用于确定体液样本中脂质和其他干扰物质的方法

摘要

本发明涉及一种用于更准确地检测体液中脂质和其他干扰物质浓度的方法和自动分析器，尤其是血清和血浆样本中例如胆红素和血红蛋白的干扰物质浓度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于确定体液中脂质和其他干扰物质浓度的方法和 自动分析器，尤其是血清和血浆样本中例如胆红素和血红蛋白的干扰物质 的浓度。

背景技术

许多用于确定体液样本中的生理参数的检测分析方法是基于光度测 定测量原理。光度测定法可对液体样本中的分析物进行定性和定量检测。

在许多情况下，可通过将患者的一份体液与一种或多种分析试剂在体 外混合，来引发生化反应，以使该分析试剂的光学性质发生可测量的变化， 从而对临床相关参数(例如分析物的浓度或活性)进行测定。光度测定法 对光通量在穿过吸收的和/或散射的介质之后的衰减进行检测和利用。根据 所引发的生物化学反应或生物物理反应，可使用不同光度测定测量方法， 这些方法对浑浊液体化验制剂进行测量。

为此，可使用浊度法，在该方法中，溶液或悬浮液的浊度或光密度是 基于直接通过该悬浮液的光束的光衰减或吸光度来测量的。

该光束的强度在穿过含有液体样本的测量单元或试管之后减弱。这些 损耗可受该光束与位于测量单元内的样本之间的相互作用(例如，吸收、 衍射、散射和/或反射效果)的影响。通常通过参考测量，衍射、散射和反 射的作用可忽略不计或得以补偿，使得该光束的衰减主要受吸收影响。

因此，浓度的光度测定是基于吸光度或吸收率取决于一定入射光波长 处的溶解性物质的浓度和测定单元的层厚度这一规律。这一关系在比尔- 朗伯定律表述为：

E(λ)＝-log(I/I₀)＝ε(λ)·c·d

其中，E(λ)为吸光度，其取决于光束的波长λ，I为穿过样本后的光强度， I₀为穿过样本前的光强度，ε(λ)为受照射物质的取决于波长的摩尔消光 系数，c为受照射物质的摩尔浓度，d为受光束照射的层厚度，如测量单 元的层厚度。

基于样本的吸光度E(λ)可确定溶液中物质的浓度。为此，必须提 前测定已知浓度的至少一种标准溶液的吸光度。由于吸光度与浓度成正 比，因此可通过对已知浓度的多种标准溶液的吸光度测量进行校准来确定 未知样本中的溶解性物质的浓度。

然而，样本的吸光度不仅取决于待确定物质本身的浓度，还取决于样 本基质的性质。若物质不会彼此相互作用，那么这些物质的吸光度在混合 物中便会相加。体液(例如包括血浆或血清)是复杂的混合物，不仅含有 待确定分析物，还含有多种影响样本的总吸收率的其他物质。

然而，在个别情况中，体液样本可含有异常高浓度的一种或多种固有 物质，即内源性物质，当超出可容许的浓度时，这些物质会影响光度测定 探测方法并可造成系统误差。

已知的是溶血、黄疸和/或脂血血清或血浆样本会造成问题，这些样本 含有异常高浓度的血红蛋白、胆红素和/或脂质。这些异常高浓度的干扰物 质可能由患者的病理状况、样本的不适当获得或储存所引起。假如这些样 本用于测定分析性的、与诊断相关的参数的光度测定方法，会有测定错误 的风险，可能会导致诊断失误，最坏的情况会导致对患者的错误治疗。对 溶血、黄疸和脂血样本的预先分析识别便尤为重要，以避免错误分析结果。

因此，需要找到确定体液样本中干扰物质对光谱测定的影响或鉴别含 有高浓度的一种或多种干扰物质的体液样本的方法。

在EP-A1-1059522、US4,263,512、US2009/0009750A1和US 2010/0174491A1中描述了测定血浆或血清样本中的胆红素、血红蛋白和 脂质的多种方法。例如，在EP-A1-1059522中，对减去由血红蛋白和胆红 素引起的吸光度后的、特别含有由脂质引起的吸光度进行了局部线性近似 估计。

然而，即使是最后提到的这种方法也具有一个缺点，即相对高脂质浓 度可能会影响同一样本中胆红素和血红蛋白的测定，从而扭曲其测量值。

WO2013/010970A1描述了一种方法，该方法即使在高脂质浓度存在 的情况下也可精确测定样本中胆红素、血红蛋白及脂质浓度。WO 2013/010970A1描述的该方法基本上包括测量各种波长处的样本吸光度， 计算脂质吸光度的幂函数近似曲线，减去血红蛋白和胆红素引起的吸光度 直到剩下脂质曲线，最后，通过理论上确定的脂质吸光度值除以脂质特定 的消光系数来确定脂质含量。

观察发现，这种方法只可准确测定约20％的所有样本中的脂质含量， 对于剩下的样本，确定的脂质含量与实际脂质含量之间存在+/-25％的偏 差。

发明内容

因此，本发明的目的在于改进根据WO2013/010970A1的方法，以更 加准确地测定体液样本中的脂质浓度。

尤其是，这一目的通过以下事实实现，即根据本发明，生成两种不同 波长处的脂质吸光度的近似曲线的两个值之间的差值，并除以脂质特定的 消光系数，而并非将理论上确定的脂质特定波长处的脂质吸光度的值除以 脂质特定的消光系数。

这种方法可基本上更加准确地测定体液样本中脂质浓度。采用根据本 发明所述的方法测定的脂质含量在任何情况下与实际脂质含量之间的偏 差都不大于20％。因此，根据本发明所述的方法获得的脂质测定的准确度 与化学分析获得的准确度相差无几，但根据本发明所述的方法还具有不需 要将试剂与样本混合的另一优点。

因此，本发明提供了一种用于确定体液样本中脂质浓度的方法，包括 以下步骤：

a)利用多个波长的光照射体液样本；

b)捕捉第一波长处的第一测量值(A1)，在该第一波长处的不是脂 质造成的吸光度能够忽略不计；

c)捕捉第二波长处的第二测量值(A2)，在该第二波长处的胆红素 具有最大吸光度；

d)捕捉第三波长处的第三测量值(A3)，在该第三波长处的血红蛋 白具有最大吸光度；

e)捕捉第四波长处的第四测量值(A4)，在该第四波长处的不是胆 红素和血红蛋白造成的吸光度能够忽略不计；

f)通过确定预定指数q₀处因数p₀，基于第一测量值(A1)计算脂 质吸光度的幂函数近似曲线(L₀)，形式如下：

$E\left(\lambda \right)=p_0·{\lambda }^{q_0};$

g)基于胆红素的第一理论吸光度值(E_B)，确定胆红素浓度(C_B) 的近似值，对应于第二波长处的第二测量值(A2)和近似曲线(L₀)的值 之间的差值；

h)基于血红蛋白的第二理论吸光度值(E_H)，确定血红蛋白浓度 (C_H)的近似值，对应于第三波长处的第三测量值(A3)和近似曲线(L₀) 的值之间的差值；

i)基于第四波长处的血红蛋白(E_H)和胆红素(E_B)的理论吸光 度值和近似曲线(L₀)的值的和，测定第四波长的第三理论吸光度值 (E_HBL)；

j)确定第三理论吸光度值(E_HBL)与第四测量值(A4)之间的偏 差，

其中，

I.若步骤j)中确定的偏差未超出预定阀值，则通过生成第四波长处 的近似曲线(L₀)的值和第一波长处的近似曲线(L₀)的值之间的差值， 并用该差值除以脂质特定的消光系数，从而确定脂质的浓度(C_L)，或

II.若步骤j)中确定的偏差超出预定阀值，则计算脂质的吸光度的修 正近似曲线(L_K)，并用修正近似曲线(L_K)的值重复步骤g)到j)，直 到偏差达到或低于预定阀值，脂质的浓度(C_L)通过以下的方式确定：

i.若第一测量值(A1)未超出在第一波长处的吸光度的预定吸光 度阀值，则生成第四波长处的修正近似曲线(L_K)的值和第一 波长处的该近似曲线(L_K)的值之间的差值，并用差值除以脂 质特定的消光系数，或

ii.若第一测量值(A1)超出在第一波长处的吸光度的预定吸光度 阀值，且若修正近似曲线的指数q_K大于-1，则通过将第一波长 处的第一测量值(A1)与修正近似曲线(L_K)的值相关联的均 衡函数，修正修正近似曲线(L_K)的值，并随后生成第四波长 处修正近似曲线(L_K)的、应用该均衡函数修正后的值与第一 波长处的、应用该均衡函数修正后的值之间的差值，并用该差 值除以脂质特定的消光系数。

在根据本发明的方法的一个实施方式中，第一波长的范围在600nm 和660nm之间，优选地为645nm，在该第一波长处，不是脂质造成的吸 光度能够忽略不计。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，第二波长的范围在440nm 和480nm之间，优选地为470nm，在该第二波长处，胆红素具有最大吸 光度。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，第三波长的范围在400nm 和440nm之间，优选地为415nm，在该第三波长处，血红蛋白具有最大 吸光度。

在根据本发明的方法的另一个实施方式中，第四波长的范围在350nm 和370nm之间，优选地为365nm，在该第四波长处，不是胆红素和血红 蛋白和脂质造成的吸光度能够忽略不计。

在根据本发明的方法的一个优选实施方式中，通过根据本发明的方 法，脂质的特定消光系数(ε_L)可提前确定，从而对通过化学分析(L1、 L2…Ln)确定的已知脂质含量的自然体液样本中的天然脂质进行测定。 与现有技术中公开的使用含有人造脂质的乳剂(如脂质乳剂)来确定消光 系数(ε_Lipid)方法相比，优点在于在后的脂质确定方法提高了准确性。

本发明的上下文中使用的“测量值”(A1；A2；A3等)可采用光度 测量装置进行记录的吸光度测量值。测量值可以是无因次变量，该变量表 示在光束通过可见光、红外光和/或紫外光波长范围的情况下对体液样本的 不透明度的取决于波长的测量。同样地，为了获取强度测量值，在光束穿 过过程中，也可相关于含有体液样本的测定单元或试管的单位厚度来明确 吸光度测量值。在这种情况下，测量值可具有[1/mm]的维度。无论如何， 下述实施方式表示的测量值只是实例性的并取决于测量装置、样本特性和 样本构成。在下文中，尽管在此考虑到衍射、散射和反射对吸光度值产生 影响对本领域的技术人员来说是显而易见的，但这些因素相对于波长范围 内的吸收基本上可忽略不计，因此，在任何情况下，吸光度测量值都等于 吸收值。

本发明的上下文中使用的“理论吸光度值”(E_H、E_B、E_HBL等)并非 实际测量的吸光度值，而是计算的值。

本发明的上下文中使用的“脂质”，尤其是包含存在于人体或动物体 内油脂、甘油三酯或三酰基甘油。

在根据本发明的方法的一个优选实施方式中，对血红蛋白(C_H)和/ 或胆红素(C_B)的浓度额外进行确定。

这是在I.)情况中进行的，即，若步骤j)确定的第三理论吸光度值 (E_HBL)与第四测量值(A4)之间的偏差未超出预定阀值，则通过输出基 于步骤g)和h)中的近似曲线(L₀)测定的血红蛋白浓度和胆红素浓度 (C_H、C_B)的近似值，作为实际的血红蛋白和胆红素的浓度。

在II.)情况中，即，若步骤j)确定的第三理论吸光度值(E_HBL)与 第四测量值(A4)之间的偏差超出预定阀值，则通过输出基于步骤g)和 h)中的修正近似曲线(L_K)确定的血红蛋白浓度和胆红素浓度(C_H、C_B) 的近似值作为实际的血红蛋白和胆红素的浓度，从而完成测定。

在一个优选实施方式中，第三理论吸光度值(E_HBL)与第四测量值(A4) 之间的偏差的预定阀值为10mAU。

在另一个优选实施方式中，第一波长处的吸光度的预定吸光度阀值为 950mAU。

有利的是，可通过使用辐射激光或发光二极管或使用具有多种光学滤 波器的光源，通过多种波长的光来对体液样本进行照射，并可使用光电探 测器，如CCD传感器、CMOS传感器、感光器或适合通过取决于波长的 方法来获取光束光强的类似器件来获取多个测量值(A1；A2；A3；A4)。

本发明的上下文中使用的“体液样本”可以是具有液体一致性且包括 各种浓度的生物活性物质的所有生物性样本。例如，体液样本可包括血清、 血浆、血液、尿液、淋巴液、胆汁或类似液体。

本发明还提供了一种自动分析器，该分析器包括测量装置，其设计用 于根据本发明实施方法中的方法步骤a)至e)，该分析器还包括计算装置 (如处理器)，其设计用于实施权利要求1中的确定脂质浓度(C_L)的其 余方法步骤。

在一个实施方式中，自动分析器的测量装置包括至少一个光源和多个 光学滤波器，用于生成不同波长的光。在另一个实施方式中，测量装置包 括多个光源，优选地，包括多个发光二极管或激光二极管。

在一个优选实施方式中，自动分析器的测量装置包括至少四个光源， 其中第一光源发出波长在600nm和660nm之间范围内的光，第二光源发 出波长在440nm和480nm之间范围内的光，第三光源发出波长在400nm 和440nm之间范围内的光，第四光源发出波长在350nm和370nm之间 范围内的光。

在一个特别优选实施方式中，自动分析器的测量装置包括至少四个光 源，其中第一光源发出波长为645nm的光，第二光源发出波长为470nm 的光，第三光源发出波长为415nm的光，第四光源发出波长为365nm的 光。

有利的是，测量装置还包括至少一个光电探测器，如CCD传感器、 CMOS传感器、感光器或适合通过取决于波长的方式来获取光束光强的类 似器件。

本发明的不同实例性实施方式和设计现将通过附图进行更详细的说 明。

附图说明

图1示出含有血浆样本的吸光度曲线的示意图。具有测量值A1＝A₆₄₅、 A2＝A₄₇₀、A3＝A₄₁₅、A4＝A₃₆₅的吸光度曲线(实线)反映了具有血红蛋白、 胆红素和脂质浓度的人血浆的取决于波长的吸光度的示例性曲线图，各吸 光度重叠。脂质的吸光度的近似曲线L₀(虚线)是基于第一测量值A1＝A₆₄₅和幂函数计算的。近似曲线L_k(短划线)被计算出来并最 终用于计算脂质浓度及血红蛋白和胆红素的浓度。测定的血浆样本的吸光 度值较低，因此，近似曲线L₀通过迭代从下方接近吸光度光谱直至达到 最终近似曲线L_K。

图2与图1类似示出了含有血浆样本的吸光度曲线的示意图。与图1 的样本相比，该情况下测定的吸光度值比较高，因此，近似曲线L₀通过 迭代从上方接近吸光度光谱直至达到最终近似曲线L_K。

图3示出针对多个人体血浆样本，通过化学分析确定的真实脂质含量 (X-轴线)和根据本发明的方法确定的脂质含量(Y-轴线)的比较示意图。 显然，根据本发明确定的脂质含量在任何情况下与真实脂质含量之间的偏 差都不大于+/-20％。

图4示出在具有各种胆红素浓度(X-轴线)的血浆样本中，通过化学 分析(菱形)、现有技术WO2013/010970A1中的方法(三角形)和根据 本发明所述的方法(正方形)测定的脂质(Y-轴线)的比较示意图。显然， 根据本发明确定的脂质含量与通过化学分析确定的脂质含量基本相同。

图5示出在具有高脂质浓度的11种血浆样本(X-轴线)中，通过化 学分析(菱形)、未采用均衡函数的根据本发明所述的方法(正方形)和 采用均衡函数的本发明的方法(三角形)确定的脂质(Y-轴线)的比较示 意图。显然，采用均衡函数的根据本发明测定的脂质含量与通过化学分析 测定的脂质含量几乎相同。

具体实施方式

a)波长

在自动分析器中进行根据本发明的方法，该自动分析器包括具有四个 激光二极管的光度测量装置。利用下述波长的光线对人体血浆样本进行照 射：

645nm第一波长，在第一波长处的非脂质造成的吸光度可忽略不 计；

470nm第二波长，在第二波长处的胆红素具有最大吸光度；

415nm第三波长，在第三波长处的血红蛋白具有最大吸光度；

365nm第四波长，在第四波长处的不是胆红素和血红蛋白和脂质造 成的吸光度可忽略不计。

记录上述四个测量值(A1＝A₆₄₅、A2＝A₄₇₀、A3＝A₄₁₅以及A4＝A₃₆₅)。

b)脂质特定的消光系数

使用上述波长测量通过化学分析(L₁,L₂,…L_n)确定的已知脂质含量 的70种血浆样本的吸光度光谱，利用预定的指数q₀＝-2.46计算形式为

$E\left(\lambda \right)=p_0·{\lambda }^{q_0}$

的幂函数近似曲线(L₀)获得脂质的吸光度，并且生成第四波长(E₃₆₅) 处的近似曲线(L₀)的值和第一波长(E₆₄₅)处的近似曲线(L₀)的值， 从而确定脂质特定的消光系数ε_Lipid。各个吸光度值基于修正的近似曲线L_K进行计算(参见下文c)部分)。

值E₃₆₅和值E₆₄₅之间的差值除以脂质浓度得到脂质特定的消光系数。 通过全部测量得到平均值和中值：

${ϵ}_{Lipid}=\frac{1}{n}\underset{i=1}{\overset{n}{\Sigma }}ϵ=\frac{\left[\frac{E_{1_{365}}-E_{1_{645}}}{L_1}\right]+\left[\frac{E_{2_{365}}-E_{2_{645}}}{L_2}\right]+\left[\frac{E_{n_{365}}-E_{n_{645}}}{L_n}\right]}{n}$

得出脂质特定的消光系数ε_Lipid＝0.0010dL/mg。

c)建立脂质的吸光度的幂函数近似曲线并计算脂质的浓度及血红蛋 白和胆红素的浓度

通过确定预定的指数q₀处的因数p₀，基于第一测量值(A1＝A₆₄₅)计 算具有脂质吸光度的、形式为

$E\left(\lambda \right)=p_0·{\lambda }^{q_0}$

的幂函数近似曲线(L₀)。

明显的是，只有测量值A₆₄₅不足以用来确定两个变量p和q。因此， 指数q₀可基于以参考值为基础的估计而生成。这样，指数q₀可根据经验 值预先确定。对于该情况下的确定过程，指数q₀＝-2.46是预先确定的。由 于在为645nm的第一波长处，由除了脂质以外的其他物质造成的吸光度 可忽略，可通过第一波长处的测量值A₆₄₅确定给定指数q₀处的系数p₀。 具有参数p₀和q₀的已确定的近似曲线可反映样本中的脂质吸光度的吸光 度曲线的第一近似值。就此而言，在已获取到所有波长下的其他测量值的 情况下，可计算脂质的吸光度的特定份额。

由此获得第一近似曲线L₀，该曲线已非常接近实际的脂质吸光度。然 而，该近似曲线L₀，尤其在蓝光或紫外光光谱范围内，可能比脂质的实际 的吸光度曲线更平坦。

随后，基于波长470nm和415nm处的测量值A2＝A₄₇₀和A3＝A₄₁₅，确 定胆红素(C_B)和血红蛋白(C_H)的浓度的第一近似值：

$c_B=\frac{A_{470}-c_H·{ϵ}_{H470}-E_{L470}}{{ϵ}_{B470}}$

$c_H=\frac{A_{415}-C_B·{ϵ}_{B415}-E_{L415}}{{ϵ}_{H415}}$

其中，ε_H470、ε_H415、ε_B470和ε_B415为测量值A₄₇₀和A₄₁₅的波长处的胆红 素(B)和血红蛋白(H)各自的消光系数。在这一点上，消光系数可通 过参考测量值提前确定，或从已储存有参考值的储存装置中检索进行计 算。

C_B和C_H这两个浓度可通过求解上述两个线性系统方程来确定，从而 为血红蛋白(H)的浓度生成以下公式：

$c_H=\frac{A_{470}-E_{L470}-\frac{(A_{415}-E_{L415})·{ϵ}_{B470}}{{ϵ}_{B415}}}{{ϵ}_{H470}-\frac{{ϵ}_{H415}·{ϵ}_{B470}}{{ϵ}_{B415}}}$

此处，可使用近似曲线L₀确定脂质吸光度值E_L470和E_L415。从而得到血红 蛋白浓度C_H的第一近似值。所述的浓度C_H的第一近似值随后可用于确定 胆红素的浓度C_B的第一近似值。这已经得到血红蛋白、胆红素和脂质的 浓度的充分的第一近似值C_H、C_B和C_L，这些值是基于幂函数和上述参数 p₀和q₀的具有第一近似值的线性系统来确定的。

然而，近似值现在可以迭代的方式进一步改善，详见下文。为此，基 于血红蛋白(E_H)和胆红素(E_B)的理论吸光度值和第四波长(365nm) 处的近似曲线(L₀)的值的和，确定第四波长的理论吸光度值(E_HBL)， 即在某一范围内，实际脂质吸光度与近似曲线之间的较大偏差预期为：

E_HBL＝c_H·ε_H365+c_B·ε_B365+E_L365

浓度C_H和C_B通过以上方式确定；数值E_L365(E_L4)仍通过具有参数 p₀和q₀的幂函数得到。

随后，比较这一波长处的值E_HBL和实际测量值A4＝A₃₆₅，以获得偏差 (DeltaE)

ΔE＝A₃₆₅-E_HBL。

若偏差ΔE(DeltaE)大于预定阀值(如10mAU)，则可确定所确定的脂质 浓度的近似曲线L₀未充分准确地确定。在这种情况下，近似曲线L₀可在 下一步中进行修正。为此，描述了波长365nm处的脂质份额的吸光度的、 计算出的吸光度值E_L365(E_L4)，可通过偏差ΔE的百分比进行修正。例如， 可将一半的偏差ΔE的值加到吸光度值E_L365(E_L4)。基于修正后的吸光度 值E_L365(E_L4)，可通过参数p_k和q_k确定修正后的近似曲线L_k：

$p_k=\frac{E_{L365}}{{{\lambda }_{365}}^{q_k}}$

这里的方程是通过将E_L365的值和修正值E_L365+ΔE/2代入幂函数得到 的。这意味着确定曲线L₀可修正，从而使波长645nm处的测量值A1＝A₆₄₅继续处于修正近似曲线L_k，即测量值A₆₄₅用作近似曲线的定位点。

在下一步骤中，基于修正近似曲线L_k，计算各脂质的吸光度份额。重 复该方法直到确定偏差小于预设阀值。随后输出体液样本中的血红蛋白、 胆红素和脂质的浓度的修正近似值。

采用所描述的方法确定的所有样本中的脂质含量与真实脂质含量之 间的偏差不大于+/-20％(参见图3)。

d)确定浑浊样本中的脂质含量

经常冷冻和解冻的血浆样本会出现浑浊，从而导致吸光度增加。

已经发现与WO2013/010970A1中的方法相比，采用根据本发明的方 法可单独确定浑浊样本的脂质。

采用WO2013/010970A1的现有技术中的方法和根据本发明的方法 确定已知脂质浓度(667.7mg/dL)的血浆样本(No.2004657355)的脂质 含量。随后，冷冻该样本并于6个月后解冻该样本，再次确定脂质含量。 所用波长处的已解冻的样本的吸光度总增加量为115％，也就是说，该样 本在解冻后比冷冻前更加浑浊。表1示出了这一结果。从该表中可以看出， 采用传统方法确定的解冻后的脂质含量是冷冻前的两倍以上，但仍然偏离 真实脂质含量20％以上，而采用根据本发明的方法，测得的解冻后的脂质 含量相比冷冻前仅偏离5％。此外，与脂质浓度的真实值偏离仅-4.7％或 0.4％，也就是说，根据本发明的方法在原则上更加准确。

表1

e)在存在高胆红素浓度下确定脂质含量

通过向血浆样本中加入不同量的胆红素以获得9种视觉上可辨别的浓 度水平，采用WO2013/010970A1现有技术中的方法和根据本发明的方 法，采用化学手段确定脂质含量。结果参见图4。显然，在存在各种胆红 素含量的情况下，根据本发明进行的脂质确定和采用化学手段进行的确定 几乎一样；最大偏差只有7％(浓度水平9)。

f)确定高浑浊度样本中的脂质含量

高浑浊度的样本，例如，由于具有极高的脂质含量(大于500mg/dL)， 具有高总吸光度。因此，在一些样本中，正如之前的，采用根据本发明的 方法无法十分准确地确定脂质。这是因为随着脂质浓度的增加，该样本的 吸光度光谱先均匀上升，随后，由于吸光度在高波长处的增加要大于低波 长处，因此吸光度光谱不均衡下降。这就导致根据本发明的方法所采用的 第一波长(645nm)和第四波长(365nm)之间的吸光度的差值不再足够 大，从而无法使用该方法来足够准确地确定脂质含量。所观察到的不充分 确定度高达-70％。

然而，这一影响可通过均衡函数进行修正。该均衡函数可修正第一波 长(E₆₄₅)处的修正近似曲线(L_k)的值。该均衡函数可通过大量已知脂 质浓度的样本来确定。通过将浓度反算进预期的吸光度，可确定用于实际 脂质含量计算的均衡函数。

由于浑浊度严重取决于波长645nm处的吸光度，因此，645nm处的 浑浊度可考虑在内。

计算形式如下：

DeltaE＝E_L365-(-0，7798·E_L645+1，4626)·E_L645|

将此函数应用于样本的第一测量值(A1＝A₆₄₅)，随后用第四波长(365 nm)处的修正近似曲线(L_k)的值和第一波长(645nm)处的值之间的差 值(DeltaE)(该值经过均衡函数修正)，除以脂质特定的消光系数，所得 的结果为：即使在高度浑浊的样本中，脂质浓度也能十分准确地确定，且 与实际值之间的偏差小于+/-20％。图5示出了11种高脂质浓度血浆样本 的脂质测量值的比较。