SSCs的数量及形态变化，并与正常发育条件下进行比较。b.基因检测：对上述收集的样本通过QRT-PCR检测生殖标记基因表达情况和TGF-β信号通路受体基因的表达情况。c.蛋白表达：对上述收集的样本通过western检测生殖标记蛋白表达情况和和TGF-β信号通路受体蛋白的表达情况。

本发明中，图1，基于RNA-Seq数据中差异表达基因对鸡雄性生殖细胞分化过程中关键信号通路进行富集并筛选。筛选结果表明TGF-β等信号通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中有重要调控作用。

图2 LY2109762和LDN193189抑制剂对TGF-β信号通路抑制示意图。

图3 TGFβ信号抑制后smads在不同处理组诱导细胞中的表达。LY-100组与LDN-100组smad2和smad5的蛋白和基因水平的表达显著降低，双抑制组则显著低于单抑制组。A:western blot检测；B:qRT-PCR检测。

图4 TGFβ信号通路体外验证：不同处理组诱导不同天数细胞形态变化。

图5 TGFβ信号通路体外验证免疫细胞化学检测蛋白表达情况。免疫细胞化学检测蛋白表达情况，信号通路抑制后生殖样细胞阳性克隆显著的减少。BMP4诱导组诱导后的细胞表达integrinα6、integrinβ1、Dazl、C-kit蛋白，单抑制组仅有少量细胞表达c-kit蛋白，双抑制组未检测到以上蛋白。

图6 TGFβ信号通路体外验证：QRT-PCR检测不同处理组诱导不同天数相关基因变化情况。

图7 TGFβ信号通路体外验证，流式细胞检测体外诱导过程中相关蛋白表达。

图8 TGFβ信号抑制后smads在体内发育5.5d、18d性腺中的表达；

图9 TGFβ信号通路体内验证，QRT-PCR检测法鸡胚发育5.5d和18d生殖细胞标记基因的表达情况，结果表明，生殖特异基因c-kit、cvh、Dazl、Stra8、integrinα6在各抑制组的表达量显著低于空白组和对照组，双抑制组与单抑制组差异不显著；integrinβ1的表达在各组间差异不显著。

图10 TGFβ信号通路体内验证：式细胞检测结果表明：5.5d，各抑制组c-kit阳性细胞比例较对照组显著减少；18d，各抑制组integrina6阳性细胞比例也显著少于对照组；且双抑制组的c-kit和integrina6阳性细胞的比例均低于单抑制组。