一种复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用

摘要

本发明涉及一种复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA‑Ni2+及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用，属于纳米磁性材料和生物分析技术领域。本发明以平均水合粒径为100～400nm的Fe3O4磁性纳米粒为核，采用MPS表面修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100～600nm的多羧基结构磁性纳米粒子，然后进一步偶联NTA‑Ni2+得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA‑Ni2+。本发明制得的复合磁性纳米粒子可在纳米尺度上控制包覆层的厚度，制得的复合磁性纳米粒子尺寸分布均匀，磁性强，成本低，具有较高的富集和分离纯化组氨酸标签蛋白质的能力，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40～70μg/mg复合磁性纳米粒子，且可重复使用。

说明书

技术领域

本发明属于纳米磁性材料和生物分析技术领域，具体涉及一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用。

背景技术

传统的蛋白质分离纯化方法有电泳、层析、离心、透析、过滤等，其中金属螯合亲和色谱方法被认为是最有效的方法之一。虽然金属螯合亲和色谱方法在组氨酸标签蛋白质分离纯化方面有很多优势，但仍存在效率低、成本高、分离纯化步骤繁琐等缺点，从而无法达到分离要求。金属螯合亲和色谱方法和磁分离技术相结合对蛋白质进行分离纯化已成为生物医学研究以及生物工程技术领域的一个研究热点。它是通过对磁性纳米颗粒进行表面改性，与能被目标蛋白质结合的配基偶联，利用外部磁场实现蛋白质的分离纯化。该法具有操作简单、快速、高效富集和高重复使用率等优点。

核壳结构复合磁性纳米粒子因具有分散性和稳定性好、易于表面功能化等优点得到广泛应用。徐兵等采用NTA对铂铁合金纳米颗粒进行表面修饰，再螯合镍离子应用于分离纯化组氨酸标签的重组蛋白，结果表明其纯化效率相比市售的商业磁性微球大大提高(Xu C,Xu K,Gu H,Zhong X,Guo Z,etal.Nitrilotriacetic Acid-Modified MagneticNanoparticles as a General Agent to Bind Histidine-Tagged Proteins.J.Am.Chem.Soc.2004,126,3392.)，但由于合成的铂铁合金纳米颗粒只有10nm，磁响应性较低，较难实现在外磁场操控下的快速吸附与移动，从而受到一定限制。美国专利(USP4654267)公开了一种应用于蛋白质分离纯化的高分子磁性微球，但合成过程繁琐，所得磁性微球的磁响应程度低。韩国的一个小组合成了修饰镍离子的磁性纳米粒子，成功的应用于组氨酸标签蛋白质的分离纯化，但它的磁响应性很弱(2emu/g)，不利于提高蛋白质的分离纯化效率。另外，Xie等以PEI为交联剂，在磁性纳米颗粒表面包覆上金壳，然后再用NTA修饰并与Ni²⁺螯合，所得纳米复合物可以快速、选择性地分离出组氨酸标签蛋白质(Xie>3O₄/Au>2+-Nitrilotriacetic>

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺及其制备方法和其在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用。本发明制备方法简单，制得的Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺复合磁性纳米粒子稳定性高、粒径分布窄、可高效富集和快速分离纯化组氨酸标签蛋白质。

为了实现本发明的上述第一个目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺，是由磁性Fe₃O₄纳米粒子为核，通过MPS在其表面引入双键，再加入丙烯酸单体在Fe₃O₄/MPS表面聚合形成聚丙烯酸壳，最后与NTA-Ni²⁺偶联得到，所述复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的分子结构式如下式一所示：

其中：所述的MPS为(3-(异丁烯酰氧基)-丙基三甲氧基硅烷)，所述的PAA为聚丙烯酸，所述的NTA为次氮基三乙酸。

进一步地，上述技术方案中所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为100nm～600nm。

本发明的另一目的在于提供上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：将六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、醋酸铵(NH₄AC)和柠檬酸钠溶解于乙二醇中，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，于200℃反应8～16h，冷却至室温，磁分离或离心分离，将制得的磁性Fe₃O₄纳米粒子用无水乙醇洗涤3～4次后分散在无水乙醇中；

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性，具体步骤如下：将步骤一制得的Fe₃O₄纳米粒子进行磁分离后分散在无水乙醇和超纯水中，混合搅拌，加入浓 氨水和正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌2～6h；再加入MPS于70℃下反应3～10h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS，用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，制得Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液；

所述的Fe₃O₄、TEOS、MPS、浓氨水质量之比为1:0.2～2:2～10:10～60。

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：取上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入丙烯酸(AA)、N,N-亚甲基丙烯酰胺(bis-AM)、偶氮二异丁腈(AIBN)，通N₂混合搅拌10～20min，然后加热至40～60℃并在此温度下保持3～6h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS/PAA，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

所述的Fe₃O₄/MPS、丙烯酸、N,N-亚甲基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈的质量之比为1:2～10:0.1～1:0.01～0.1。

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的Fe₃O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，分别加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温搅拌，再加入次氮基三乙酸(NTA)，室温搅拌20～28h，然后进行磁分离，将所得产物(Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA)用去离子水洗涤3次，最后分散在超纯水中，最后加入六水合氯化镍(NiCl₂·6H₂O)，室温搅拌0.5～4h，磁分离，用去离子水洗涤3次后分散在结合缓冲液中，于4℃下保存，即制得所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

所述的Fe₃O₄/MPS/PAA、EDC、NHS、NTA的质量比为：Fe₃O₄/MPS/PAA：EDC：NHS：NTA＝1:2～5：2～5：0.2～1。

进一步地，上述技术方案中步骤一所述制得的磁性Fe₃O₄纳米粒子的平均水合粒径为100～400nm，分布系数(PDI)为0.01～0.2，Zeta电位为0～-30mv，制得的磁性Fe₃O₄纳米粒子具有较强的磁性，稳定性高，且在水溶液中具有良好的分散性。

进一步地，上述技术方案中步骤三所述制得的Fe₃O₄/MPS/PAA磁性纳米粒子的平均水合粒径为100～600nm，PDI为0.1～0.3，Zeta电位为0～-35mv。

进一步地，上述技术方案中步骤四所述制得的Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺复合磁性纳米粒子的平均水合粒径为100～600nm，PDI为0.1～0.3，Zeta电位为0～-15mv。

进一步地，上述技术方案中步骤四所述的六水合氯化镍的加入量为Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA质量的5～50倍。

更进一步地，上述技术方案中所述的六水合氯化镍的浓度为0.1～1.0M。

进一步地，上述技术方案中步骤四所述的结合缓冲液为含有500mM NaCl和5mM咪唑的20mM PBS缓冲液，pH为7.4。

本发明还一目的在于提供上述所述复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺在分离纯化组氨酸标签蛋白质中的应用，具体应用方法为：首先采用结合缓冲液配制1mg/mL的组氨酸标签蛋白质溶液，取配制好的蛋白质溶液于EP管中，加入所述Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺复合磁性纳米粒子，室温孵育0.5～4h，磁分离，采用洗脱缓冲液洗脱2～3次后，收集上清液，包括原液和洗脱液，分别用SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计检测蛋白质浓度，得到分离纯化效率。

所述的洗脱缓冲液为含有500mM NaCl和250mM咪唑的20mM PBS缓冲液，pH为7.4。

所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺与蛋白质的质量比为1:0.03～0.1。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明是以平均水合粒径为100～400nm的Fe₃O₄磁性纳米粒为核，采用MPS表面修饰使其表面富含双键，通过PAA包覆得到平均水合粒径为100～600nm的多羧基结构磁性纳米粒子，然后进一步偶联NTA-Ni²⁺得到具有快速磁场响应性的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

(2)本发明的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为100～600nm，通过镍离子与组氨酸残基作用实现了对组氨酸标签蛋白质的高效富集和快速分离纯化，本发明能在30秒内完成蛋白质的磁分离过程，大大简化了纯化操作过程，并且大大提高了对组氨酸标签蛋白质的结合效率；

(3)本发明采用复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺为载体，保证了在外磁场作用下快速分离特性，使整个分离纯化过程简便、高效；而且，本发明采用了多羧基超支化聚丙烯酸分子与NTA-Ni²⁺偶联，具有更高效螯合金属离子的能力，从而保证了对组氨酸标签蛋白质的高效富集和纯化效率；经本发明制备得到的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为100～600nm，对组氨酸标签蛋白质的纯化效率可高达40～70μg/mg复合磁性纳米粒子，可作为一种新型高效的纯化蛋白载体。

附图说明

图1为本发明实施例4制得的Fe₃O₄纳米粒子的透射电镜图；

图2为本发明实施例1制得的磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA的透射电镜图；

图3为本发明实施例1制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的透射电镜图；

图4为本发明应用试验例3中Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺分离纯化目标蛋白质得到的SDS-PAGE图，其中：Lane>

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明下述实施例1-5中的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺，是由磁性Fe₃O₄纳米粒子为核，通过MPS在其表面引入双键，加入丙烯酸单体在Fe₃O₄/MPS纳米粒子表面聚合形成聚丙烯酸壳，然后与NTA-Ni²⁺偶联得到，所述复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的分子结构式如下式所示：

其中：所述的MPS为(3-(异丁烯酰氧基)-丙基三甲氧基硅烷)，所述的PAA为聚丙烯酸，所述的NTA为次氮基三乙酸。

实施例1

本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为247.9nm。

上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、0.8248g醋酸铵(NH₄AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇，溶解，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200℃，反应8h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe₃O₄纳米粒子，将制得的产物用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；

上述制得的磁性核Fe₃O₄纳米粒子平均水合粒径为147.6nm，分布系数(PDI)为0.126，Zeta电位为-24.5mv；

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性(修饰)，具体步骤如下：取含30mg上述步骤一制得的Fe₃O₄纳米粒子的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子水，混合搅拌，加入1mL密度为0.898g/mL的浓氨水和60μL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌4h；再加入90μL纯度为97％、密度为1.045g/mL的MPS，在70℃下反应5h，将所得产物进行磁分离后得到Fe₃O₄/MPS，用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为5mg/mL的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液；

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将6mL上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入90μL纯度≥98％、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)，0.01g>2混合搅拌15min，然后加热至50℃并在此温度下保持4h，将所得产物进行磁分离，得到(Fe₃O₄/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为207.3nm，PDI为0.196，Zeta电位为-21.6mv；

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的含10mg>3O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入25mg>3O₄/MPS/PAA/NTA)进行磁分离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌2h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

上述制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为247.9nm，PDI为0.265，Zeta电位为-12.7mv。

实施例2

本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为338nm。

上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、0.8248g醋酸铵(NH₄AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇，溶解，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200℃，反应10h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe₃O₄纳米粒子，将制得的产物用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；

上述制得的磁性Fe₃O₄核平均水合粒径为175.2nm，PDI为0.065，Zeta电位为-27.7mv。

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性(修饰)，具体步骤如下：取含30mg上述步骤一制得的Fe₃O₄的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子水，混合搅拌，加入1mL密度为0.898g/mL的浓氨水和60μL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌4h；再加入90μL纯度为97％、密度为1.045g/mL的MPS，在70℃下反应5h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为4.5mg/mL的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液；

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将7mL上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入150μL纯度≥98％、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)、0.01g>2混合搅拌15min，然后加热至55℃并在此温度下保持4h，将所得产物进行磁分离，得到(Fe₃O₄/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为328.5nm，PDI为0.169，Zeta电位为 -30.4mv；

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的含10mg>3O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入30mg>3O₄/MPS/PAA/NTA)进行磁分离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌0.5h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

上述制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为338nm，分布系数(PDI)为0.145，Zeta电位为-11.8mv。

实施例3

本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为328.5nm。

上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、0.8248g醋酸铵(NH₄AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇，溶解，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200℃，反应12h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe₃O₄纳米粒子，将制得的产物用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；

上述制得的磁性Fe₃O₄核平均水合粒径为215.8nm，PDI为0.022，Zeta电位为-9.79mv；

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性(修饰)，具体步骤如下：取含30mg上述步骤一制得的Fe₃O₄的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子水，混合搅拌，加入0.5mL密度为0.898g/mL的浓氨水和30μL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌4h；再加入120μL纯度为97％、密度为1.045g/mL的MPS，在70℃下反应7h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为4.2mg/mL的Fe₃O₄/MPS的乙腈 分散液；

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将7mL上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入150μL纯度≥98％、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)、0.01g>2混合搅拌15min，然后加热至50℃并在此温度下保持4h，将所得产物进行磁分离，得到(Fe₃O₄/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为321.7nm，PDI为0.169，Zeta电位为-21.2mv；

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的含10mg>3O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入30mg(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌0.5h，然后加入30mg>3O₄/MPS/PAA/NTA)进行磁分离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍10mL，室温搅拌0.5h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

上述制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为328.5nm，分布系数(PDI)为0.231，Zeta电位为-6.3mv。

实施例4

本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为433.9nm。

上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、0.8248g醋酸铵(NH₄AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇，溶解，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200℃，反应16h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe₃O₄纳米粒子，将制得的产物用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；

上述制得的磁性Fe₃O₄核平均水合粒径为322.3nm，PDI为0.137，Zeta电位为-13.39mv；

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性(修饰)，具体步骤如下：取含30mg上述步骤一制得的Fe₃O₄的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子水，加入1.5mL密度为0.898g/mL的浓氨水)和50μL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌4h；再加入150μL纯度为97％、密度为1.045g/mL的MPS，在70℃下反应4h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为4.5mg/mL的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液；

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将7mL上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入180μL纯度≥98％、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)、0.01g>2混合搅拌15min，然后加热至50℃并在此温度下保持6h，将所得产物进行磁分离，得到(Fe₃O₄/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为426.4nm，PDI为0.212，Zeta电位为-20mv；

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的含10mg>3O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入40mg(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌0.5h，然后加入40mg>3O₄/MPS/PAA/NTA)进行磁分离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍15mL，室温搅拌1h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓冲液(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

上述制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为433.9nm，PDI为0.287，Zeta电位为-4.3mv。

实施例5

本实施例的一种复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为561nm。

上述所述的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺采用如下方法制备而成，包括如下步骤：

步骤一：溶剂热法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：称取0.2889g六水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)、0.8248g醋酸铵(NH₄AC)和0.0856g柠檬酸钠于圆底烧瓶中，加入15ml乙二醇，溶解，在170℃下剧烈搅拌1h，冷却后转移至聚四氟乙烯反应釜中，从室温加热至200℃，反应16h，然后冷却至室温，离心分离，制得0.2g磁性核Fe₃O₄纳米粒子，将制得的产物用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在无水乙醇中；

上述制得的磁性Fe₃O₄核平均水合粒径为285.6nm，PDI为0.176，Zeta电位为-15.4mv；

步骤二：采用MPS对磁性Fe₃O₄纳米粒子进行表面改性(修饰)，具体步骤如下：取含30mg上述步骤一制得的Fe₃O₄的乙醇分散液，进行磁分离后，加入40mL无水乙醇，10mL去离子水，加入1mL密度为0.898g/mL的浓氨水)和60μL密度为0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TEOS)，室温下搅拌4h；再加入150μL纯度为97％、密度为1.045g/mL的MPS，在70℃下反应6h，将所得产物进行磁分离，得到Fe₃O₄/MPS，再用无水乙醇洗涤3次后分散在乙腈中，得到浓度为4.3mg/mL的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液；

步骤三：制备核壳Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子，具体步骤如下：将7mL上述步骤二制得的Fe₃O₄/MPS的乙腈分散液转移至三口烧瓶中，超声分散，依次加入200μL纯度≥98％、密度为1.05g/mL的丙烯酸(AA)、0.02g>2混合搅拌15min，然后加热至60℃并在此温度下保持4h，将所得产物进行磁分离，得到(Fe₃O₄/MPS/PAA)，再用无水乙醇洗涤3～4次，最后分散在超纯水中；

上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒径为517.1nm，PDI为0.227，Zeta电位为-24.5mv；

步骤四：Fe₃O₄/MPS/PAA复合磁性纳米粒子与NTA-Ni²⁺偶联，具体步骤如下：取步骤三所述制得的含10mg>3O₄/MPS/PAA的水分散液于圆底烧瓶中，加入50mg(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)搅拌0.5h，然后加入50mg>3O₄/MPS/PAA/NTA)进行磁分离，用去离子水洗涤3次，分散在超纯水中，最后加入0.1M六水合氯化镍20mL，室温搅拌2h，磁分离，用去离子水洗涤3次，最后分散在结合缓 冲液(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺；

上述制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的平均水合粒径为561nm，PDI为0.265，Zeta电位为-3.39mv。

应用试验例1

将上述实施例1制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺应用于分离纯化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：取1mg组氨酸标签蛋白质，溶解于1mL结合缓冲液中(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的悬浮液，室温孵育2h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mM>

经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为40μg/mg磁性纳米粒子。

应用试验例2

将上述实施例2制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺应用于分离纯化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：取1mg组氨酸标签的蛋白质，溶解于1mL结合缓冲液中(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的悬浮液，室温孵育3h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mM>

经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为47μg/mg磁性纳米粒子。

应用试验例3

将上述实施例3制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺应用于分离纯化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：

取1mg组氨酸标签的蛋白质，溶解于1mL结合缓冲液中(20mM PBS，pH＝7.4， 500mM NaCl，5mM咪唑)中，制得浓度为1mg/mL的组氨酸标签蛋白质溶液；取50μL所述组氨酸标签蛋白质溶液于EP管中，加入含1mg上述实施例3制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的悬浮液，室温孵育4h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mMPBS，pH＝7.4，500mM>

经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为53μg/mg磁性纳米粒子。

应用试验例4

将上述实施例4制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺应用于分离纯化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：取1mg组氨酸标签的蛋白质，溶解于1mL结合缓冲液中(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的悬浮液，室温孵育2h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mM>

经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为60μg/mg磁性纳米粒子。

应用试验例5

将上述实施例5制得的复合磁性纳米粒子Fe₃O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺应用于分离纯化组氨酸标签蛋白质，具体应用方法如下：取1mg组氨酸标签蛋白质，溶解于1mL结合缓冲液中(20mM>3O₄/MPS/PAA/NTA-Ni²⁺的悬浮液，室温孵育4h，磁分离，用洗脱缓冲液(20mM>

经紫外分光光度计检测蛋白质的浓度，得到分离纯化效率为65μg/mg磁性纳米粒子。

另外，本发明还采用动态光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS90)对实施例1制备的磁性纳米粒子的平均粒径、分布系数和Zeta电位进行测定，结果见表1。表1结果表明，随着磁性核Fe₃O₄表面被包覆，其平均粒径逐渐增大，且PDI均小于0.3，这说明该纳米粒子尺寸分布窄，具有单分散性；另外，Zeta电位都为负值，由于静电相斥作用，该磁性纳米粒子不易聚集，因此具有较好的稳定性。由此可见，本专利所得复合磁性纳米粒子具有较好的纳米特性，满足生物医学应用的要求。

表1实施例1制得的磁性纳米粒子的平均粒径、分布系数(PDI)和Zeta电位

sampleD_h/nmPDIzeta potential(mv)Fe₃O₄147.60.126-24.5Fe₃O₄/MPS158.80.149-20.7Fe₃O₄/MPS/PAA207.30.196-21.6Fe₃O₄/PAA/NTA220.60.145-15.2Fe₃O₄/PAA/NTA-Ni²⁺247.90.265-12.7