联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用

摘要

本发明提供联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用：具体包括设计适合CRISPR?Cas9靶向剪辑的人乙型肝炎病毒基因和PD?1基因的sgRNA序列，构建抑制HBV和PD?1基因sgRNA，将其与核酸酶基因的表达载体联合转入HBV转基因小鼠体内可以明显抑制HBV DNA的复制。本发明制备的基因表达载体方法步骤简单、sgRNA靶向性好、CRISPR?Cas9系统的敲除效率高。因此，这些特异性靶向HBV和PD?1基因的sgRNA可以精确剪接HBV和PD?1基因，发挥抑制体内乙型肝炎病毒复制，降低乙肝病毒抗原表达的作用。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及生物医药领域，涉及CRISPR/Cas9特异性修饰乙型肝炎病毒HBV及PD-1多个基因靶点的创新设计，将联合免疫治疗策略引入基因治疗领域，获得增强靶向基因治疗乙肝的良好效果。

背景技术

近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关(Cas)核酸酶结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。CRISPR/Cas9技术被Nature、Science杂志分别评为2013年前10位的明星技术之一，并位居2015年科学杂志评选出来的十大发现之首。该项技术将成为功能基因组学和系统生物学领域中强有力的研究工具。

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病。乙肝广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌，已成为严重威胁人类健康的世界性疾病。全球慢性乙肝病毒感染者超过两亿，每年因其引起的肝硬化、终末期肝病和肝癌等并发症死亡人数约60万。乙肝也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种疾病。目前临床上使用干扰素-α，核苷类似物如拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦酯等药物治疗乙肝，不仅用药时间长，还不能获得抑制HBV复制的良好疗效，因此，对于乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗方法仍有待创新技术与新药带来的突破。

HBV特异性T淋巴细胞功能低下与病毒感染导致免疫耐受是造成HBV慢性持续感染的原因，T淋巴细胞功能状态决定了病毒是被清除或者是持续感染。程序性死亡因子-1(programmed death-1,PD-1)作为近年发现的CD28家族新成员，常在活化的淋巴细胞呈现高水平表达，PD-1与其配体PD-L1结合，通过阻断CD28分子介导激活PI3K(phsphatidylinositol 3-kinase,磷酸肌醇3激酶)途径，抑制T淋巴细胞的增殖和分化，已经发现其在乙肝免疫应答过程中与病程进展中起到了重要的作用。目前有关PD-1研究结果表明，在HBV感染过程中，淋巴细胞的PD-1高表达，抑制了乙肝病毒特异性T细胞增殖和耗竭T淋巴细胞的功能。因此，阻断该通路能够刺激效应细胞增殖，增强细胞毒性细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)效应，促进病原体的清除。

脂质体是具有良好的生物相容性的传递载体，其表面修饰配体是构建主动靶向脂质体的重要方式。细胞穿膜肽(TAT)能够穿过与之接触的任何细胞的细胞膜，而对细胞膜没有损伤。转铁蛋白(TF)广泛存在于人体体液及细胞液中，可以与体液中游离的Fe³⁺结合然后再与转铁蛋白受体结合，经细胞内吞作用将铁原子转入胞内。人肝脏实质细胞本身高表达转铁蛋白受体，故可用靶向肝脏细胞给药的方式治疗乙型肝炎，获得更加高效地降低乙肝病毒致病基因表达的效果。

现在治疗乙型肝炎的技术方案存在以下问题：(1)药物作用只是起暂时的阻断作用；(2)治疗药物有很多，如何利用多种治疗方法联合治疗乙肝还没有对策；(3)效率低，只能少量敲除HBV cccDNA(covalently closed circular DNA)；(4)只能稍微降低HBsAg表达；(5)由于开发药成本很高，使得临床抗乙型肝炎药物昂贵等。

发明内容

本发明的目的在于提供联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA、表达载体及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA，该抑制HBV复制的特异性sgRNA包括在CRISPR-Cas9特异性修饰人PD-1基因中可特异性靶向人PD-1基因的sgRNA，该sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示。

所述抑制HBV复制的特异性sgRNA还包括与所述可特异性靶向人PD-1基因的sgRNA联用的可特异性靶向HBV基因cccDNA的sgRNA，该sgRNA的序列如SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9所示。

联合免疫基因抑制HBV复制的表达载体，该表达载体选自重组质粒pGL3-U6-PD1sgl、pGL3-U6-PD1sg2中的一种，pGL3-U6-PD1sgl由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PD1sg2由序列如SEQ.ID.NO.7所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内，或者，该表达载体为构建于用于表达核酸酶Cas9的质粒基础上的重组质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒的多克隆位点内分别插入有如SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列中的一种或两种以及如SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9所示序列中的一种或两种。

联合免疫基因抑制HBV复制的表达载体组合物，该组合物包括pGL3-U6-PD1质粒，所述pGL3-U6-PD1质粒选自重组质粒pGL3-U6-PD1sgl、pGL3-U6-PD1sg2中的一种或两种，pGL3-U6-PD1sgl由序列如SEQ.ID.NO.6所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-PD1sg2由序列如SEQ.ID.NO.7所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接SEQ.ID.NO.6或SEQ.ID.NO.7所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。

所述pGL3-U6-PD1sgl与pGL3-U6-PD1sg2的质量比为(1～2)：(1～2)。

所述组合物还包括pGL3-U6-HBV sg质粒，所述pGL3-U6-HBV sg质粒选自重组质粒pGL3-U6-HBV-S sg、pGL3-U6-HBV-X sg中的一种或两种，pGL3-U6-HBV-S sg由序列如SEQ.ID.NO.8所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，pGL3-U6-HBV-X sg由序列如SEQ.ID.NO.9所示的sgRNA的寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得，通过连接SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9所示序列插入至pGL3-U6-sgRNA质粒的多克隆位点内。

所述pGL3-U6-HBV sg质粒与pGL3-U6-PD1质粒的质量比为(1～2)：(1～2)，所述pGL3-U6-HBV-S sg与pGL3-U6-HBV-X sg的质量比为(1～2)：(1～2)。

所述组合物还包括用于表达核酸酶Cas9的质粒，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒:pGL3-U6-HBV sg质粒:pGL3-U6-PD1质粒的质量比为(1～2)：(1～2)：(1～2)，所述用于表达核酸酶Cas9的质粒与pGL3-U6-PD1质粒的质量比为(1～2)：(1～2)。

上述联合免疫基因抑制HBV复制的特异性sgRNA在制备用于抗乙型肝炎病毒联合免疫药物中的应用。

上述联合免疫基因抑制HBV复制的表达载体或表达载体组合物在制备用于抗乙型肝炎病毒联合免疫药物中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明提出了适合CRISPR-Cas9靶向剪辑的人PD-1基因的sgRNA序列，其与适合CRISPR-Cas9靶向剪辑的乙型肝炎病毒HBV基因的sgRNA序列，可用于构建表达乙型肝炎病毒HBV基因(S、X)和人PD-1基因的sgRNA的质粒载体，将其转入HBV转基因小鼠体内可以明显抑制HBV DNA的复制。本发明制备的基因表达载体方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR-Cas9系统的敲除效率高。

本发明制备的特异性联合靶向HBV和PD-1基因的sgRNA载体，不仅能够精确靶向剪接HBV和PD-1基因，高效抑制体内乙型肝炎病毒的复制，降低乙肝病毒抗原的表达，还能成为制备靶向肝细胞治疗乙型肝炎新型药物的核心成分，而联合抑制致病基因和改善宿主免疫调节将成为病毒源性疾病和恶性肿瘤多靶点免疫基因治疗的新策略。

本发明在联合免疫治疗的背景下，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除HBV和PD-1基因的策略，分别设计和合成特异性靶向HBV cccDNA的sgRNA1和特异性靶向PD-1基因的sgRNA2，将sgRNA1和sgRNA2与线性的pGL3-U6-sgRNA质粒连接成pGL3-U6-HBV sg质粒和pGL3-U6-PD1质粒；再将pGL3-U6-HBV sg质粒和pGL3-U6-PD1质粒联合转入HBV转基因小鼠体内即可实现HBV基因的高效敲除。本发明可应用于基于CRISPR/Cas9快速、简便、高效、特异性剪接乙肝病毒DNA和人PD-1基因的方法中，并为将来采用转铁蛋白与细胞穿膜肽等共修饰包裹靶向HBV cccDNA的sgRNA脂质体及其他给药方式奠定了物质基础，展现出可能有效解决目前治疗乙型肝炎存在各种问题的明显优势。本发明具有(1)概念新：在免疫基因治疗的背景下，应用CRISPR/Cas9有效的剪辑了HBV cccDNA以达治疗乙型肝炎的目的；(2)效率高：使小鼠体内HBsAg的表达量降低了98％；(3)多靶点：可以同时敲除修饰多个靶点基因的突出特点。

附图说明

图1为Cas9实现定点切割导致DNA及双链断裂过程示意图。

图2为sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性切割结果测序。

图3为sgRNA/Cas9介导的乙型肝炎病毒cccDNA特异性切割造成HBV表面抗原表达情况。

图4为转基因小鼠抗原递呈细胞(DC)细胞表型的变化；A代表CD80；B代表CD86；左边的是对照组，右边是作用组。

图5为混合淋巴细胞反应(MLR)；A：IFN-γ，B：IL-2，C：IL-4，D：IL-10。

图6为体内T7EN1酶切鉴定cas9介导的HBV cccDNA的特异性切割。

图7为单独和联合敲除后转基因小鼠模型在第一天和第三天血清中HBsAg的变化情况。

图8为转基因小鼠肝脏免疫组化的情况；基因小鼠注射质粒后，肝脏免疫组化的情况(1、对照组；2、敲低HBV组；3、联合敲低PD-1+HBV组)上面是x200，下面是x400。

图9为载体PgL3-U6-sgRNA的结构。

图10为载体pST1374-NLS-flag-cas9-ZF的结构。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

参见图1，CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9技术，并以乙型肝炎为研究对象，采用协同靶向其致病基因HBV cccDNA以及靶向免疫调节分子PD-1的基因编辑策略。首先，通过体内外筛选针对HBVDNA的gRNA序列，实现敲除HBV基因的目的，并经体内外筛选，获得针对PD-1基因的gRNA序列，以共转染的方式实现多基因协同编辑效应，并验证联合干预不同靶点的治疗策略是否对乙肝治疗具有“1+1>2”的协同效应。本发明利用cas9能够实现多重基因敲除的优势，采取“协同作战”的策略，针对疾病的内外因涉及的主要分子靶点同时进行干预，发挥病毒基因被动清除和增强机体主动免疫的治疗作用。其不仅为进一步研制靶向肝脏细胞给药(如TF修饰包裹靶向HBV cccDNA的sgRNA质粒的脂质体)制剂奠定了物质基础，还为其它病原微生物的体内清除提供了可借鉴的治疗策略。

本发明提出联合应用CRISPR/Cas9靶向敲除乙肝病毒和人PD-1基因的方法抑制HBV的复制：

一、靶向HBV的sgRNA1和靶向PD-1的sgRNA2寡核苷酸的设计和选择

如无特殊说明，文中sgRNA1指靶向HBV的序列；sgRNA2指靶向PD-1的序列。

1.在HBV基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。在PD-1基因上选择5’-GGN(19)GG的序列，如果没有5’-GGN(19)GG的序列，5’-GN(20)GG或者5’-N(21)GG也可以。

2.sgRNA1在HBV cccDNA的靶向位点位于S基因和X基因的ORF。sgRNA2在PD-1基因上的靶点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。sgRNA2在PD-1基因上的靶位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。

3.在UCSC数据库中用BLAT或NCBI数据库中用BLAST，以确定sgRNA1和sgRNA2的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。

4.如果用两个针对HBV不同区域的sgRNA1来实现联合靶向HBV，能更有效地敲低HBV。

5.如果采用靶向HBV不同区域的两个sgRNA1联合靶向PD-1的sgRNA2，能更有效地抑制HBV DNA的复制。

二、构建sgRNA的寡聚核苷酸双链

根据选择的sgRNA1s和sgRNA2s，在其5’加上CCGG得到正向寡核苷酸(Forwardoligo)，如果序列本身在5’端已经有1或者2个G，那么就对应的省略1或者2个G；根据选择的sgRNA，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverse oligo)；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对退火

退火反应体系如下：

在PCR仪中按照以下touch down程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链，序列如下：

Forward oligo:5’-CCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Reverse oligo:NNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’。

三、sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建

1.线性化pGL3-U6-sgRNA质粒。酶切体系和条件如下：2μg pGL3-U6-sgRNA(400ng/μL)；1μL CutSmart Buffer；1μL BsaI(NEB).补水至50μL，37℃孵育3-4小时；酶切完成后用AxyPrep PCR Clean up Kit(AP-PCR-250)纯化回收至20-40μL灭菌水中。

2.将退火的sgRNA1寡聚核苷酸双链和退火的sgRNA2寡聚核苷酸双链与线性pGL3-U6-sgRNA质粒(结构如图9所示，Addgene(Cambridge,MA,USA)分别连接，获得pGL3-U6-HBV sg质粒和pGL3-U6-PD1质粒。

3.将质粒转化大肠杆菌细胞，并涂Amp+平板(50μg/mL)。

4.用SEQ.ID.NO.1的通用引物U6测序的方法鉴定阳性克隆。

5. 37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit(AP-MN-P-250)抽提pGL3-U6-HBV sg质粒和pGL3-U6-PD1质粒。

四、转染Hep2.2.15(HBV+)细胞

1.按照Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应HBV的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HBV sg质粒(单独靶向HBV的S基因或X基因的sgRNA)与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图10所示，Addgene(Cambridge,MA,USA)混匀，共转染HepG2.2.15细胞。

2.为提高sgRNA的敲除效率，将靶向HBV的S基因和X基因的sgRNA联合应用。在靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向HBV cccDNA的sgRNA1寡聚核苷酸(即靶向HBV的S基因和X基因的sgRNA)分别与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向HBV S基因和X基因的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg，按如下操作转染HepG2.2.15细胞：按照Lipofectamine 2000TransfectionReagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将两个分别含1个靶向HBV S基因ORF的sgRNA1-S寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV-S sg和1个靶向HBV X基因ORF的sgRNA1-X寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV-X sg与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒混匀(比例是1:1，病人类型不同，对应的靶点的量也可调整)，共转染细胞。

五、酶联免疫法检测乙型肝炎病毒表面抗原的变化

1.按Lipofectamine 2000Transfection Reagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将分别带有对应HBV的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-HBV sg质粒(单独靶向HBV的S基因或X基因的sgRNA)与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图10所示)混匀，共转染HepG2.2.15细胞。

2.在转染后的第一、三天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B Virus SurfaceAntigen(ELISA)使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。

(1)配制工作浓度洗涤液(以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用)；

(2)根据实验要求，选择一定量的反应板条；

(3)加入75μL待测样本和阴性阳性对照于反应孔中；

(4)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟；

(5)取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50μL酶结合物；

(6)在微孔振荡器上震荡10秒钟；

(7)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；

(8)取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次；

(9)洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50μL，混匀；

(10)在微孔振荡器上震荡10秒钟；

(11)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；

(12)在所有孔内加入50μl终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀；

(13)用酶标仪读数(波长450nm)，并计算获得乙型肝炎病毒表面抗原。

3.为提高sgRNA的敲除效率，将靶向HBV的S基因和X基因的sgRNA联合应用。在靶向HBV cccDNA的sgRNA寡核苷酸设计、选择和合成之后，将靶向HBV cccDNA的sgRNA1寡聚核苷酸(即靶向HBV的S基因和X基因的sgRNA)分别与线性化pGL3-U6-sgRNA质粒连接获得含靶向HBV S基因和X基因的sgRNA寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV sg，按如下操作转染HepG2.2.15细胞：按照Lipofectamine 2000TransfectionReagent(Invitrogen,11668-019)的操作手册，将两个分别含1个靶向HBV S基因ORF的sgRNA1-S寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV-S sg和1个靶向HBV X基因ORF的sgRNA1-X寡聚核苷酸的载体pGL3-U6-HBV-X sg与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒质粒混匀(比例是1:1，病人类型不同，对应的靶点的量也可调整)，共转染细胞。

4.在共转染后的第一、三天，收取上清液，按照Diagnostic Kit for Hepatitis B VirusSurface Antigen(ELISA)使用说明书测量乙型肝炎病毒表面抗原。

(1)配制工作浓度洗涤液(以纯化水做25倍稀释，充分混匀后待用)；

(2)根据实验要求，选择一定量的反应板条；

(3)加入75μL待测样本和阴性阳性对照于反应孔中；

(4)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育60分钟；

(5)取出反应板，撕去封片，在已加入待测样本和阴性，阳性对照孔中加入50μL酶结合物；

(6)在微孔振荡器上震荡10秒钟；

(7)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；

(8)取出反应板，撕去封片纸，洗涤反应板5次；

(9)洗涤结束后立即在所有孔内加入显色剂A，显色剂B各50μL，混匀；

(10)在微孔振荡器上震荡10秒钟；

(11)用封片纸覆盖反应板后，将反应板置于37℃孵育30分钟；

(12)在所有孔内加入50μL终止液，震荡反应5秒钟，使之充分混匀；

(13)用酶标仪读数(波长450nm)，并计算获得乙型肝炎病毒表面抗原。

参见图3，对照组(gRNAempty vector)是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-HBV sgc(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.5)，处理组(S、X)是分别加入针对HBVcccDNA的S基因和X基因的sgRNA载体pGL3-U6-HBV-S sg和pGL3-U6-HBV-X sg(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.8和SEQ.ID.NO.9)，以及两个sgRNA的联合作用(S+X)。用ELISA检测HBsAg表达，与对照组比较，单独处理组(S或X)表面抗原明显减少；联合处理组(S+X)相比较单独处理组效果更加明显。处理组乙肝病毒表面抗原的表达显减著少。

5.sgRNA/Cas9介导的基因位点特异性切割结果测序

(1)将收集的转染细胞在裂解液中用100μg/mL蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μL去离子水中。

(2)使用序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的HBV test For和HBV test Rev为引物分别进行PCR扩增。纯化，回收PCR产物，用rTap进行加A反应。加A反应体系如下：700-800ng PCR回收产物；5μL 10X Buffer；3μL Mg；4μL dNTP；0.5μL rTap(TAKARA)；补水至50μL体系。37℃温育30分钟后，取1μL产物与pMD19-T vector(TAKARA)连接并转化感受态细胞。

(3)挑取单克隆以通用引物U6测序

根据图2所示：上面为野生型，下划横线为PAM序列，下面字体较小的是本发明的插入和删除序列。基因敲除成功。

六、敲除PD-1基因后，流式细胞术检测抗原递呈细胞(DC)表型的变化

1.DC细胞的制备和培养

(1)用断颈法处死小鼠，浸没在75％酒精消毒5min，无菌条件下分离取出小鼠两股骨和胫骨，剔除肌肉和筋膜，于75％酒精消毒30s，置于生理盐水中备用；

(2)用剪刀剪去胫骨和股骨的两端，暴露骨髓管，用10mL针筒吸取生理盐水，分别插入骨髓两端，冲出骨髓于50mL离心管；

(3)于1500rpm离心10min，弃上清，沉淀加入2mL红细胞裂解液，吹打均匀作用约2min，再加入约40mL生理盐水沉淀混匀终止；

(4)于1000rpm离心10min，弃上清，加入新鲜1640培养液5mL，镜下计数细胞量，以1x10⁶mL细胞密度种入6孔培养板，每孔2mL；

(5)置37℃，5％CO₂培养箱培养2h，生理盐水轻轻洗去未贴壁细胞；

(6)在贴壁细胞中加入rhGM-CSF(终浓度为100μg/L)，rhIL-4(终浓度为10μg/L)，37℃，5％CO₂条件下培养，隔天半量换液，并补加全量细胞因子；

(7)在培养到第7天时将不成熟DC分为2组(对照组和作用组)

2.T淋巴细胞分离和纯化

(1)无菌条件下分离出小鼠脾脏，用生理盐水冲洗干净，用剪刀反复剪碎，经200目细胞滤器过滤，去掉血管及一些结缔组织，收集细胞悬液至50mL离心管；

(2)于1500rpm离心15min，弃上清，沉淀加入4mL红细胞裂解液(NH₄CI),吹打均匀作用约2min，再加入约40mL生理盐水混匀终止；

(3)于1000rpm离心10min，弃上清，重悬于RPMI-1640培养液(含10％FCS)备用；

(4)尼龙毛用0.2M的HCI侵泡过夜，用双蒸水洗净HCI，烘干后仔细撕开梳整，取约0.3g均匀装入5mL的一次性注射器，高压灭菌；

(5)用预温至37℃的RPMI-1640培养基润洗尼龙毛3遍，再浸润后置于37℃培养箱静止1h；

(6)放出注射器中的液体，立即加入2x10⁷/mL细胞悬液(置于含约10％FCS的RPMI>

(7)收集滤液，速度控制在1滴/S，然后用预温至37℃、含10％FCS的RPMI1640培养基15-20mL洗柱3遍，收集洗液，同样速度控制在1滴/s；

(8)收集到的液体于1000rpm离心10min，得到的沉淀即为T淋巴细胞，用含10％FCS的RPMI-1640培养基以2x10⁶/mL的密度重悬，用于混合淋巴细胞反应。

3.将分别带有对应PD-1的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-PD1sg质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图10所示)混匀，共转染DC细胞。

4.DC表型的检测

(1)收集各组DC，用生理盐水冲洗2遍；

(2)将细胞转移至流式管，用100μL的生理盐水重悬，要求细胞量不少于5x10⁵/管，加入10％正常小鼠血清常温封闭30min；

(3)分别加入流式抗体CD80-FITC,CD86-APC常温避光孵育30min；

(4)用生理盐水洗细胞2次，最后用200μL的生理盐水重悬；

(5)上机检测。

参见图4，对照组转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-PD1sg(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.4)，处理组是联合加入(1：1)针对PD1的两种sgRNA的载体pGL3-U6-PD1sgl和pGL3-U6-PD1sg2(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7)。与对照组比较，处理组DC抗原递呈能力更强。

七、敲除PD-1基因后，测定混合淋巴细胞反应(MLR)

1.将分别带有对应PD-1的sgRNA寡聚核苷酸的pGL3-U6-PD1sg质粒与pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF质粒(结构如图10所示)混匀，共转染DC细胞。

2.转染后各组DC再加入终浓度为25μg/mL的丝裂霉素C孵育1h。

3.T淋巴细胞用含10％FCS的RPMI1640培养基重悬，以2x10⁶/mL的密度种入圆底96孔板，每孔100μL，分DC和T细胞共培养组(T细胞:DC细胞＝10：1)和T细胞单独培养组，两组细胞于37℃，5％CO₂培养箱共培养。

参见图5，对照组是转入了没有切割活性的sgRNA载体pGL3-U6-PD1sg(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.4)，处理组是单独或者联合加入针对PD-1的两种sgRNA的载体pGL3-U6-PD1sgl和pGL3-U6-PD1sg2(对应的sgRNA为SEQ.ID.NO.6和SEQ.ID.NO.7)。处理组与对照组比较，细胞因子的分泌具有显著性变化(单独或者联合敲除PD-1，相比较对照组IFN-γ和IL-10降低，而IL-2，IL-4升高)。

八、在HBV转基因小鼠模型中应用本发明的联合靶向HBV(S+X)的sgRNA1和靶向PD-1的sgRNA2及组合清除HBV

1.选取HBV转基因小鼠作为本研究的动物模型，分为对照组；敲低HBV cccDNA组；联合敲低PD1+HBV cccDNA组。

2、联合用尾静脉注射敲低HBV的质粒和用电穿孔转入敲低PD-1质粒的方法，所给质粒的剂量为对照组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+20μg空gRNA；敲除HBV组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+20μg pGL3-U6-HBV-S sg+20μg pGL3-U6-HBV-X sg；联合敲除HBV+PD1组：40μg pST1374-NLS-flag-Cas9-ZF+20μg pGL3-U6-HBV-S sg+20μg pGL3-U6-HBV-X sg+10μg pGL3-U6-PD1sgl+10μg pGL3-U6-PD1sg2。

3.指标观测：注射质粒后，于第一天，第三天抽取小鼠尾静脉静脉血，分离血清，用ELISA的方法检测HBsAg的变化情况。参见图7，相比较于对照组和只敲除HBV组，联合敲除HBV和PD-1可以更显著降低乙肝表面抗原的表达水平。

4. 3周后处死小鼠，用免疫组化法检测小鼠肝脏细胞HBsAg的表达情况。参见图8，可以看出，相比较于对照组和单独敲除HBV组，联合敲除PD1+HBV组可以更显著降低乙肝表面抗原的表达水平。

九、Cas9核酸酶靶向基因剪接后基因组突变的检测

理论上，Cas9将基因组切断之后，细胞会通过非同源重组的末端接合的方式，将基因组修复。由于这一修复模式易于产生突变，用实验以及深度测序实验检测了经过处理的基因组序列是否产生了这一突变。具体实施方式如下：

1.从小鼠肝脏中提取细胞基因组，所用试剂盒为天根细胞血液组织基因组提取试剂盒，方法按厂家说明书进行。

2.获得包括靶位点的片段。

PCR反应体系

PCR反应循环：

1)95℃ 5min；

2)35个循环

95℃ 30s

55℃ 30s

68℃ 30s

3)68℃ 10min

3.使用公司胶回收试剂盒回收得到的目的片段。具体方法按照公司提供的试验方法进行。

4.目的片段退火。向回收得到的目的片段中加入NEB buffer，按如下方式退火。

参见图6所示：以小鼠肝脏中提取细胞基因组为模板，使用序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3的HBV test For和HBV test Rev为引物分别进行PCR扩增,使用T7EN1酶切鉴定，电泳。如果发生DNA链切割，DNA双链退火过程中出现错配，T7EN1将错配链切断，出现切割条带。这里表明基因敲除成功。