拟南芥DNA拓扑异构酶基因AT4G14990在调控根系发育中的应用

摘要

本发明公开了一种拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOP II)在调控根系发育中的应用，其中所述DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明利用基因AT4G14990的T‑DNA插入突变体和构建的超表达株系检测根系伸长和根尖干细胞分化情况实验证实，该基因突变造成了明显的短根表型并且有明显的QC分裂，表明该基因通过影响根尖干细胞的分化调控根系发育。这一成果及应用的实施将为研究根系发育调控及分子设计育种提供全新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物DNA拓扑异构酶基因及其作用，尤其涉及一种拟南芥DNA拓扑异 构酶基因AT4G14990在调控植物根系发育中的应用，属于基因工程领域。

背景技术

DNA拓扑异构酶是一种普遍存在于细胞核内的一类酶，它在DNA复制、转录、重组、 修复以及染色体重塑方面具有重要作用。在细胞增殖过程中，DNA作为主要的遗传物质，其 双螺旋结构会导致由于拓扑现象而产生的问题，如半保留复制中两条DNA链的解开，分离互 缠的DNA双链时的拓扑张力等。DNA拓扑异构酶可以控制和调节DNA的拓扑状态，是控制 核酸生理功能的关键酶。拓扑酶的生物学作用可通过两种方式实现，一是调节控制DNA的超 螺旋状态及打结或解结DNA的环连体状态，从而间接地影响细胞内核酸代谢过程；二是直接 参与那些需打断并重新连接DNA分子链的细胞过程，即DNA的重组、修复、转录及复制过 程。

基于结构和催化过程的差异，真核细胞的拓扑异构酶主要分为拓扑异构酶I(TOPI)和 拓扑异构酶II(TOPII)。拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链， 即催化瞬时的单链断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD；拓扑异构酶II能同时 断裂并连接双股DNA链，它们通常需要能量辅因子ATP。在细胞DNA复制、转录和有丝分 裂等重要的生命过程中，拓扑异构酶II都发挥重要作用。近年来的研究表明，拓扑异构酶II 是某些抗癌药物的作用目标，这些抗癌药物要通过拓扑异构酶II的参与和中介使肿瘤细胞的 DNA破裂，从而获得抗癌效果。基于对拓扑异构酶II在细胞中关键作用的认识，对该类化合 物的研究一直是热点之一。

基因AT4G14990是编码拟南芥拓扑异构酶II相关蛋白中的一个成员，目前它的基因序 列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索有关拟南芥拓扑异构酶II基因AT4G14990在 调控根系发育中的作用目前还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥DNA拓扑异构酶基因 AT4G14990在调控植物根系发育中的应用。

本发明所述拟南芥DNA拓扑异构酶基因AT4G14990在调控植物根系发育中的应用。

其中：上述拟南芥DNA拓扑异构酶基因AT4G14990的核苷酸序列如SEQIDNo.1所 示。所述拟南芥DNA拓扑异构酶基因AT4G14990在调控植物根系发育中表现为：拟南芥 DNA拓扑异构酶基因AT4G14990缺失突变体具有短根表型并且有明显的QC分裂(见图1 和图2)。

上述的应用中：所述植物是十字花科植物。

其中：所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。

本发明所述的拟南芥AT4G14990基因的CDS长度为2364bp，编码787个氨基酸的蛋 白，属于DNA拓扑异构酶II基因(TOPII)，但是检索发现该基因在调控植物(如拟南芥) 根系发育过程中的作用还未见报道。为此，发明人以拟南芥AT4G14990基因突变体材料为 基础，对该基因的在调控根系发育方面的作用及功能进行了深入研究。

本发明利用AT4G14990(TOPII)基因突变体材料SALK-110349，SALK-134773和 SAIL-682-F06，研究该基因缺失突变后对拟南芥根系发育的影响；并利用该基因构建植物启 动子载体和过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物，明确该基因的组织定位和 亚细胞定位。结果表明AT4G14990基因突变体材料具有根尖QC分裂和干细胞分化的表型， 并且具有短根的表型，组织定位结果表明该基因在根尖处有明显的表达，亚细胞定位结果表 明该基因主要在内质网中表达(见图1～图4)。

本发明公开了拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)在调控根系发育中 的应用，研究结果表明，该基因缺失可造成拟南芥根尖QC分裂和干细胞分化并具有短根的 表型，说明该基因通过影响根尖干细胞分化参与调控根系发育。这一成果及应用的实施对农 作物根系调控及分子设计育种具有十分重要的意义。

附图说明

图1.主根长表型统计。

其中Col为拟南芥对照植物，SALK-110349，SALK-134773和SAIL-682-F06分别为基 因AT4G14990(TOPII)的T-DNA插入突变体，其中SALK-110349插在了该基因的第5个 外显子上，SALK-134773和SAIL-682-F06都插在了该基因的启动子区。拟南芥对照植物和 突变体株系在固体MS板上正常培养7天，然后扫描植株计算主根长，结果表明突变体植株 中SALK-110349和SAIL-682-F06的主根长与对照相比具有明显的短根表型，说明 AT4G14990(TOPII)基因参与了拟南芥根系发育的调控。

图2.根尖干细胞表型统计。

其中Col为拟南芥对照植物，SALK-110349和SALK-134773分别为基因AT4G14990 (TOPII)的T-DNA插入突变体，35S:TOPII:GFP为基因AT4G14990(TOPII)的过表达株 系。拟南芥对照植物、突变体和过表达株系在固体MS板上正常培养5天，用lugol染液浸 泡根尖1-2分钟进行根尖淀粉粒的染色来表征分化的细胞，在光学显微镜下观察QC分裂和 干细胞分化表型。

图3.拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)的组织定位。

利用β-葡萄糖苷酶(GUS)染色分析TOPII基因在拟南芥不同组织部位的转录水平表 达情况。结果表明，该基因主要在拟南芥根尖及中柱中表达，同时在叶脉中也有少量表达。

图4.拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)的亚细胞定位。

通过激光共聚焦显微镜观察表明，35S:TOPII:GFP超表达株系中TOPII的亚细胞定位 与内质网表征信号BIP2共定位，说明TOPII主要在内质网中表达。

具体实施方式

本发明所述拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)突变体从拟南芥生物 资源中心(ABRC)获得，所述拟南芥AT4G14990基因突变体均为T-DNA插入突变体。

实施例1：证明拟南芥AT4G14990基因与根系发育相关

将拟南芥野生型(Col)和突变体(SALK-110349，SALK-134773和SAIL-682-F06)种 子种在0.8％琼脂的MS培养基上，正常竖直培养7天测定主根生长情况。

结果表明：突变体的主根长明显小于野生型，如图1所示，突变体植株中SALK-110349 和SAIL-682-F06的主根长与对照相比具有明显的短根表型，说明AT4G14990(TOPII)基 因参与了拟南芥根系发育的调控。

实施例2：证明拟南芥AT4G14990基因调控根系发育的机制

现有研究表明，根尖干细胞发生紊乱是造成拟南芥短根表型的一个重要原因。为此， 发明人利用基因AT4G14990的T-DNA插入突变体和过表达株系研究根尖干细胞表型。统计 方法如图2所示，其中SALK-110349和SALK-134773分别为基因AT4G14990(TOPII)的 T-DNA插入突变体，35S:TOPII:GFP为基因AT4G14990(TOPII)的过表达株系。

结果表明：突变体中具有明显的QC分裂表型，而超表达株系中QC分裂的表型得到恢 复。说明拟南芥AT4G14990基因通过调控根尖QC分裂影响根系发育。

实施例3：拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)的组织定位

构建拓扑异构酶II基因TOPII启动子序列-GUS融合表达载体TOPIIp:GUS，摇菌提取 质粒。将构建好的TOPIIp:GUS启动子重组质粒通过冻融法转化到农杆菌GV3101感受态细 胞中，利用经过测序的阳性克隆的农杆菌菌液通过浸花法转化野生型拟南芥，通过抗生素筛 选得阳性苗进行GUS染色。GUS染液组成为2mMX-Gluc，0.5mM铁氰化钾，0.5mM亚 铁氰化钾和含0.1％TritonX-100的100mM磷酸缓冲液(pH7.2)。取1mL染色液到1.5mL 离心管中，将阳性苗侵入反应液中，37℃温育24h，制成压片在显微镜下观察和拍照。

染色结果表明：该基因在根尖有大量表达(见图3)，这为该基因参与调控根尖发育提 供了空间基础。

实施例4：拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)的亚细胞定位

为了检测TOPII基因的亚细胞定位，发明人构建了35S:TOPII:GFP超表达株系，应用 共聚焦显微镜进行有关拟南芥DNA拓扑异构酶II基因AT4G14990(TOPII)的亚细胞定位 观察。

结果表明，TOPII基因在细胞内的表达部位与内质网的标记蛋白BIP2具有共定位(见 图4)，说明TOPII基因是在内质网中表达的。