一种基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂及其制备方法和应用，该造影剂由牛血清白蛋白和纳米铂颗粒组成，其特征在于，纳米铂颗粒被牛血清白蛋白包裹，所述造影剂的颗粒直径为1～10nm。与传统临床应用的碘基小分子造影剂相比，基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂具有如下特点：拥有更高的X射线吸收系数；该牛血清白蛋白包裹的纳米铂颗粒具有良好的稳定性、水溶液分散性、生物相容性以及较长的血液停留时间；易于表面功能化修饰；以蛋白质为模板合成的仿生的纳米材料的反应在水溶液中进行，符合绿色合成的思想，能够在一定程度上减少对环境的污染。

说明书

技术领域

本发明属于造影剂技术领域，具体涉及一种基于纳米PtBSA仿生材 料的CT造影剂及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的早期诊治疗是当今生物医学领域的研究热点和难点。分子 影像学融合了分子生物化学、数据处理纳米技术、图像处理等多项技术， 应用影像学方法对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定 量研究，通过图像直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程，从而无创 性地探究疾病早期的生物学变化、代谢高低、基因异常等，进而实现疾病 早期诊断、在体筛选活性药物以及直接、快速甚至实时评价治疗效果。因 其具有高特异性、高灵敏度和图像分辨率，因此今后能够真正为临床诊断 提供定性、定位、定量的资料。其中计算机断层扫描(CT)，作为一种先进 的无损伤检测技术是目前临床最常用的检测手段之一，与其它的检测技术 相比，其具有穿透力强、分辨率高、检测速度快、价格便宜、检测结果直 观、不需与被测物品接触等诸多优点。因此，自20世纪70年代被发明后， CT已经成为医学影像上一个重要的工具，其应用越来越广泛。

目前临床上广泛应用的CT造影剂是含碘小分子，例如碘普罗胺和碘海 醇等。然而由于其分子量小，在人体肾脏内能快速代谢，导致其在活体内 的血液循环时间相对较短，从而大大限制了其在特异性靶向成像技术和血 管造影术上的应用。虽然目前已经发展了更好和更新的低毒性和渗透性的 碘造影剂，但是仍然没有真正克服其低的X射线吸收系数以及不能进行靶 向修饰的特性。其它限制包括：(1)毒性：在某些情况下的肾毒性，肾功 能衰竭，过敏性休克；(2)高渗透压和粘度也可引起某些不良毒副作用； (3)碘较低的分子量使其具有较低的X射线吸收数，从而限制了其灵敏度 的提高。

近年来，基于纳米材料的CT造影剂受到了研究者的广泛关注。自2004 年以来，大部分的基于无机纳米粒子作为CT成像剂的研究都是关于金、银、 铂、铋以及钆等纳米粒子或者其复合物。其中铂纳米粒子不仅稳定，而且 具有化学惰性，同时其在自组装、量子尺寸效应以及催化和生物应用方面 具有良好的性质。铂纳米粒子用于医疗诊断和X射线CT成像剂，总结为 以下几点：(1)与常规的CT造影剂相比拥有更高的X射线吸收系数；(2) 易于表面功能化修饰，例如可以修饰抗体靶向肿瘤；(3)无毒且生物相容 性良好。基于以上所述，本发明借鉴生物矿化的原理，以牛血清白蛋白 (BSA)为生物模板，硼氢化钠为还原剂，通过生物仿生合成方法一锅法 得到核壳型仿生纳米铂复合材料(PtBSA)。所应用的生物模板牛血清白 蛋白(BSA)是一种球状蛋白，在生物体血清中大量存在，被广泛运用于 纳米生物技术中，如聚合酶链式反应(PCR)、分子影像、药物递送、分子 自组装以及金属纳米粒子的辅助合成等。研究发现，牛血清白蛋白结合的 量子点表示出良好的稳定能力，能够有效地阻止絮凝作用的发生，并增加 量子产率和降低细胞毒性。

发明内容

本发明旨在提供一种基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影 剂及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：

一种基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂，由牛血清白 蛋白(BSA)和纳米铂颗粒组成，其特征在于，纳米铂颗粒被牛 血清白蛋白(BSA)包裹，所述造影剂的颗粒直径为1～10nm。

上述基于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂的制备方法， 包括以下步骤：

(1)将牛血清白蛋白(BSA)配制成溶液，加入氯铂酸 (H₂PtCl₆·6H₂O)溶液，搅拌5-30min；

(2)将硼氢化钠(NaBH₄)配制成溶液，并置于冰浴中；

(3)将硼氢化钠(NaBH₄)溶液加入到牛血清白蛋白(BSA) 和氯铂酸溶液中，搅拌0.5-6h；

(4)透析，冷冻干燥处理，得到牛血清白蛋白包裹的纳米铂 颗粒固体粉末。

所述氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O)和牛血清白蛋白(BSA)的摩尔 比为25:1-200:1；

所述硼氢化钠(NaBH₄)和氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O)中铂的摩 尔比为2:1-6:1。

本发明制备得到的牛血清白蛋白包裹的纳米铂颗粒具有良好 的稳定性、水溶液分散性以及生物相容性，显示良好的CT成像效 果，具有优异的体内血管成像以及向体外肿瘤CT造影效果(例如 肺癌细胞成像)，因此，具有潜在的CT造影应用前景。

本发明合成的PtBSA纳米颗粒正是由BSA包裹的铂纳米粒子组装 体，与传统临床用碘剂相比具有更高的X射线吸收系数、良好的生物相容 性并易修饰连接大量靶向基团等特点。纳米颗粒外部由BSA分子包裹，使 得该材料具有良好的生物相容性，而且基于BSA分子本身具备的丰富官能 团(如氨基、羧基、羟基等)，其也可作为多功能界面，用于靶向分子的 特定修饰。此外，如今用绿色仿生的方法合成纳米材料受到了广泛的关注， 具有巨大潜在的应用前景。用蛋白质为作为模板合成纳米材料具有诸多优 点，诸如其具有良好的生物安全性及稳定性，适用于生物成像研究。总之， 本发明方法简单易行，而且利用牛血清白蛋白作为模板用于铂纳米材料的 合成，其具有一些明显的优势。首先，材料的合成是在水溶液中进行，过 程没有使用有机溶剂，从一定程度上可以降低对环境的污染。其次，牛血 清白蛋白蛋白质作为一种生物相容性好的大分子，利用其作为模板合成的 纳米结构材料具有良好的生物相容性和高的生物安全性，而且易于表面修 饰，使其在生物医学成像领域有着广泛的应用潜力。

与传统临床应用的碘基小分子造影剂(如碘普罗胺和碘海醇)相比，基 于纳米PtBSA仿生材料的CT造影剂具有如下特点：

1.拥有更高的X射线吸收系数。高的X射线衰减系数意味着在较低剂 量水平有着更高的对比增强。

2.该牛血清白蛋白包裹的纳米铂颗粒具有良好的稳定性、水溶液分散 性、生物相容性以及较长的血液停留时间。对于静脉内给药，任何X射线 造影剂必须具有高的水溶液分散性。本造影剂在静脉注射之后其化学性质 以及药代动力学性质优良，而且具有优异的体内血管成像以及向体外肿瘤 CT造影效果(例如肺癌细胞成像)。

3.易于表面功能化修饰。本造影剂外部由BSA分子包裹，使得该材料 具有良好的生物相容性，而且基于BSA分子本身具备的丰富官能团(如氨 基、羧基、羟基等)，其也可作为多功能界面，用于靶向分子的特定修饰， 从而进行体内外肿瘤的靶向成像。

4.以蛋白质为模板合成的仿生的纳米材料的反应在水溶液中进行，符合 绿色合成的思想，能够在一定程度上减少对环境的污染。

附图说明

图1中，纳米PtBSA仿生材料的透射电镜(a)和(c)，粒径分 布图(b)以及紫外吸收图(d)。

图2显示纳米PtBSA仿生材料的细胞毒性测试结果。

图3中，纳米PtBSA仿生材料与碘普罗胺的CT造影图片(a) 和相应的CT值(b)，其中1为纳米PtBSA仿生材料，2为碘普罗 胺。

具体实施方式

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。

实施例：

(1)实验试剂

99％冻干的牛血清白蛋白(BSA，分子量～66.4kDa)、二甲基亚砜 (DMSO)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购 买自Sigma-Aldrich公司。胎牛血清(FBS)，1640细胞培养基购自上海柏 汇申生物科技有限公司。六水合氯铂酸(H₂PtCl₆·6H₂O)，硼氢化钠(NaBH₄)， 无水乙醇(CH₃CH₂OH)等其它市售化学纯试剂均购自上海化学试剂公司。 A549细胞由中科院上海细胞所提供。实验所用水为去离子水(18.2MΩ)。

(2)纳米PtBSA仿生材料的制备

利用冻干的牛血清白蛋白与去离子水配制30mL浓度为26mg/mL的 BSA溶液，在持续磁力搅拌下迅速加入30mL浓度为19.3mM的氯铂酸 溶液。继续搅拌10min后缓慢加入0.112gNaBH₄(溶解于2mL冰水)，剧 烈搅拌30min。接着将得到的产物透析8h，最后将最后的产物置于冷冻干 燥机中干燥。取适量制备得到的表面包裹牛血清蛋白的仿生纳米铂材料 (PtBSA)溶解于PBS中配成溶液，利用ICP精确定位其中铂含量，并 保存于4℃冰箱中待用。

图1为纳米PtBSA仿生材料的透射电镜，粒径分布图和紫外吸收图。 从图1可以看出本发明制备得到的纳米PtBSA仿生材料平均粒径为2nm 左右，而且在高倍镜下通过明暗差可以看出其表面被BSA所包裹。紫外吸 收光谱中，280nm左右的吸收峰为BSA的特征吸收，进一步证明了铂纳米 颗粒被BSA所包裹。

(3)纳米PtBSA仿生材料的生物安全性研究

MTT分析法被用来研究仿生纳米金材料的生物相容性。首先在两个96 孔细胞培养板的每个孔中接种8000个A549细胞，在37℃，5％CO2条件 下孵育过夜，此时细胞处于生长良好的对数期。然后弃掉旧的培养基，每 孔重新加入含不同浓度铂的的完全培养基(浓度梯度为0、0.01、0.05、0.1、 0.3、0.6、1.2、2.5mM)100μL，常规培养24h和48h。同时设4个复孔以 及空白对照组。终止培养后，将上清弃掉，每孔加入100μL1mg/mLMTT 溶液，37℃孵育4h，再将上清弃掉，每孔加入100μLDMSO，37℃摇床 10min后用酶联免疫检测仪测490nm处各孔的吸光值(OD值)，数据处 理后得到细胞存活率与孵育浓度间的关系图。

图2为A549细胞分别与不同浓度PtBSA孵育24小时和48小时后 细胞的存活率，未处理的细胞作为对比。本发明用MTT法检测与仿生纳米 铂材料作用后的A549细胞的活性，从而评价仿生纳米铂材料的生物安全 性。结果表明仿生纳米铂材料对A549细胞存活率影响不大，即使在最大浓 度2.5mM时细胞存活率仍然保持在80％左右。然而有趣的是，我们发现当 细胞与材料共孵育48h后细胞的存活率与孵育24h相比反而升高，这可能 是因为BSA为细胞生长提供了一个良好的界面。MTT结果表明本发明所涉 及的仿生纳米铂材料对A549细胞毒性小，生物相容性好，在生物医学成像 方面具有潜在应用价值。实验也显示本发明涉及的纳米PtBSA仿生材料 在水、1640培养基和PBS缓冲溶液(pH7.4)中均具有良好的分散性。

(4)纳米PtBSA仿生材料的CT成像性能研究

将PtBSA分散于PBS溶液中，配制成不同浓度梯度仿生纳米铂材料 的PBS溶液，控制每个浓度组的含铂量依次为：0、1、2、3、6和12mM， 分别置于1.5mLEP管中待用。

使用GE公司宝石CT(DiscoveryCT750HD，Milwaukee，USA)进行 扫描，测试不同浓度下的PBS溶液的CT成像效果。选择FOV＝25.0cm， 层厚＝0.625mm，扫描模式，球管的管电压120kVp，毫安固定设置，扫描 的6组图像上选定相同层面，选取相同大小的感兴趣区，测量感兴趣区的 CT值。图像利用GSIViewer浏览器处理。图3为纳米PtBSA仿生材料 与碘普罗胺的CT造影成像对比图，从图中可以看出本发明所涉及的纳米 PtBSA仿生材料CT成像效果远远高于临床常用碘剂碘普罗胺，当摩尔浓 度均为12mM时，纳米PtBSA仿生材料的成像效果接近碘剂碘普罗胺的 3倍。并且制备的纳米PtBSA仿生材料作为CT造影剂具有优异的体外 肿瘤CT造影效果(例如肺癌细胞成像)和体内血管成像效果，在生物医学 影像领域具有潜在的应用前景。