一种1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物的制备方法及检测甲胎蛋白的方法

摘要

本发明涉及医学肿瘤标志物检测领域，具体是一种1，1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物制备及其检测甲胎蛋白的方法。制备1，1’—二茂铁二甲酸无限配位聚合物分散在聚乙烯亚胺（PEI）溶液中，制得Fc?COOH/PEI复合物，制得Pt纳米颗粒。将Pt纳米颗粒与Fc?COOH/PEI复合物通过静电作用Fc?COOH/PEI/Pt复合物。将二抗（Ab2）和G?quadruqlex加入上述复合物，然后加入血红素构建Hemin/G?quadruqlex/ Fc?COOH/PEI/Pt Ab2共轭物。本发明还涉及检测甲胎蛋白的方法。本发明电化学免疫传感器具有较好的灵敏度，并且检测速度快，准确率高，检测甲胎蛋白有较好的专一性。

说明书

技术领域

本发明涉及医学肿瘤标志物检测领域，具体是一种1，1’—二茂铁二甲酸/铂纳米 颗粒/DNA酶复合物制备及其检测甲胎蛋白的方法。

背景技术

对肿瘤标志物的检测方法主要有酶联免疫法（Wan,Y.,QiP.,ZhangD.,Wu J.J.,WangY.2012.Biosens.Bioelectron.33,69–74.和Jia,C.P.,Zhong,X.Q., Hua,B.,Liu,M.Y.,Jing,F.X.,Lou,X.H.,Yao,S.H.,Xiang,J.Q.,Jin,Q.H., Zhao,J.L.2009.Biosens.Bioelectron.24,2836–2841.）、化学发光免疫法（Zhang A.M.,XiangH.K.,ZhangX.,GuoW.W.,YuanE.H.,HuangC.S.,JiaN.Q.,2016. Biosens.Bioelectron.75,206–212.和XuS.J.,LiuY.,WangT.H.,andLiJ.H. 2011.Anal.Chem.,83(10),3817–3823.）和荧光免疫法（Xie,Q.F.,WengX.H.,Lu L.J.,LinZ.Y.,XuX.W.,FuC.L.2015.Biosens.Bioelectron.77,46–50.和Hua, W.H.,Liua,Y.S.,Yang,H.B.,Zhou,X.Q.,Li,C.M.2011.Biosens. Bioelectron.26,3683–3687.）等，虽然这些方法具有灵敏、准确、特异性高等特点,但其在 环保防护、操作速度、定量检测等方面各有不足之处;尽管有的已实现了自动化，但由于专 用仪器、专用试剂价格昂贵，目前尚不能在实验室普及应用。因而发展新的免疫检测技术， 降低检测成本，加快检测速度和在线能力以适应大规模筛查已成为亟待解决的问题。为了 满足现代生物检测需求，免疫传感器应运而生。它是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反 应结合起来，监测抗原抗体反应的生物传感器，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等优 点，广泛应用于临床检测与诊断。其中，电化学免疫传感器由于其设备小型化，简化分析过 程，测量过程自动化等独特优点已经成为检测肿瘤标记物的有力的方法。

近几年，纳米材料的快速发展与应用为传感器的发展提供了广阔的前景。有机无 机杂化材料在新型功能材料如选择性催化、分子识别、可逆性主客体分子离子交换、超高纯 度分离、生物传导材料、光电材料、磁性材料和芯片等新材料开发中显示了诱人的应用前 景,而成为当今化学和材料学科中最为活跃的研究领域之一。例如，Han等人制备了Au- PAMAM-C₆₀杂化材料，用作氧化还原探针，应用在电化学免疫传感器中，实现了对红细胞生成 素（EPO）的分析检测。

本文选择制备1，1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物杂化材料，用作标 记物来制备电化学免疫传感器，并用于肿瘤标记物（以甲胚蛋白AFP为例）的检测。纳米材料 的制备方法简单、快速、成本低，以此为标记物的免疫传感器具有较好的选择性、稳定性和 重现性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种甲胎蛋白快速检测的纳米材料，该 材料能在常规条件下实现对甲胎蛋白的检测，并具有较低的检测限，且能用于实际血清样 品的检测。

本发明所采用的技术方案是：1、一种1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复 合物的制备方法，按照如下的步骤进行

步骤一、将1,1’-二茂铁二甲酸Fc-COOH溶解在甲醇中，在空气中敞口放置生成无限配 位聚合物ICP，将无限配位聚合物ICP分散在聚乙烯亚胺PEI溶液中，制得1,1’-二茂铁二甲 酸配位聚合物/聚乙烯亚胺复合物Fc-COOH/PEI；

步骤二、将氯铂酸钾K₂PtCl₆溶液加入到沸腾的去离子水中，然后将柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇溶液和含硼氢化钠NaBH₄的柠檬酸钠溶液加入上述溶液进行磁力搅拌，将溶液冷却后，获得 的沉淀物用去离子水离心洗涤三次或者以上，即制得Pt纳米颗粒；

步骤三、将步骤二制备的Pt纳米颗粒与步骤一制备的1,1’-二茂铁二甲酸配位聚合物/ 聚乙烯亚胺复合物Fc-COOH/PEI混合对其进行超声处理2小时，使带有正电的Fc-COOH/PEI 复合物和带负电的Pt纳米颗粒通过静电作用生成Fc-COOH/PEI/Pt复合物。

步骤四、将二抗Ab₂和四联体G-quadruqlex加入到步骤三制备的Fc-COOH/PEI/Pt 复合物中，在4℃的环境下孵育12小时，对生成产物离心，用磷酸缓冲溶液PBS清洗后，加入 氯化血红素HeminC₃₄H₃₂ClN₄O₄Fe，生成物用磷酸缓冲液PBS溶液清洗多次后，离心得到的 Hemin/G-quadruqlex/Fc-COOH/PEI/PtAb₂共轭物即为1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗 粒/DNA酶复合物。

作为一种优选方式：步骤一中，1,1’-二茂铁二甲酸Fc-COOH的量为5-8a毫克，甲醇 的量为5-8a毫升，聚乙烯亚胺PEI溶液的量为1-1.8a毫升，浓度为0.4克/升，步骤二中，氯铂 酸钾K₂PtCl₆的量为3-4.8a毫升，质量百分比浓度为0.2%，去离子水的量为39-62a毫升，柠檬 酸钠Na₃C₆H₅O₇溶液的量为0.92-1.5a毫升，质量百分比浓度为1%，硼氢化钠柠檬酸钠溶液的 量为0.46-0.74a毫升，质量百分比浓度为0.08%，步骤四中，二抗Ab₂和四联体G-quadruplex 浓度都为1微摩尔/升，加入量都为250-400a微升，氯化血红素HeminC₃₄H₃₂ClN₄O₄Fe的浓度 为0.2毫摩尔/升，加入量为500-800a微升，a为正整数。

利用制备的1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物检测甲胎蛋白的方 法：将用Au纳米颗粒进行修饰的玻碳电极放入甲胎蛋白的抗体溶液中，在4℃孵育6-12小 时，然后取出玻碳电极放在牛血清蛋白BSA中孵育2-6小时封闭未特异性结合的活性位点， 取出玻碳电极后依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原修饰玻碳电极，使得抗原与抗体特异性结 合，然后将修饰好的玻碳电极在Hemin/G-quadruqlex/Fc-COOH/PEI/PtAb₂共轭物中保持 25℃下孵育0.5-1小时，然后用PBS溶液清洗2-5次，构建成夹心免疫传感器；将夹心免疫传 感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白的浓度。

作为一种优选方式：用Au纳米颗粒进行修饰的玻碳电极是指将玻碳电极用Al₂O₃粉 末打磨，然后分别在去离子水，丙酮，乙醇中超声清洗，最后通过电沉积法在质量百分比浓 度为1%的HAuCl₄溶液将Au纳米颗粒附着于玻碳电极上。

作为一种优选方式：依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原修饰玻碳电极是指将玻碳电 极依次在浓度为0.1皮克/毫升、0.5皮克/毫升、1皮克/毫升、5皮克/毫升、10皮克/毫升、100 皮克/毫升、1纳克/毫升、10纳克/毫升、100纳克/毫升的甲胎蛋白中保持25℃下孵育0.5-1 小时。

作为一种优选方式：将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白的 浓度是指，将夹心免疫传感器在过氧化氢H₂O₂浓度为0.25毫摩尔/升、磷酸浓度为0.2毫摩 尔/升、PH为7.4的待测溶液中以100毫伏/秒的扫描速率在0.2-1伏特范围内进行测试，夹心 免疫传感器对甲胎蛋白是非线性吸附，甲胎蛋白的浓度检测范围是0.1皮克/毫升到100纳 克/毫升，在此范围内，甲胎蛋白浓度的对数与电流信号成线性相关性，对应的线性方程为y =-0.632521lg(x)-4.67332，其中，x是甲胎蛋白抗原的浓度，单位是纳克/毫升，y是检测的 电流信号，单位是微安。

本发明的有益效果是：本发明方法制备的1，1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA 酶复合物，构建夹心式免疫传感器对甲胎蛋白进行检测。此电化学免疫传感器具有较好的 灵敏度，并且检测速度快，准确率高，检测甲胎蛋白有较好的专一性。

附图说明

图1是无限配位聚合物ICP透射电子显微镜（TEM）图（50nm）；

图2是Fc-COOH/PEI/Pt复合物透射电子显微镜（TEM）图（100nm）；

图3是使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白的浓度的电流和电势图；

图4是使用差分脉冲伏安法DPV检测甲胎蛋白的浓度的电流与甲胎蛋白的浓度对数图；

图5是本发明制备的电化学免疫传感器与传统酶联免疫法测试(ELISA)对应浓度的线 性关系图。

具体实施方式

一种1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物的制备方法，按照如下的步 骤进行

步骤一、将5-8毫克1,1’-二茂铁二甲酸Fc-COOH溶解在5-8毫升甲醇中，然后在空气中 敞口放置2h生成无限配位聚合物ICP，将无限配位聚合物ICP分散在聚乙烯亚胺PEI溶液中 （聚乙烯亚胺PEI溶液的量为1-1.8毫升，浓度为0.4克/升），制得1,1’-二茂铁二甲酸配位聚 合物/聚乙烯亚胺复合物Fc-COOH/PEI；图1中可以看到无限配位聚合物ICP的直径大概有 250-270nm，从图1中知无限配位聚合物ICP颗粒的表面光滑并具有均质结构的纳米球结构。

步骤二、将3-4.8毫升质量百分比浓度为0.2%的氯铂酸钾K₂PtCl₆溶液加入到沸腾 的去39-62毫升离子水中，然后将柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇溶液（量为0.92-1.5毫升，质量百分比 浓度为1%）和含硼氢化钠NaBH₄的柠檬酸钠溶液（量为0.46-0.74a毫升，质量百分比浓度为 0.08%）加入上述溶液进行磁力搅拌，将溶液冷却后，获得的沉淀物用去离子水离心洗涤三 次，即制得Pt纳米颗粒。

步骤三、将步骤二制备的Pt纳米颗粒与步骤一制备的1,1’-二茂铁二甲酸配位聚 合物/聚乙烯亚胺复合物Fc-COOH/PEI混合，对其进行超声处理2小时，使带有正电的Fc- COOH/PEI复合物和带负电的Pt纳米颗粒通过静电作用生成Fc-COOH/PEI/Pt复合物。图2可 以看到Pt纳米颗粒均匀的附着于PEI修饰的无限配位聚合物ICP，说明成功获得Fc-COOH/ PEI/Pt复合物。

步骤四、将二抗Ab₂（浓度为1微摩尔/升，量为250-400微升）和四联体G- quadruqlex（浓度为1微摩尔/升，量为250-400微升）加入到步骤三制备的Fc-COOH/PEI/Pt 复合物中，在4℃的环境下孵育12小时，对生成产物离心，用磷酸缓冲溶液PBS清洗后，加入 氯化血红素HeminC₃₄H₃₂ClN₄O₄Fe（浓度为0.2毫摩尔/升，加入量为500-800a微升），生成物用 磷酸缓冲液PBS溶液清洗多次后，离心得到的Hemin/G-quadruqlex/Fc-COOH/PEI/PtAb₂共轭物即为1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物。

利用制备的1,1’—二茂铁二甲酸/铂纳米颗粒/DNA酶复合物检测甲胎蛋白的方 法，首先将玻碳电极用三氧化二铝Al₂O₃粉末打磨，然后分别在去离子水，丙酮，乙醇中超声 清洗，最后通过电沉积法在质量百分比浓度为1%的HAuCl₄溶液将Au纳米颗粒附着于玻碳 电极上，然后将用Au纳米颗粒进行修饰的玻碳电极放入甲胎蛋白的抗体溶液中，在4℃孵育 6-12小时，然后取出玻碳电极放在牛血清蛋白BSA中孵育2-6小时封闭未特异性结合的活性 位点，取出玻碳电极后依次用不同浓度的甲胎蛋白抗原修饰玻碳电极是指将玻碳电极依次 在浓度为0.1皮克/毫升、0.5皮克/毫升、1皮克/毫升、5皮克/毫升、10皮克/毫升、100皮克/ 毫升、1纳克/毫升、10纳克/毫升、100纳克/毫升的甲胎蛋白中保持25℃下孵育0.5-1小时， 使得抗原与抗体特异性结合，然后将修饰好的玻碳电极在Hemin/G-quadruqlex/Fc-COOH/ PEI/PtAb₂共轭物中保持25℃下孵育0.5-1小时，然后用PBS溶液清洗2-5次，构建成夹心免 疫传感器；将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV（使用CHI-660E电化学工作站的差分 脉冲伏安法DPV）检测甲胎蛋白的浓度；将夹心免疫传感器使用差分脉冲伏安法DPV检测甲 胎蛋白的浓度是指，将夹心免疫传感器在过氧化氢H₂O₂浓度为0.25毫摩尔/升、磷酸浓度为 0.2毫摩尔/升、PH为7.4的待测溶液中以100mV/s的扫描速率在0.2-1V进行测试，夹心免疫 传感器对甲胎蛋白是非线性吸附，当甲胎蛋白的浓度在0-0.1pg/ml时，观察到空白缓冲液 的电流信号近似-2微安，当甲胎蛋白的浓度在0.1皮克/毫升时，得到的电流信号开始大于- 2微安，甲胎蛋白抗原的浓度检测范围是0.1皮克/毫升到100纳克/毫升，如图3和图4所示， 在此范围内，甲胎蛋白浓度的对数与电流信号成线性相关性，其线性相关系数平方是 0.992，对应的线性方程为y=-0.632521lg(x)-4.67332，其中，x是甲胎蛋白抗原的浓度，单 位是纳克/毫升，y是检测的电流信号，单位是微安。其最低检测限为0.086皮克/毫升(信噪 比为3)，与其它检测方法相比，构建的电化学免疫传感器具有较低的检测限和较宽的检测 范围（R是线性相关系数，R²是线性相关系数的平方，n代表的是实验次数）。

甲胎蛋白抗原浓度与电流信号的对应关系如下表所示

x（纳克/毫升） 10^-45×10^-410^-35×10^-310^-210^-11 10 50 100 lg x -4 -3.3 -3 -2.3 -2 -1 0 1 1.7 2 y（微安） -2.26 -2.51 -2.75 -3.04 -3.52 -4.07 -4.51 -5.06 -5.55 -6.09

图5可以观察到构建的电化学免疫传感器与酶联免疫法检测的线性相关方程为y= 0.73767x-0.0013，线性相关系数平方达到0.9997，(R²是线性相关系数的平方，n是实验次 数)证明了设计的电化学免疫传感器与传统的ELISA法具有很高的相关性。

专一性分析

将制得的夹心免疫传感器分别在空白缓冲溶液、20纳克/毫升的不同干扰物质（癌胚抗 原,前列腺特异性抗原,葡萄糖，K+,抗坏血酸）的缓冲溶液中孵育40分钟后，用磷酸缓冲溶 液充分洗涤，然后检测其差分脉冲伏安信号，构建的夹心免疫传感器与上述五种干扰物质 作用后的还原峰电流信号变化均很小，约为-2微安左右。和空白组比较，干扰物质产生的电 流变化小于2%。相反，当构建的免疫传感器与1纳克/毫升的甲胎蛋白作用时，还原峰电流变 化显著，为-4.75微安。说明由Hemin/G-quadruqlex/Fc-COOH/PEI/Pt复合物纳米材料构建 的电化学免疫传感器对检测甲胎蛋白有较好的专一性。