枯草芽孢杆菌JTFM1001及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用

摘要

本发明涉及微生物肥料技术领域，具体公开枯草芽孢杆菌JTFM1001、菌剂及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用。本发明公开的解淀粉芽胞杆菌由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2016145。本发明公开的解淀粉芽胞杆菌对侵染玉米的黄曲霉菌及毒素污染防治效果明显，该菌株具有较强的抑菌和解毒活性。本发明还提供一种含有该菌种的微生物有机肥，该有机肥施入土壤后，拮抗菌能够在作物根际快速繁殖并长期生存，形成优势菌群，施用本微生物有机肥能有效防治黄曲霉菌对玉米的污染，同时能减少化学农药的残留，在农产品质量安全应用中前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物肥料技术领域，具体公开一种抗菌解毒的枯草芽孢杆菌JTFM1001、含菌有机肥及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用。

背景技术

玉米是世界上重要的粮食作物，也是重要的饲料原材料。目前，在玉米的储藏过程中不可避免的产生霉菌毒素，解决霉菌毒素，特别是黄曲霉毒素对玉米等粮食和饲料的污染是一个世界性难题。黄曲霉毒素（AF）是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次生代谢产物，是一类理化性质和结构相似的真菌毒素。黄曲霉毒素污染给玉米、花生等农作物的生产带来严重损失，每年导致的经济损失高达数百亿美元。黄曲霉毒素是广泛污染农产品的一类强致癌、剧毒性真菌毒素，其中JTFM1最普遍且毒性最强，人或动物食用受毒素污染的农产品后会导致机体病变甚至死亡，严重威胁消费者健康与生命安全。因此，加强玉米等农产品中黄曲霉毒素污染的防控刻不容缓。

黄曲霉菌对玉米的侵染主要发生在田间生长时期，毒素产生和污染主要在储藏时期，因此，如何防控好田间黄曲霉菌对玉米的侵染至关重要。目前，对玉米生长时期黄曲霉菌侵染的防控没有理想的措施，一般以化学防治为主。由于化学防治成本较高和易污染环境，而且病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性，所以，寻找一种对人体健康、对环境友好的防控措施势在必行。国内外研究发现自然界中有许多种微生物能抑制和降解生长期和储藏期玉米或饲料中的黄曲霉毒素，这些微生物包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌及藻类等。采用微生物制剂或其产生的酶类抑菌降毒，不会破坏生态环境，不降低农产品品质，而且有些种类还能增加产品的营养价值。

以黄曲霉菌及毒素为研究对象，从健康的玉米籽粒中分离内生细菌，并采用活体方法筛选拮抗细菌，研究其抗菌活性，以期为玉米黄曲霉毒素污染的防控瓶颈问题的解决探索新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较强的抑菌和解毒活性的枯草芽孢杆菌JTFM1001。

本发明的另外目的是提供该菌株在防控黄曲霉菌对玉米污染中的应用，以及发酵制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥及其发酵制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ：

一种抗菌解毒的枯草芽孢杆菌JTFM1001，保藏编号为CCTCC NO:M 2016145，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期：2016年3月28日。

枯草芽孢杆菌JTFM1001的分离及筛选方法如下：

选取河北、山东、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，将称重后的玉米籽粒在无菌三角瓶中用3%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，沥干水分。用镊子夹住玉米籽粒，将籽粒用无菌剪刀平均分成3等份，放置在牛肉膏蛋白胨培养基平板中，于28℃恒温培养，每天观察菌落生长状况，并及时挑取特征差异明显、分离良好的单菌落，进一步纯化获得单菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上保藏备用。

形态学特征：

形态观察发现，菌株JTFM1001在LJTFM培养基上菌落圆形，边缘不规则，表面较光滑，不产色素；菌体杆状，大小为(0.9～1.2) um×(2.8～3.2) um；革兰氏染色阳性；产芽孢，芽孢椭圆形；具有运动性，证明该菌株为芽孢杆菌。

生理生化特征：

菌株JTFM1001接触酶反应、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纤维二糖均为阳性，氧化酶、D-阿拉伯糖等试验均为阴性。菌株生理生化测定结果见表1，发现该菌株与枯草芽孢杆菌的特征基本相似，因此判断该菌株可能为枯草芽孢杆菌。

表1 菌株JTFM1001 生理生化特性

接触酶氧化酶甘油D-阿拉伯糖D-木糖葡萄糖+-+-++果糖甘露糖山梨醇淀粉水解肌醇纤维二糖++++++

16S rDNA分子鉴定:

以菌株JTFM1001基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到该菌株1.48 kb左右的16S rDNA。测序结果表明该菌株16S rDNA序列长度为1477 bp（见附件）。BLAST分析发现该菌株的16SrDNA序列与芽孢杆菌属细菌的16S rDNA相似，调出其中已鉴定菌株的16S rDNA，用ClustalW进行多重序列对比。结合JTFM1001形态特征及生理生化指标测定等鉴定结果，通过16SrDNA方法（其16S rDNA如SEQ ID N0：1所示将菌株JTFM1001鉴定为枯草芽孢杆菌。

本发明还提供一种保藏编号为CCTCC NO:M 2016145的菌株在防控黄曲霉菌对玉米污染中的应用。

本发明还提供一种保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株在制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥中的应用。

采用保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株发酵制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥。

本发明还提供一种微生物有机肥，所述有机肥中保藏编号为CCTCC NO:M 2016145的菌株含量在1.5×10⁸cfu/g以上，有机质含量为38-45%。

本发明还提供了采用保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株制备的微生物有机肥的工业化生产方法，包括步骤如下：

1) 将保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株接种到液体培养基中，进行发酵生产。

该液体培养基为：玉米粉3.3%、蛋白胨1.45%、K₂HPO₄+KH₂PO_{4>0.45%，水 1000ml，pH7.0-7.3。}

该发酵生产的条件为：培养温度31-34 ℃，搅拌速度185-225 rpm，发酵后使发酵液中菌株含量在1×10^{9>cfu/ml以上。}

2) 将步骤1）所得发酵菌液与木薯渣与畜禽粪便混合物进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机肥中加入发酵菌液20L，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束。

3）将固体发酵后的有机肥在≤60℃干燥至含水量≤30%即可包装成品。

本发明提供的微生物有机肥的工业化生产方法的优选技术方案如下：

步骤1）中所述K₂HPO₄和KH₂PO₄的重量比为1:1。

步骤1）中所述液体培养基在115-125℃灭菌15-30min ，优选在121℃灭菌20min。

步骤2）中所述木薯渣与畜禽粪便混合物经过85℃腐熟。

步骤2）中所述木薯渣与畜禽粪便的发芽指数≥95%，有机质含量≥35%，含水量质量比20-25%。

本发明还提供一种所述微生物有机肥料在防治玉米上黄曲霉菌中的应用。

采用上述技术方案的本发明与现有技术相比，有益的技术效果如下：

1、保藏编号为CCTCC NO:M 2016145 枯草芽孢杆菌JTFM1001是从河北玉米籽粒中分离获得，经室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株抑菌能力较强，抑菌解毒效果好且稳定，容易培养，无污染，对环境安全。

2、本发明提供含有该菌株的有机肥，该有机肥施入土壤后，该菌株能够在作物根际快速繁殖并长期生存，形成优势菌群，施用本微生物有机肥既能防治黄曲霉毒素对农产品的污染，同时能减少化学农药的残留，在现代农业种植及农产品质量安全应用中前景广阔。

菌株保藏情况：保藏于中国典型培养物保藏中心（简称 CCTCC），保藏地址为中国.武汉.武汉大学。保藏编号为CCTCC NO:M 2016145，分类命名为枯草芽孢杆菌JTFM1001，拉丁文名称：Bacillus amyloliquefaciens JTFM1001。保藏日期为 2016年3月28日。

附图说明

图1 为本发明枯草芽孢杆菌JTFM1001对黄曲霉的拮抗作用图。

图2为本发明枯草芽孢杆菌JTFM1001对玉米籽粒上黄曲霉毒素的抑制能力。

图3为本发明双抗生防菌株存活时间图。

具体实施方式

下面结合具体实施例为本发明进行进一步的描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。

实施例1：保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株的分离和鉴定

选取河北、山东、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，将称重后的玉米籽粒在无菌三角瓶中用3%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，沥干水分。用镊子夹住玉米籽粒，将籽粒用无菌剪刀平均分成3等份，放置在牛肉膏蛋白胨培养基平板中，于28℃恒温培养，每天观察菌落生长状况，并及时挑取特征差异明显、分离良好的单菌落，进一步纯化获得单菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上保藏备用。

形态学特征：

形态观察发现，菌株JTFM1001在LJTFM培养基上菌落圆形，边缘不规则，表面较光滑，不产色素；菌体杆状，大小为(0.9～1.2) um×(2.8～3.2) um；革兰氏染色阳性；产芽孢，芽孢椭圆形；具有运动性，证明该菌株为芽孢杆菌。

生理生化特征：

菌株JTFM1001接触酶反应、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纤维二糖均为阳性，氧化酶、D-阿拉伯糖等试验均为阴性。菌株生理生化测定结果见表1，发现该菌株与枯草芽孢杆菌的特征基本相似，因此判断该菌株可能为枯草芽孢杆菌。

表1 菌株JTFM1001 生理生化特性

接触酶氧化酶甘油D-阿拉伯糖D-木糖葡萄糖+-+-++果糖甘露糖山梨醇淀粉水解肌醇纤维二糖++++++

16SrDNA分子鉴定:

以菌株JTFM1001基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到该菌株1.48 kb左右的16S rDNA。测序结果表明该菌株16S rDNA序列长度为1477 bp（见附件）。BLAST分析发现该菌株的16SrDNA序列与芽孢杆菌属细菌的16S rDNA相似，调出其中已鉴定菌株的16S rDNA，用ClustalW进行多重序列对比。结合JTFM1001形态特征及生理生化指标测定等鉴定结果，通过16SrDNA方法（其16S rDNA如SEQ ID N0：1所示将菌株JTFM1001鉴定为枯草芽孢杆菌。

实施例2：保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株对玉米黄曲霉菌的抑制效果实验

枯草芽孢杆菌JTFM1001等生防菌株的生物活性测定：

（1）枯草芽孢杆菌JTFM1001作用：采用对峙培养法对黄曲霉菌内生拮抗细菌进行筛选。将预先准备好的黄曲霉菌菌碟置于斜面培养基平板中央，然后用高温灭菌的牙签蘸取内生细菌，等距离(距病原菌2cm处)对称点接到斜面培养基平板上，于28℃黑暗培养，3-7d观察抑菌带的有无及大小，重复3次。选出抑菌带较宽的内生细菌菌株在花生颗粒上进行复筛。所实验的350株菌株中，枯草芽孢杆菌JTFM1001菌株对黄曲霉菌的抑制作用最强，见图1，表2指出所应用的效果较好10株生防菌对黄曲霉菌的抑制率。

表2 枯草芽孢杆菌JTFM1001等生防菌株对黄曲霉菌的抑制率（%）

注：表中的实验数据为三次重复的平均值。

（2）枯草芽孢杆菌JTFM1001等8株生防菌活体生防效果实验

>

>6孢子·mL^-1和培养7天生长旺盛的黄曲霉菌菌悬液，孢子最终浓度为1.5.0×10⁶孢子·mL^-1分别浸泡玉米种30min，阴凉处被干后放入无菌平板，每板30粒玉米，放入光照培养箱培养10d。

培养箱培养条件为：温度28℃，湿度70-80%，光照为12 h黑暗/12 h光照。以不浸菌液为空白对照，每处理设3次重复。计算生防菌对黄曲霉菌防治效果及抑毒率，见表3和图2。

结果表明获得的内生细菌在籽粒上表现出较好防病效果，对黄曲霉菌毒素污染抑制率较高。较好的8株拮抗细菌对黄曲霉菌的防病效果分别达42.5%-75.0%，其中，菌株JTFM1001对黄曲霉菌的防效最高，达75.0%，其次为菌株JTFM96-1和JTFM88-5，防效分别为71.5%和68.5%。抑毒效果较好的菌株分别为JTFM1001、JTFM21-3及JTFM41-1，抑制率分别为70.5%、68.5%及62.7%。

表3 8株拮抗菌对黄曲霉菌的防治效果及抑毒率

调查指标JTFM1001JTFM96-1JTFM88-5JTFM21-3JTFM41-1JTFM101-2JTFM18-2JTFM50-4防治效/%75.071.568.565.055.550.045.542.5抑毒率/%70.560.357.068.562.755.053.545.0

注：数据为三次重复的平均值

实施例3：保藏编号为CCTCC NO:M 2016145 的菌株发酵制备微生物有机肥及其制备方法

采用保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株发酵制备防控田间黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥，该有机肥中保藏编号为CCTCC NO:M 2016145 的菌株含量在1.5×10⁸cfu/g以上，有机质含量为38-45%。

该微生物有机肥的工业化生产方法，步骤如下：

1) 将保藏编号为CCTCC NO:M 2016145 的菌株接种到液体培养基中，进行发酵生产。

该液体培养基为：玉米粉3.3%（按重量比计）、蛋白胨1.45%（按重量比计）、K₂HPO₄+KH₂PO_{4>0.45%（按重量比计），水 1000ml，pH 7.2。}

其中K₂HPO₄和KH₂PO₄的重量比为1:1。

其中液体培养基在121℃灭菌20min。

该发酵生产的条件为：培养温度32-35 ℃，搅拌速度185-225 rpm，发酵后使发酵液中菌株含量在1×10^{9>cfu/ml以上；}

2) 将步骤1）所得发酵菌液与木薯渣与畜禽粪便混合物进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机肥中加入发酵菌液20L，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，6天即可发酵结束。

其中木薯渣与畜禽粪便混合物经过 85 ℃腐熟。

其中木薯渣与畜禽粪便的发芽指数≥95%，有机质含量≥35%，含水量质量比20-25%。

3）将固体发酵后的有机肥在≤60℃干燥至含水量≤30%即可包装成品。

实施例4：保藏编号为 CCTCC NO:M 2016145的菌株发酵制备微生物有机肥对玉米黄曲霉菌的抑制效果实验

枯草芽孢杆菌JTFM1001生物菌肥田间防效、抑毒率及促生作用

田间试验小区随机设计，3个重复，每个小区的面积为15m×3m。将生防制剂以每亩4公斤 (1.5×10⁸孢子·g^{-1>)，于玉米播种时随肥料施入，设置化学防治方法（70 %甲基托布津可湿性粉剂0.5g/棵 ）及对照，农药的施用方法同生防制剂。花生收获后每处理随机调查4个点，每点10株。计算拮抗菌抑毒率及对玉米促生效果，结果见表4和图3。}

结果表明获得的内生细菌对玉米生长表现出一定的促生效果，对黄曲霉菌毒素污染抑制率较高。较好的8株拮抗细菌对玉米促生效果最高可达6.5%，其中，菌株JTFM1001对黄曲霉菌的效果最高，为6.5%，其次为菌株JTFM21-3和JTFM96-1，促生效果分别为3.5%和3.1%。抑毒效果较好的菌株分别为JTFM1001、JTFM96-1及JTFM41-1，抑制率分别为55.0%、44.5%及33.2%。

表4 拮抗菌对黄曲霉菌产毒抑制率及对玉米促生效果

调查指标JTFM1001JTFM96-1JTFM88-5JTFM21-3JTFM41-1JTFM101-2JTFM18-2促生率 %6.53.12.83.52.20.01.8抑毒率/%55.044.50.00.033.220.50.0

代谢物对黄曲霉菌的抑制作用

生防菌代谢产物的制备

生防菌JTFM1001在LB斜面上活化后，取一环于LB培养液中，100mL/300 mL装液量，37℃ ，160 r/min振荡培养48 h后，制备成以下处理液：上清液：培养液在12000 r/min下离心15 min，取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤后得到无菌的上清液。

菌悬液：培养液在12000 r/min下离心15 min，弃上清，用无菌水清洗3次再离心，加入无菌水。

蛋白粗提液：培养液于4℃下12000 r/min离15min弃沉淀，在上清液中加固体硫酸铵至70％饱和度，4 ℃静置过夜，于4 ℃下10000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀用1/25体积10 mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液悬浮，然后用0.22μm细菌过滤器过滤除掉可能存在的细菌。

生防菌代谢产物对黄曲霉菌菌丝生长的影响

测定方法：取黄曲霉菌菌悬液1×10⁶>

同时，研究了生防菌上清液和过滤液在50、60、70、80、90、100 ℃下的热稳定性实验，热稳定性实验在水浴锅中浸加热1 h，121℃温度下处理20 min。实验结果如表5和表6。

结果显示生防菌培养液对黄曲霉菌菌丝生长的抑制作用均为100%；蛋白粗提液的抑制作用也很强，达到90%以上；生防菌过滤液和冻过滤抑菌率均在35%以上，其中JTFM1001抑菌率最强，分别达到62.5%和55.5%，其次是JTFM96-1，达到56.5%和52.0%；生防菌的上清液和冻上清抑菌率在50%以上，其中JTFM1001抑菌率最强，分别达到67.0%和68.5%，其次是JTFM96-1，达到62.5%和55.2%，见表5。

实验结果表明，高温对一些生防菌代谢产物能产生显著影响，其中菌株JTFM1001、JTFM88-5和JTFM101-1，超过60℃将失去对黄曲霉菌孢子萌发及菌丝生长产生抑制作用，说明这3株生防菌产生的活性物质对热敏感，见表6。

表5生防菌代谢产物对黄曲霉菌生长的抑制作用

表5温度对生防菌代谢产物的影响作用

生防菌的定殖试验

Rif 和Nal双抗标记菌株的制备

在LB液体培养基中37 ℃过夜摇培JTFM1001菌株，5000rpm，离心2min收集菌体，均匀的涂在含有Nal抗生素(终浓度为50µg/mL )的LB平板上，35℃静置培养。待平板上长出抗Nal的单菌落时，挑选出长势好的单菌落划线接种在含有Nal的LB平板上，连续转接3代，如果该菌落长势稳定且与野生型菌株差异不大，则选为诱导得到抗Nal的突变菌株，命名为JTFM1001-N。

在含有Nal抗生素(终浓度为50 µg/mL )的LJTFM液体培养基上35℃过夜摇培突变菌株JTFM1001-N，5000rpm，离心2min收集菌体，均匀的涂在含有Nal＋Rif抗生素(Nal，50ug/ml；Rif，150 ug/ml)的LB双抗平板上，35℃静置培养。待平板上长出抗Nal＋Rif的单菌落时，挑选出长势最好的单菌落划线接种在含有Nal＋Rif的LB平板上，连续转接3代，如果该菌落长势稳定且与野生型菌株差异不大，则为诱导得到抗Nal＋Rif的突变菌株，命名为JTFM JTFM1001-NR。

JTFM1001-NR菌株孢悬液的制备及玉米种子土壤处理

玉米种子用1.5×10⁸>-1稀释液，用10^-3和10^-4的稀释液涂双抗LJTFM平板(Nal，12.5µg/mL>

本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效变化，均包含于本发明的权利范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 唐山市畜牧水产品质量监测中心

<120> 枯草芽孢杆菌JTFM1001及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1264

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens JTFM1001

<400> 1

aaactattga gacagaggtc cacgagcgca ctagctagtt ggcgaggtaa cgatcttcaa 60

ggtaccgatg cgtagacaac gtagagggag atcggccaca atggagtgag acacggacca 120

gagtctaagg gaggcagcag tagggaattt tccgcaaaag aagaaagtct gacggagcaa 180

cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggata gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt 240

accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 300

gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg 360

gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat 420

tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtaaat 480

gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 540

gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 600

gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 660

ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 720

aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 780

tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 840

ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 900

gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 960

gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1020

aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1080

cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1140

tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1200

agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc gaaggggaca 1260

gagg 1264