利用微波炉-液氮快速提取细菌DNA的方法

摘要

本发明公开了利用微波炉‑液氮快速提取细菌DNA的方法，该方法利用热胀冷缩物理原理破坏细菌细胞壁的新型细菌DNA提取方法。本发明方法可以适用于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，是一种低成本，高效率，操作简便的细菌DNA提取方法。应用本发明方法提取的DNA可以满足细菌鉴定、分型等常规的PCR分析。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是一种利用微波炉和液氮快速提取细菌DNA的 方法。

背景技术

细菌DNA已经大规模的应用于细菌鉴定、分型、进化及流行病学分析等领域。细菌 DNA提取是从事生物科研工作者的一种常规的实验操作。快速简单的细菌DNA提取方法可以 给科研工作带来便利，提高工作效率，特别是面对大量的细菌样品时，快速简单的方法更显 示出优势。现有的细菌DNA提取方法一般分为传统的化学抽提法和试剂盒法，化学抽提法一 般需使用SDS、CTAB等化学试剂以及酚、氯仿等有机试剂，操作繁琐，且酚、氯仿等有机试剂 具有腐蚀性及挥发性，对人体有害；试剂盒法一般使用商业试剂盒提取细菌DNA，大规模使 用时，成本较高。

发明内容

本发明的目的就是提供一种成本低、操作简便、适用范围广的利用微波炉-液氮快 速提取细菌DNA的方法。

本发明的利用微波炉-液氮快速提取细菌DNA的方法，包括以下步骤：

A)、试剂、材料准备：

1)、STE缓冲液配制：称称取1.169gNaCl、2.422gTris、3.632gEDTA溶于200ml去离子 水，使用1MNaOH溶液调节pH值至8.0，高压灭菌后，4℃冷藏备用；

2)、TE缓冲液配制：称称取2.422gTris、3.632gEDTA溶于200ml去离子水，使用1M NaOH溶液调节pH值至8.0，高压灭菌后，4℃冷藏备用；

3）、液氮、微波炉备用；

B)、DNA提取：

1)、针对液体培养物，无菌环境下，使用1.5mLEP管收集1mL过夜培养菌液，8000g离心 3min，倒掉上清，保留沉淀物，加入250μlSTE缓冲液重悬沉淀；

针对平板培养物，无菌环境下，直接用火焰灼烧灭菌后的接种环挑取菌落于提前加有 250μlSTE缓冲液的1.5mLEP管中重悬；

2)、8000g离心3min，去上清；

3)、沉淀加入100μlTE缓冲液重悬；

4)、将上述步骤3）装有菌悬液的EP管开盖，放置微波炉中高火加热2min，取出，然后立 即盖上EP管盖投入装有液氮的保温桶中冷冻30s；

5)、夹取液氮冷冻后的细菌EP管，37℃金属浴或水浴解冻2min；

6)、针对革兰氏阳性细菌重复一次步骤4)和5)；

7)、14000g、4℃离心5min，上清即为DNA溶液，转移上清至一新EP管中，-20℃保存。

本发明的利用微波炉-液氮快速提取细菌DNA的方法，利用热胀冷缩物理原理提取 细菌DNA，微波炉产生电磁波辐射引起极性分子—水分子剧烈运动，分子间摩擦短时间内产 生大量热量，而液氮的温度为-196℃，可以非常短的时间内使液体冷冻凝固。细菌细胞壁受 微波炉加热和液氮冷冻，一热一冷循环，在热胀冷缩的作用下，细胞壁破裂，水溶性DNA溶 出，通过高速离心使蛋白质等杂质沉淀，收集上清液从而达到提取细菌DNA的目的。革兰氏 阳性菌的细胞壁结构相较革兰氏阴性菌更为致密，所以重复一次微波炉—液氮一热一冷循 环，以便达到良好的提取效果。微波炉—液氮法提取DNA有如下优点：一快速，二成本低廉， 三操作简便，四使用范围广，该方法能有效的提取各种细菌的高浓度全基因组DNA。微波 炉—液氮法提取DNA可用于16SrDNA，RAPD分型等常规PCR反应。

附图说明

图1为扫描电镜观察本发明处理细菌前后细胞壁变化图（a,c为处理前；b,d为处 理后，箭头显示细胞壁破裂）；

图2为本发明提取DNA的16SrDNAPCR电泳条带图；

图3为本发明提取DNA的RAPD电泳图。

具体实施方式

一种利用微波炉和液氮快速提取细菌DNA的方法，具体步骤是：

1)、无菌环境下，使用1.5mLEP管收集1mL过夜培养菌液，8000g离心3min，倒掉上清，保 留沉淀物；加入250μlSTE缓冲液1.169gNaCl、2.422gTris、3.632gEDTA溶于200ml去离 子水，使用1MNaOH溶液调节pH值至8.0，重悬沉淀；或无菌环境下，直接用火焰灼烧灭菌后 的接种环挑取平板上适量菌落（100mg）于提前加有250μlSTE缓冲液的1.5mLEP管中重悬；

2)、8000g离心3min，去上清；

3)、沉淀加入100μlTE（2.422gTris、3.632gEDTA溶于200ml去离子水，使用1MNaOH 溶液调节pH值至8.0）缓冲液重悬；

4)、把上述步骤3）装有菌悬液的EP管开盖，放于普通家用微波炉中（输出功率为900瓦） 高火加热2min，取出后盖上EP管盖投入装有液氮的保温桶中冷冻30s；

5)、用长镊子夹取液氮冷冻后的细菌EP管，37℃金属浴或水浴解冻2min；

6)、针对革兰氏阳性细菌重复一次上述4)和5)微波炉加热和液氮冷冻步骤；

7)、14000g，4℃离心5min，上清即为DNA溶液，转移上清至一新EP管中，-20℃保存。

取革兰氏阴性菌大肠杆菌、嗜水气单胞菌、哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧 菌、轮虫弧菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、藤黄微球菌、地衣芽孢杆菌液 体或平板培养物，按照上述方法提取DNA。将提取完成的DNA采用核酸蛋白检测仪检测，测定 OD260/280值接近于标准值，其DNA浓度分别在387~5931μg/g干培养物之间（附表1）。使用 16SrDNA通用引物P_8F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和P_1492R:5’- GGTTACCTTGTTACGACT-3’进行细菌16SrDNAPCR检测，经过琼脂糖凝胶电泳均到了大小为 1500bp左右的单一片段（如图2）。

图2中，泳道M为DNA分子量标记DL2000Marker，泳道1~11分别为大肠杆菌、嗜水气 单胞菌、哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、轮虫弧菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球 菌、藤黄微球菌、地衣芽孢杆菌16SrDNA条带。

本发明提取DNA的RAPD检测，为了验证微波炉—液氮法提取DNA同其他方法（如试 剂盒法）提取DNA的RAPD检测效果，使用4条RAPD引物分别以微波炉-液氮法和试剂盒法提取 的哈氏弧菌DNA为模板进行RAPDPCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测比较两种方法 提取的DNA为模板RAPD指纹图谱。结果以这两种方法提取的DNA为模板的RAPD图谱一致（如 图3）。证明该方法提取DNA质量良好，可以用该方法替代试剂盒法提取DNA做模板进行常规 PCR实验。

图3中，泳道M为DNA分子量标记1kbMarker；1，2，3和4表示4对不同的RAPD引物；a 为微波炉—液氮法提取DNA为模板条带，b为试剂盒法提取DNA为模板条带。可见1a和1b；2a 和2b；3a和3b以及4a和4b之间的条带相似。

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