一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体及其制备方法

摘要

本发明公开了一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌靶向载体及其制备方法。首先通过酯化反应将姜黄素和凝结芽孢杆菌的芽孢表面连接，合成得到姜黄素‑益生菌载体（CUR‑Spore）；再通过酯化反应连接上叶酸，成功制备得到负载姜黄素的益生菌叶酸靶向载体（CUR‑Spore‑FA）。该靶向药物载体能很好的应用于结肠癌的治疗，具有靶向性，而且可减少药物的毒副作用。同时，该载体药物中凝结芽孢杆菌对于姜黄素还有保护作用，使其能够耐受胃酸顺利地通过胃，定植于肠并在肠道萌发释放姜黄素来治疗结肠癌。本发明为提高姜黄素的利用率，建立抗癌药物的靶向输送系统及应用于结肠癌的治疗打下坚实的基础，为结肠癌的治疗提供了一种新的方式。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体及其制备方法。

背景技术

癌症已成为人类健康的一大威胁。如结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)是其中一种人类高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位。随着生活习惯和饮食结构的改变，人们摄入的脂类物质增多，我国的结肠癌发病率呈逐年上升趋势。结肠癌已成为十分严峻的公众健康问题，严重威胁着人民群众的健康和生命，极大地阻碍了我国社会经济的发展，对结肠癌的病因病机及治疗方法的深入研究尤显重要。对于结肠癌等癌症的治疗，除了传统的手术、放疗与化疗外。由于天然药物的多成分、多靶点、多环节、多途径效应，使人们认识到“回归大自然”的重要性，天然化合物的抗肿瘤研究已逐步成为临床抗肿瘤药物研究的热点。

姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取的一种天然多酚，为姜黄的主要活性成分。在亚洲一些国家，姜黄素一直被广泛地用作治疗炎症、哮喘、肝功能紊乱等疾病的药物、食品着色剂和调味剂。此外，姜黄素还在许多肿瘤细胞中发挥着抗炎，抗氧化，抗肿瘤和化学预防作用。许多体内外实验也证实姜黄素能抑制肿瘤生长，显著减少瘤体的数目，减轻多种致癌因素对机体的损害。姜黄素具有很强的凋亡诱导能力，诱导细胞凋亡是其抗肿瘤作用的重要机制，涉及一系列复杂的生物学过程，并受细胞内外多种途径及信号分不同的途径所表现的形式不同，它们之间有交叉，有重叠，构成了错综复杂调控网络。总而言之，姜黄素广谱抗肿瘤活性，具有很好的耐受性和较低的毒性。然而，姜黄素水溶性差导致其生物利用度低，这些阻碍了姜黄素作为候选药物的应用。

近年来的研究表明，对姜黄素母体结构进行前药设计是一种有效的方法。姜黄素前药设计主要是用含有羧基的小分子或大分子载体对其酚羟基进行酯化修饰，通过改造酚羟基一方面增强烯醇结构的电子转移，保护酚羟基并消除结构上电子离域，另一方面通过连接的小分子或大分子载体的性质可以改善姜黄素的溶解性、提高稳定性、延长半衰期、提高生物利用度，增强生物活性，同时具有一定的控释、缓释效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有天然抗癌药物姜黄素应用的缺陷和技术不足，提供一种可负载抗癌药物姜黄素的益生菌靶向载体，将具有抗癌作用的天然药物姜黄素和凝结芽孢杆菌表面的外壳蛋白、叶酸相连接，制备得到CUR-Spore-FA载体。并通过对CUR-Spore-FA载体进行表征，研究姜黄素在模拟胃肠液中的释放规律，结果表明本发明的CUR-Spore-FA载体既能保证姜黄素能在肠道中稳定的释放而在胃液中几乎不释放，为提高天然抗癌药物-姜黄素的利用率，建立抗癌药物的靶向输送系统及应用于结肠癌的治疗打下坚实的基础，既解决了天然抗癌药物-姜黄素素的利用度低的问题又减少了治疗结肠癌的毒副作用，并且使结肠癌的治疗具有靶向性，为结肠癌的治疗开拓了一种新的途径。

本发明的目的是提供一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌靶向载体。

本发明另一目的是提供上述负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种负载抗癌药物的益生菌叶酸靶向载体，是首先通过化学反应将抗癌药物和凝结芽孢杆菌的芽孢表面连接，合成得到抗癌药物-益生菌载体；接着再通过酯化反应连接上叶酸，制备得到负载天然抗癌药物的益生菌叶酸靶向载体。

优选地，所述抗癌药物为姜黄素。

优选地，所述化学反应为酯化反应。

即优选地，本发明提供了一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌靶向载体，是首先通过酯化反应将姜黄素和凝结芽孢杆菌的芽孢表面连接，合成得到姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)；接着再通过酯化反应连接上叶酸，制备得到负载天然抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体(CUR-Spore-FA)。

进一步优选地，所述将抗癌药物和凝结芽孢杆菌的芽孢表面连接是通过酯化反应将天然抗癌药物(姜黄素)连接到益生菌凝结芽孢杆菌芽孢外层衣壳蛋白上。

另外，一种负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体的制备方法，包括如下步骤：

S1.利用姜黄素结构上的羟基和凝结芽孢杆菌芽孢外壳蛋白的羧基发生酯化反应，构建得到姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)；

S2.步骤S1得到的姜黄素-益生菌载体上的羟基与叶酸中的羧基发生酯化反应，将叶酸连接到凝结芽孢杆菌的芽孢外壳蛋白的蛋白中，得到负载天然抗癌药物的益生菌叶酸靶向载体(CUR-Spore-FA)。

其中，优选地，步骤S1的具体方法是：

S11.将凝结芽孢杆菌芽孢粉与二氯甲烷混合，冰盐浴至0℃；

S12.再在步骤S11的体系中加入姜黄素、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺，超声震荡均匀，冰水浴继续反应20～30h；

S13.步骤S12的体系经8000～12000rpm离心5～15min，再分别经过无水乙醇和蒸馏水洗涤洗去未反应的姜黄素，真空干燥，即得到姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)；

优选地，步骤S2的具体方法是：

S21.将姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)和二氯甲烷混合，冰盐浴至0℃；

S22.再在步骤S21的体系中加入叶酸、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺，超声震荡均匀，冰水浴继续反应20～30h，离心洗涤除去未反应的叶酸，并冷冻干燥，即得到负载天然抗癌药物的益生菌叶酸靶向载体(CUR-Spore-FA)。

更优选地，步骤S11所述凝结芽孢杆菌芽孢粉和二氯甲烷的质量体积比为0.01～0.2g：5ml；步骤S12所述姜黄素、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为5～15：2～4：2～4。

更优选地，步骤S21所述姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)和二氯甲烷的质量体积比为0.01～0.2g：20ml；步骤S22叶酸、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为30～50：2～4：2～4。

更优选地，所述凝结芽孢杆菌芽孢粉和姜黄素的质量比为2～5：1；所述姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)和叶酸的质量比为1：2～5。

另外，进一步优选地，步骤S12和步骤S22所述冰水浴继续反应的时间为24h。

优选地，S13所述离心是10000rpm离心10min。

优选地，S13所述无水乙醇和蒸馏水洗涤是洗涤3次。

更优选地，步骤S11所述凝结芽孢杆菌芽孢粉和二氯甲烷的质量体积比为0.1g：5ml；步骤S12所述姜黄素、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为10：3：3。

更优选地，步骤S21所述姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)和二氯甲烷的质量体积比为0.1g：20ml；步骤S22叶酸、DMAP和N,N-二环己基碳二亚胺的质量比为40：3：3。

更优选地，所述凝结芽孢杆菌芽孢粉和姜黄素的质量比为4：1；所述姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)和叶酸的质量比为1：4。

最后，上述负载抗癌药物(姜黄素)的益生菌叶酸靶向载体在制备抗癌药物方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述抗癌药物为抗结直肠癌的药物。

本发明创新地将天然抗癌药物姜黄素通过化学反应连接到能够定植于肠道对人体有益的益生菌凝结芽孢杆菌芽孢的外层衣壳蛋白上，同时CUR-Spore载体再连上叶酸构建靶向药物载体(CUR-Spore-FA)，并进行材料表征，采用的表征方法有：傅里叶红外光谱(FTIR)、拉曼光谱(Raman)、扫描电镜等，证明了载体构建成功。同时，还研究了芽孢在模拟的胃肠液中的萌发及药物释放规律，利用紫外分光光度法测定了该载体在模拟胃肠液中的释放，证明姜黄素能在肠道中稳定的释放而在胃液中几乎不释放，该载体能很好的应用于结肠癌的治疗，为提高天然抗癌药物-姜黄素的利用率，建立抗癌药物的靶向输送系统及应用于结肠癌的治疗打下坚实的基础，为结肠癌的治疗提供了一种新的方式。

而且，本发明所使用的凝结芽胞杆菌(Bacilluscoagulans)作为一种益生菌，具有抗炎、增强人体免疫力、抵抗抗原、排除异物等优点；另外，凝结芽胞杆菌除了具有一般益生菌具有的优点外，还有自身独特的优点，如：抗逆性强、耐高温高压、易贮藏、抗胃酸，芽孢可定植在肠道中并在肠道中萌发，改善肠道微生态环境等。

本发明经过抗癌细胞试验验证，结果显示，本发明成功制备的负载抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体，不仅能够靶向地携载抗癌药物姜黄素到达病灶，还能够起到药物缓释的作用，而且成功保留了抗癌药物姜黄素对癌细胞的作用，对癌细胞具有很好的抑制作用和疗效。

本发明具有以下有益效果：

本发明将天然抗癌药物姜黄素通过化学反应连接到能够定植于肠道对人体有益的益生菌凝结芽孢杆菌芽孢的外层衣壳蛋白上，同时CUR-Spore载体再连上叶酸，成功构建了一种靶向药物载体(CUR-Spore-FA)，减少了治疗结肠癌药物的毒副作用，并且具有靶向性。

同时，该载体药物中凝结芽孢杆菌对于抗癌药物姜黄素还有一种保护作用，使其能够耐受胃酸顺利地通过胃，定植于肠并在肠道萌发释放姜黄素来治疗结肠癌，该载体能很好的应用于结肠癌的治疗，为提高天然抗癌药物-姜黄素的利用率，建立抗癌药物的靶向输送系统及应用于结肠癌的治疗打下坚实的基础，为结肠癌的治疗提供了一种新的方式。

附图说明

图1为CUR-Spore和CUR-Spore-FA制备的示意图。

图2为姜黄素的标准曲线。

图3为利用傅立叶转换红外光谱仪对相应反应物和产物表征的红外谱图(FTIR)；A芽孢(Spore)，B姜黄素(Curcumin)，C芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

图4为利用拉曼光谱仪对相应反应物和产物的拉曼图谱；A芽孢(Spore)，B姜黄素(Curcumin)，C芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

图5为扫描电镜图；A芽孢(Spore)，B姜黄素(Curcumin)，C芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

图6为姜黄素的装载率和在模拟胃肠液中的释放图；A为益生菌芽孢负载姜黄素的装载率；B为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃肠液中释放液的直观图；C为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃液中24h释放图；D为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟肠液中24h释放图。

图7为芽孢活性鉴定图；A为凝结芽孢杆菌Spore的涂布平板；B为CUR-Spore载体涂布的平板；C为CUR-Spore-FA载体涂布的平板。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用到的主要试剂有：姜黄素，二氯甲烷，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，N，N一二环已基碳二亚胺(DCC)，胃蛋白酶，无水乙醇，均购自达速生物科技有限公司。胰酶为GIBCOBRL公司产品。芽孢获得自华南师范大学生命科学学院关燕清教授实验室培养。

以下实施例中所用到的主要仪器有：德国LEO公司场发射扫描电镜:LEO1530VP，Sigma32184高速冷冻离心机，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅，摇床，超声分散仪，紫外分光光度计，制冰机等。

实施例1负载天然抗癌药物姜黄素的益生菌叶酸靶向载体的制备

CUR-Spore和CUR-Spore-FA制备的示意图如附图1所示。

1、姜黄素-益生菌载体(CUR-Spore)的制备

利用姜黄素结构上的羟基和凝结芽孢杆菌芽孢外壳蛋白的羧基发生酯化反应构建姜黄素益生菌载体。具体反应如下：

(1)将0.4g凝结芽孢杆菌芽孢粉加入50ml烧杯中，取20ml二氯甲烷加入，冰盐浴至0℃。

(2)加入0.1g姜黄素，30mgDMAP和30mgN，N一二环已基碳二亚胺(DCC)，超声震荡均匀，冰水浴继续反应24h。

(3)10000rpm离心10分钟，收集姜黄素-益生菌载体，无水乙醇和蒸馏水分别洗涤3次洗去未反应的姜黄素真空干燥即得到了CUR-Spore的载体。

2、姜黄素-益生菌-叶酸靶向载体(CUR-Spore-FA)的制备

凝结芽孢杆菌与姜黄素的连接载体上的羟基与叶酸中的羧基通过酯化反应，将叶酸连接到芽孢外壳蛋白的蛋白中。具体反应如下：

(1)将上述0.1g姜黄素益生菌载体加入50ml烧杯中，取20ml二氯甲烷加入，冰盐浴至0℃。

(2)加入0.4g叶酸，30mgDMAP和30mgN，N一二环已基碳二亚胺(DCC)，超声震荡均匀，冰水浴继续反应24h。

(3)离心洗涤除去未反应的叶酸，并冷冻干燥即为CUR-Spore-FA。

实施例2载体CUR-Spore-FA的表征

1、姜黄素的标准曲线如附图2所示。

通过紫外分光光度法在420nm处测量不同浓度的姜黄素溶液吸光值，从而得出了图2的标准曲线，图2的R²＝0.997达到了0.99级以上因此这条标准是可以用的。但标准曲线的使用范围是0～5.5μg/ml。

2、红外光谱检测

(1)将Spore，CUR-Spore，CUR-Spore-FA进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。

(2)红外图谱(FTIR)如附图3所示，图中A为芽孢(Spore)，B为姜黄素(Curcumin)，C为芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D为芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

谱图A在3434.18处有强吸收峰代表-OH；在1648.69处有强吸收峰，代表-C＝O，芽孢中就有这些基团。B中有姜黄素的特征基团β二酮键。A，C，D相比较C中-OH和-C＝O的量增多并且C中有β二酮键，说明C中有姜黄素连上。因为姜黄素上有酚羟基，羰基和β二酮键。因为酯化反应发生在苯环处，而D与C相比较821.50，893.47等处多出的峰是苯环取代的位置说明有叶酸连上。

3、拉曼光谱检测

将Spore，CUR-Spore，CUR-Spore-FA进行干燥处理，然后分别取适量的样品于载玻片上，上机检测。

拉曼图谱如附图4所示，图中A为芽孢(Spore)，B为姜黄素(Curcumin)，C为芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D为芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

谱图A在2200处有强吸收峰代表-COOH，在1650处有吸收峰代表酯类芽孢中都有这些基团，说明A是芽孢。图谱B在1628处有姜黄素的特征基团β二酮键，证明B图就是反应物姜黄素。图谱C芽孢上的羧基基团消失了，出现了酯键可能是芽孢与姜黄素反应了，因此CUR-Spore载体构建是成功的。图谱D上有姜黄素的特征基团β二酮键，证明有姜黄素连接上。

4、扫描电镜图如附图5所示，图中A为芽孢(Spore)，B为姜黄素(Curcumin)，C为芽孢-姜黄素(CUR-Spore)，D为芽孢-姜黄素-叶酸(CUR-Spore-FA)。

可以看出芽孢为杆状的且大小为μm级的；C图中可以看出芽孢上有颗粒状的姜黄素连上；D图芽孢-姜黄素-叶酸的扫描电镜图可以看到芽孢结构不太完整了，我们猜想可能是离心的次数比较多破坏了芽孢的完整性，为了验证芽孢连接上姜黄素和叶酸后是否还有活性我们对这些样品涂布平板观察芽孢萌发情况。发现平板上还是有芽孢萌发的说明连接上姜黄素和叶酸后芽孢还是有活性的。

实施例3载体CUR-Spore-FA中益生菌芽孢负载的姜黄素装载率及在模拟胃肠液中的释放

1、益生菌芽孢负载的姜黄素装载率的测定

紫外分光光度计检测：查阅文献得知姜黄素的特征吸收峰为426nm

(1)绘制姜黄素的标准曲线具体步骤如下：

①姜黄素储备液的配制

准确称取姜黄素1mg置于烧杯中，加适量无水乙醇溶解后，转移至10mL的容量瓶中，再用无水乙醇定容至刻度，作为姜黄素储备液备用。

②分别从储备液中量取0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mL分别置于9个10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。以无水乙醇为空白对照，在420nm处测定吸光度，并以每一浓度三次吸光度的平均值(A)为纵坐标，浓度(c)为横坐标，绘制校准曲线。

(2)益生菌芽孢负载的姜黄素装载率的测定

①制备CUR-Spore前姜黄素在溶液中的浓度可以根据姜黄素的量(W)、溶液的浓度(V)，通过公式计算装载前姜黄素的浓度(W1)＝W/V×100％.

②制备CUR-Spore反应后溶液(包括离心洗涤的溶液)可以测定其在420nm处的吸光值，根据标准曲线计算出溶液中姜黄素的浓度(W2)。

③根据公式(DG)＝(W1-W2)/W1×100％计算姜黄素的装载率

2、益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃肠液中的释放测定

(1)人工模拟胃液的配置

称取1.8ml浓HCl,加入2g胃蛋白酶和一定量的水，充分溶解后调节PH值至1.3定容200ml，即为人工模拟胃液^[21]。

(2)人工模拟肠液的配置

称取1.36gKH₂PO₄溶于约200ml水中，另称取2g胰蛋白酶加水溶解，定容至200ml，NaOH调节PH至7.6，即为人工模拟肠液。

(3)益生菌芽孢负载的姜黄素释放率的测定

将一定量的Spore和CUR-Spore-FA分别加入到模拟胃肠液中，每隔两小时分别测定溶液420nm处的吸光值，绘制益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃肠液中的释放图，确定释放规律及其最佳释放时间。Spore在模拟胃肠液中的释放作为对照。

3、实验结果

姜黄素的装载率和在模拟胃肠液中的释放图如附图6所示，图中，A为益生菌芽孢负载姜黄素的装载率；B为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃肠液中释放液的直观图；C为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟胃液中24h释放图；D为益生菌芽孢负载的姜黄素在模拟肠液中24h释放图。

图6中的A图为利用分光光度法测定姜黄素的装载率，测定反应前后溶液在420nm处的吸光值通过姜黄素的标准曲线计算出姜黄素的浓度；测定了四次装载率通过计算平均值与误差线绘制A图，其中W1代表接枝前姜黄素的浓度，W2代表接枝后姜黄素在溶液中的浓度因此姜黄素的装载率应该是DG＝(W1-W2)/W1×100％。图A表明姜黄素的装载率高达98.17％，并且误差较小，说明姜黄素的连接是十分成功的。

图6中的B图为益生菌芽孢负载姜黄素在模拟胃肠液中释放液的直观图，其中a₁表示单纯的芽孢(Spore)在模拟胃液中的释放图，a₂表示单纯的芽孢(Spore)在模拟肠液中的释放图；b₁表示(CUR-Spore)载体在模拟胃液中的释放图，b₂表示(CUR-Spore)载体在模拟肠液中的释放图；c₁表示(CUR-Spore--FA)在模拟胃液中的释放图，c₂表示(CUR-Spore--FA)在模拟胃液中的释放图。因为姜黄素在肠液中释放是黄色的液体，对比a₁，a₂，b₁，b₂，c₁，c₂模拟胃肠液中的释放图可以直观的看出b₂，c₂明显比b₁，c₁黄。即CUR-Spore和CUR-Spore-FA在模拟肠液中的释放率远远高于模拟胃液；Spore作为对照。因此可以直观的看出姜黄素在模拟肠液中的释放率远高于模拟胃液。

图6中的C图为益生菌芽孢负载姜黄素在模拟胃液中24h的释放图，其中a为CUR-Spore载体在模拟胃液中的释放图，b为Spore在模拟胃液中的释放图作为对照，排除芽孢在模拟胃液中释放液与姜黄素相似的干扰；D图为姜黄素在模拟肠液中24h的释放图，其中a为CUR-Spore载体在模拟肠液中的释放图，b为Spore在模拟肠液液中的释放图作为对照。C，D图比较可以明显的看出姜黄素在模拟肠液中的释放要远远高于在胃液中并且可以排除芽孢的影响。从D图中可以看出姜黄素在8h的释放率最高且一到八小时都是平稳的释放。其中，到八小时以后在模拟肠液中姜黄素的量有些减少，原因是芽孢表面凸凹不平随着芽孢的萌发量增多吸附了释放的姜黄素使姜黄素的吸光值降低。整体来看，姜黄素在肠液中释放是比较平稳的，具有一定的缓释效果。

实施例4载体CUR-Spore-FA中芽孢活性的鉴定

1、为了验证连接上姜黄素和叶酸后CUR-Spore和GUR-Spore-FA载体上的芽孢是否还有活性我们做了微生物的平板涂布实验，具体步骤如下：

(1)配置牛肉膏蛋白胨培养基配方如下：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂25g/L、调节PH至7～7.4。

(2)分别秤取1mg的Spore，CUR-Spore，CUR-Spore-FA，并将Spore用无菌水稀释10¹¹倍，将CUR-Spore和CUR-Spore-FA分别用无菌水稀释10⁸倍，然后用涂布牛肉膏蛋白胨平板。

(3)将平板倒置放在37℃恒温培养箱中，培养过夜第二天观察芽孢的萌发情况并拍照。

2、芽孢活性鉴定图如附图7所示，图中，A为凝结芽孢杆菌Spore的涂布平板；B为CUR-Spore载体涂布的平板；C为CUR-Spore-FA载体涂布的平板。

图7中，A图是Spore在牛肉高蛋白胨平板上的萌发情况，可以看出虽然已经稀释了10¹¹倍，但还是有许多芽孢萌发；B图是CUR-Spore在牛肉膏蛋白胨平板上的萌发情况，虽然稀释了10⁸倍，但还有较多的芽孢萌发；C图是CUR-Spore-FA在牛肉膏蛋白胨平板上的萌发情况，稀释了10⁸倍后仍有芽孢萌发。

由图7中B，C可以明显地看出连接上姜黄素和叶酸后CUR-Spore和CUR-Spore-FA载体上的芽孢仍然具有活性。虽然CUR-Spore-FA载体上芽孢数目有所减少，但还是有大量的芽孢具有活性，可以通过芽孢的萌发将抗癌药物姜黄素释放最终达到治疗结肠癌的效果。