一种识别半胱氨酸和同型半胱氨酸新型荧光探针的合成与应用

摘要

本发明涉及一种用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的荧光探针的制备方法和应用，属于化学分析检测技术领域。其分子结构如下：

说明书

技术领域

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种可以检测半胱氨酸和同型半胱氨酸的新型红光-近红外荧光探针的制备方法以及其在体外和活细胞内部检测半胱氨酸和同型半胱氨酸方面的应用。

背景技术

生物巯基化合物，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)和谷胱甘肽(Glutataione，GSH)等在生物的生理和病理过程中发挥着重要的调节作用。半胱氨酸是参与生命体的蛋白质合成，解毒作用以及新陈代谢过程的必需氨基酸。研究表明，半胱氨酸过高与神经毒性有密切关系，而半胱氨酸过低又与生长缓慢，嗜睡，肝损伤，皮肤损害等相关联。同型半胱氨酸与各种血管和肾脏疾病有关。同型半胱氨酸过高会增加获心血管疾病和阿尔采默病的风险。谷胱甘肽是人体内氧化还原作用和解毒作用是否正常运作的指示剂，并与白细胞减少，癌症，艾滋病病毒感染等有密切联系。因此研究有效的生物硫醇的检测技术在化学，生物学，以及医学领域都非常重要。由于荧光探针具有操作简单，无辐射，高灵敏度和高分辨率的优势，使其成为检测生物硫醇的理想选择。目前，已经报道了多种具有高灵敏度检测生物硫醇的荧光探针。然而大部分这类探针是基于硫原子的强亲核性，因此它们对半胱氨酸以及同型半胱氨酸的检测难以抵制其他硫醇的干扰。并且多数这类探针还有短发射波长和小斯托克斯位移(Stokesshifts)的缺点。然而长得发射波长能够减少探针检测过程中的背景荧光和活细胞的光损伤，大斯托克斯位移能够提高检测的灵敏度。至今还没有报道过一种具有大斯托克斯位移，用于检测半胱氨酸和同型半胱氨酸，基于丙烯酰脂的红光-近红外荧光探针。

发明内容

本发明之一目的在于提供一种合成简单、反应温和、产率较高、成本较低的荧光探针合成方法；本发明之另一目的是提供一种好选择性、高灵敏度，强抗干扰能力，大斯托克斯位移(Stokesshifts)，发射波长在近红外，能够对体外或者活细胞内部的半胱氨酸和同型半胱氨酸进行监测或者细胞荧光成像的荧光探针。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光开关(off-on)法识别半胱氨酸和同型半胱氨酸的新型荧光探针，其分子结构式如下：合成路线如下：具体合成方法如下：(a)在50ml圆底烧瓶中，将3-硝基邻苯二甲腈(2.0g，11.6mmol)，K₂CO₃(1.8g，12.7mmol)和NaNO₂(0.8g，11.6mmol)溶于二甲基亚砜中(30mL)，130℃油浴搅拌回流30min，反应完成。冷却至室温，加入90ml蒸馏水稀释反应液，用2M盐酸酸化至PH＝3，产生沉淀，抽滤，用蒸馏水和甲醇洗涤滤饼，真空干燥，冰醋酸重结晶进一步纯化得到棕色晶体。即得中间产物3-羟基邻苯二甲腈。产量：0.9g。收率54％。(b)在25ml圆底烧瓶中，将上步所得产物(288mg，2mmol)，2-氨基吡啶(385mg，4.1mmol)和CaCl₂(46mg，0.41mmol)溶于正丁醇(6mL)中。氩气保护，110℃油浴加热回流5天，反应完全，冷却至室温，真空旋蒸除去正丁醇，水洗，常压过滤，滤饼真空干燥，经柱层析纯化得到产物，真空干燥过夜，得到橘黄色粉末。即得中间产物羟基染料4。产量：141.6mg。收率25％。(c)将上步所得产物(79.25mg，0.25mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.07mL，0.5mmol)，冰浴下逐滴加入溶于4ml无水二氯甲烷的丙烯酰氯(58.16mg，0.31mmol)，氩气保护，室温搅拌下反应10分钟，反应完全，冰浴下旋蒸除去二氯甲烷，快速柱层析分离得到黄色粉末。即得探针分子。产量：75.31mg。收率：81.2％。

本发明的荧光探针的作用机理如下，由于丙烯酸酯部分的光诱导电子转移(PET)，探针分子没有荧光。半胱氨酸(Cys)，同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)能够与探针分子中丙烯酸酯的双键发生亲核加成反应得到硫醚衍生物，半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)反应后得到的硫醚衍生物能够通过分子内合环脱去硫醚部分恢复羟基染料4，探针分子由无荧光变成很强的红色荧光，谷胱甘肽(GSH)反应后得到的硫醚衍生物因为中间产物的动力学禁阻而无法发生分子内合环反应。从而实现特异性检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的目的。探针分子的响应过程如下：

高效液相色谱验证了此响应机理，探针分子和对应的羟基染料4液相色谱图中各自在15分钟和24.57分钟出现单峰。当用0.5倍当量半胱氨酸(Cys)处理探针分子后，15分钟的探针分子峰减弱的同时，24.57分钟出现染料4的单峰。用5倍当量半胱氨酸(Cys)处理探针分子后，15分钟的探针分子峰完全消失，只留下24.57分钟的染料分子峰。

本发明的荧光探针在近红外发射，其与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)作用前无荧光，作用后荧光发射峰在585nm处。

本发明的荧光探针具有大斯托克斯位移(Stokesshifts)，最大吸收在368nm，与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)作用后最大发射在585nm，斯托克斯位移(Stokesshifts)为217nm。

本发明的荧光探针选择性好。探针分子的测试体系为含有1.0mM的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，PH为7.4的10mM的PBS缓冲溶液，室温下测量。探针分子本身没有荧光，在加入5倍当量半胱氨酸(Cys)之后，在最大发射波长585nm处荧光强度增大了86倍，加入5倍当量半胱氨酸(Hcy)之后，荧光强度增大了84倍。而在加入同样当量的GSH和其他生理氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，andThr)后，荧光只有几乎可以忽略的增加。

本发明的荧光探针抗干扰能力强，其他生理氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，andThr)的存在不影响探针分子与半胱氨酸(Cys)的作用。

本发明的荧光探针灵敏度高，探针分子的荧光强度随着半胱氨酸(Cys)浓度的增加逐渐增加，直到达到最大值。半胱氨酸(Cys)浓度在低浓度(0-7uM)与探针分子的荧光强度成很好的线性关系。检测限为5.6nM。可见本发明的探针分子可以用于在水相中检测半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)。

本发明的荧光探针对半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)响应速度快，探针分子中加入5倍当量的半胱氨酸(Cys)后，荧光快速增强，在10分钟达到最大值，加入5倍当量的同型半胱氨酸(Hcy)后，在15分钟达到最大值。且30秒内即可观察到荧光的明显变化。

本发明的荧光探针表现出较宽的应用范围，探针分子在pH为7至10的范围内都可以对半胱氨酸选择性识别。

本发明所述的探针分子合成路线简单，产率较高，成本较低，对对半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)的发射波长在近红外，斯托克位移大，选择性好、抗干扰能力强，灵敏度高，响应速度快，具有较宽的应用范围，该荧光探针在生物化学，环境科学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与不同种类氨基酸作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，半胱氨酸(Cys)与其他氨基酸共存时，与荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中与半胱氨酸作用后的荧光强度比值(I/I₀)柱状图。

图3为本发明的荧光探针(5.0×10^-5mol/L)在不同条件下的高效液相色谱(a)荧光探针的液相色谱。(b)荧光探针(5.0×10^-5mol/L)与0.5equiv.半胱氨酸作用后的液相色谱。(c)荧光探针(5.0×10^-5mol/L)与5equiv.半胱氨酸作用后的液相色谱。(d)荧光探针与半胱氨酸作用后生成的羟基染料4(5.0×10^-5mol/L)液相色谱。横坐标为时间，纵坐标为响应值。

图4为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与不同浓度半胱氨酸(Cys)作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与半胱氨酸(Cys)浓度的线性关系，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图7为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与同型半胱氨酸(Hcy)浓度的线性关系，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中，与半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)作用过程中荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图9为本发明的荧光探针(5.0×10^-6mol/L)在不同pH值缓冲溶液中，与半胱氨酸(Cys)作用前后的荧光强度，横坐标为pH，纵坐标为荧光强度。

具体实施实例

实施例1：中间产物3-羟基邻苯二甲腈的合成

在50ml圆底烧瓶中，将3-硝基邻苯二甲腈(2.0g，11.6mmol)，K₂CO₃(1.8g，12.7mmol)和NaNO₂(0.8g，11.6mmol)溶于二甲基亚砜中(30mL)，130°C油浴搅拌回流30分钟，反应完成。冷却至室温，加入90ml蒸馏水稀释反应液，用2M盐酸酸化至PH＝3，产生沉淀，抽滤，用蒸馏水和甲醇洗涤滤饼，真空干燥，冰醋酸重结晶进一步纯化得到棕色晶体。产量：0.9g。收率54％。

实施例2：中间产物染料4的合成

在25ml圆底烧瓶中，将上步所得产物3-羟基邻苯二甲腈(288mg，2mmol)，2-氨基吡啶(385mg，4.1mmol)和CaCl₂(46mg，0.41mmol)溶于正丁醇中(6mL)。氩气保护，110℃油浴加热回流5天，反应完全，冷却至室温，真空旋蒸除去正丁醇，水洗，常压过滤，滤饼真空干燥，经柱层析纯化得到产物，真空干燥过夜，得到橘黄色粉末。产量：141.6mg。收率25％。结构表征如下：¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ_H13.70(s，1H)，8.62(m，2H)，7.78(t，J＝7.9Hz，2H)，7.60(s，1H)，7.52(d，J＝7.3Hz，2H)，7.38(d，J＝8.0Hz，1H)，7.19-7.09(m，3H)。¹³CNMR(101MHz，CDCl₃)δ_c160.10，159.34，155.81，155.59，153.70，147.98，147.76，138.12，138.08，135.66，133.58，123.43，122.31，120.50，120.27，118.98，118.29，114.52。

实施例3：探针分子的合成

将上步所得产物(79.25mg，0.25mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中，再加入三乙胺(0.07mL，0.5mmol)，冰浴下加入溶于4ml无水二氯甲烷的丙烯酰氯(58.16mg，0.31mmol)，氩气保护，室温搅拌下反应10分钟，反应完全，冰浴下旋蒸除去二氯甲烷，快速柱层析分离得到黄色粉末。产量：75.31mg。收率：81.2％。探针分子的表征如下：¹HNMR(400MHz，DMSO)δ_H14.02(s，1H)，8.74(d，J＝4.6Hz，2H)，8.02–7.95(m，2H)，7.91(dd，J＝14.1，7.2Hz，1H)，7.82(t，J＝7.7Hz，1H)，7.56(d，J＝7.9Hz，1H)，7.48(d，J＝7.8Hz，1H)，7.29(dd，J＝12.1，6.9Hz，2H)，7.19(d，J＝7.8Hz，1H)，6.63(d，J＝8.0Hz，2H)，6.29(dd，J＝7.8，3.0Hz，1H)。

实施例4：本发明:荧光探针的应用

将探针分子溶于PBS缓冲溶液(10mM，pH＝7.4，1.0MmCTAB)中配制成5.0×10^-6mol/L的溶液，向溶液中加入各种氨基酸(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，ThrandGSH)后没有引起荧光的明显变化，而加人氨基酸(Cys,Hcy)引起了荧光显著变化，该荧光探针对半胱氨酸和同型半胱氨酸表现出高灵敏度、高选择性的识别。当半胱氨酸与干扰物质(Asp，Ala，Val，Phe，His，Leu，Ser，IIe，Trp，Lys，Arg，Pro，Gly，Met，Tyr，Glu，ThrandGSH)共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很强的抗干扰能力。该探针分子与半胱氨酸响应速度快，30秒内即可观察到荧光的变化。探针分子在pH为7至10的范围内都可以对半胱氨酸选择性识别，表现出了良好的生物适应能力。