锌离子载体Pyrithione在防治猪蓝耳病中的应用

摘要

本发明公开了锌离子载体Pyrithione（PT）在制备抗PRRSV病毒药物中的应用，以及其在制备防治猪蓝耳病的药物中的应用。所述锌离子载体PT的结构式如式（I）所示：

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及锌离子载体Pyrithione在防治猪 蓝耳病中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome， PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive andrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起，于1987年最早出现在美国，随后在欧洲出 现报道。我国于1996年由郭宝清等首次分离到PRRSV，将分离毒株命名为CH-1a，证实了该病 在我国存在。早在1992年，世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties， OIE）就将该病列为B类传染病。目前，PRRS是养猪业中最重要的传染病之一，在全球对养猪 业造成巨大的经济损失。2005年，PRRS对美国养猪业造成的经济损失高达56,000万美元，而 现在，每年损失估计将高达66,400万美元。PRRS几乎分布在所有的养猪国家。猪感染PRRSV 后，一般会继发细菌如副猪嗜血杆菌、链球菌等感染。在临床上，PRRS与猪圆环病毒2型 （Porcinecircovirustype2，PCV-2）混合感染病例较多。2006年，我国大部分省份及越南 爆发了猪高热病（Porcinehighfeversyndrome，PHFS），给养猪业造成了巨大的经济损 失，此病是由变异的PRRSV引起，命名为高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，HP-PRRSV）。HP- PRRSV特征为高热、高致病性及高死亡率。目前，农业部已将该病列入重大动物疫病强制免 疫计划。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方 面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcine alveolarmacrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而 引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一 个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒 株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的 PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保 护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性 增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒 的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血 症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合 感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上 加难。

目前，PRRSV防控主要有灭活疫苗和弱毒疫苗，临床上用的较多的是弱毒疫苗。其 中灭活疫苗有如下缺点：（1）需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种； （2）不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；（3）产生完全免疫力需要2～3周，不利于紧 急预防接种与降低疫苗费用；（4）存在灭活不彻底和散毒的可能。

而弱毒疫苗存在毒力返强、重组、潜在感染的危险。更重要的是，目前PRRSV毒株较 多，针对一种毒株弱毒苗对其他毒株无交叉保护力。且有文献报道PRRSV弱毒疫苗使用加快 病毒变异，有些发病猪场甚至分离到与疫苗毒株同源性非常高的野毒，提示弱毒疫苗暴露 出越来越多的问题。因此，研制新型抗PRRSV药物迫在眉睫。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术和药物的缺陷与不足，提 供一种新型物质——锌离子载体Pyrithione（PT）在防治猪蓝耳病方面的应用。所述锌离子 载体PT对PRRSV有很好的抗病毒作用，尤其是针对高致病型毒株HP-PRRSV具有显著的抗病 毒作用，故在猪蓝耳病的防治方面具有很好的应用前景。

本发明的目的是提供锌离子载体Pyrithione在制备抗PRRSV药物中的应用，尤其 是抗HP-PRRSV药物中的应用。

本发明另一目的是提供锌离子载体Pyrithione在制备防治猪蓝耳病的药物中的 应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了锌离子载体Pyrithione在制备抗PRRSV病毒的药物中的应用。

所述锌离子载体Pyrithione的结构式如下式（I）所示：

。

优选地，所述PRRSV为高致病性猪蓝耳病病毒HP-PRRSV。

本发明还公开了锌离子载体Pyrithione在制备预防和/或治疗猪蓝耳病的药物中 的应用。

优选地，所述猪蓝耳病是由高致病性猪蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。

另外，优选地，所述锌离子载体PT的使用剂量范围为10～30μg/ml。

更优选地，所述锌离子载体PT的使用剂量范围为10～20μg/ml。

另外，包含有效量的锌离子载体Pyrithione的抗PRRSV病毒药物，以及包括有效量 的锌离子载体Pyrithione的防治猪蓝耳病的药物，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述PRRSV为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。

优选地，所述猪蓝耳病为由高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV引起的猪蓝耳病。

优选地，所述药物中还包含有效量的胎牛血清。

更优选地，所述胎牛血清占药物总量的比例为1～20%。

更优选地，所述药物中锌离子载体Pyrithione和胎牛血清的比例为1～3：4。

更优选地，所述药物中锌离子载体Pyrithione和胎牛血清的比例为1：2。

另外，上述药物的制剂剂型可以为本领域可实现的任意剂型。

优选地，上述药物的剂型为注射制剂或口服制剂。

更优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。

更优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。

本发明经过大量的研究和探索，首次研究发现了PT对PRRSV病毒的抗病毒作用，尤 其是对HP-PRRSV有很好的抗病毒效果，对猪蓝耳病的治疗提供了一种新的药物和药物基 础。

同时，本发明还系统研究了PT对PRRSV的抗病毒机制。首先通过qRT-PCR、Western- Blot、细胞上清TCID₅₀检测及免疫荧光实验（IFA）等多种方法研究证实了PT在Marc-145细胞 水平对HP-PRRSV病毒有很好的抗病毒效果，并观察到PT能够明显提高胞内锌离子浓度；接 着在PRRSV自然宿主细胞PAMs上研究其对HP-PRRSV抗病毒作用；最后通过分析PT在Marc- 145和PAMs上对细胞因子表达影响，初步阐明其是否通过抑制NF-κB通路来抗PRRSV，为PT在 抗PRRSV上的应用和抗猪蓝耳病药物研究奠定了坚实的基础。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次研究发现了锌离子载体PT的抗PRRSV病毒作用，尤其是对HP-PRRSV有很好 的抗病毒效果，对猪蓝耳病的治疗提供了一种新的药物和药物基础，在猪蓝耳病的防治方 面具有很好的应用前景。

另外，本发明将PT应用于抗HP-PRRSV，有望成为一种新型的防治猪蓝耳病的药物， 为PT提供了一种新的应用。

本发明还通过多种方法验证了PT对HP-PRRSV的抗病毒作用，通过TCID₅₀、qRT-PCR、 IFA及Western-Blot等多种方法研究证实了PT在Marc-145细胞和PAMs细胞水平对PRRSV病 毒有很好的抗病毒效果，结果表明，PT能够显著性地降低N基因和N蛋白表达水平，且随着PT 浓度的升高，抑制效果更明显，尤其是对高致病型毒株HP-PRRSV仍然具有显著的抗病毒作 用，初步阐明其是否通过抑制NF-κB通路来抑制PRRSV复制，为PT的应用以及抗猪蓝耳病的 新型药物的研究奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为锌离子载体PT细胞毒性试验结果统计图。

图2为锌离子载体PT抗病毒试验，分别经不同浓度PT作用36h后，N基因相对于内 参GAPDH的表达水平图。

图3为锌离子载体PT抗病毒试验，分别经不同浓度PT处理后的HP-PRRSV感染的 Marc-145细胞上清中的病毒滴度图。

图4为锌离子载体PT抗病毒试验，经不同浓度PT处理36h后，N蛋白表达水平图。

图5为锌离子载体PT抗病毒间接免疫荧光试验检测PT抗病毒效果图。

图6为加入EDTA-Mg后锌离子载体PT抗病毒中N基因相对于内参GAPDH的表达水平 图。

图7为加与不加血清FBS对比锌离子载体PT抗病毒中N基因相对于内参GAPDH的表 达水平图。

图8为加与不加血清FBS对比锌离子载体PT抗病毒中N蛋白Western-Blot检测图。

图9为不同浓度锌离子载体PT促进锌离子进入胞内间接免疫荧光试验效果图。

图10锌离子载体PT不同时间点促进锌离子进入胞内间接免疫荧光试验效果图。

图11为锌离子载体PT在PRRSV自然宿主细胞PAMs上抗病毒中N基因相对于内参 HPRT1的表达水平图。

图12为锌离子载体PT在PRRSV自然宿主细胞PAMs上抗病毒中病毒滴度图。

图13为锌离子载体PT在PAMs细胞上对细胞因子IFN-α表达的影响。

图14为锌离子载体PT在PAMs细胞上对细胞因子IFN-β表达的影响。

图15为锌离子载体PT在PAMs细胞上对细胞因子TNF-α表达的影响。

图16为锌离子载体PT在PAMs细胞上对细胞因子IL-10表达的影响。

图17为锌离子载体PT在Marc-145细胞上对细胞因子TNF-α表达的影响。

图18为锌离子载体PT在Marc-145细胞上对细胞因子IL-6表达的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和 标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显 著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS16.0和GraphPadPrism5。

实施例1锌离子载体PT细胞毒性试验

1、实验材料

AlamarBlue（购自Invitrogen公司）作为活细胞代谢指示剂，在线粒体酶促还原反应下 会产生可测量的荧光代谢产物，通过测定其荧光强度可监测细胞活性。

2、试验方法：

用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养Marc-145细胞至60～70%，弃去培养液，加入含锌 离子载体PT的DMEM培养液作用36h，设定PBS对照组，然后加入10%（v/v）比例的 AlamarBlue继续培养3h，使用多功能酶标仪分别读取540nm激发光和590nm发射光荧光 值，制作锌离子载体PT细胞毒性图。以PBS对照组细胞活性作为100%，倍比稀释的锌离子载 体PT处理的细胞的荧光值比上PBS对照组荧光值即为不同浓度下锌离子载体PT相对细胞活 性。

3、结果如附图1所示：当锌离子载体PT浓度为60μg/ml以下时，其对Marc-145细胞 没有毒性，细胞活性100%。而即使当锌离子载体PT浓度大于60μg/ml，达到100μg/ml时，其对 细胞的毒性也非常小，细胞活性可达90%以上。

实施例2锌离子载体PT抗病毒试验

1、在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度70%时， 弃去培养液，PBS洗3次。以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续 培养5h。PBS洗3遍，分别将含有浓度为10、15、20μg/ml锌离子载体PT的2%胎牛血清的DMEM 培养液加入细胞37℃培养36h，并设对照组。收集细胞PBS洗3遍，每孔加700μlTrizol，提 RNA，做qRT-PCR检测。

结果如附图2所示：在转录水平上，在MOI=0.1的HP-PRRSV感染的Marc-145细胞，经 锌离子载体PT作用36h后，N基因相对于内参GAPDH的表达水平显著性地被锌离子载体PT抑 制，表明锌离子载体PT能够抑制HP-PRRSV基因组复制。

2、同上以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续培养5 h，PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20μg/ml锌离子载体PT的2%胎牛血清的DMEM培养液加入 细胞37℃培养36h，并设对照组，收集1ml上清做TCID₅₀检测。50%组织细胞感染量（50% Tissuecultureinfectiondose，TCID₅₀）是指能使半数单层细胞管（孔）出现细胞病变的 病毒稀释度。用此方法可以估计病毒感染性的强弱及病毒的含量。

TCID₅₀测定的具体方法是：取无菌EP管10支，各管分别加病毒稀释液0.9mL，然后 向第一管加病毒液0.1mL，反复混合3次，用另一新吸管从第一管内吸液0.1mL加入至第二 管内，反复混合3次，再换一新吸管，从第二管吸液0.1mL加入第三管内，反复混合3次。以此 类推将待测病毒液作连续10倍稀释，使病毒稀释度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7， 10^-8，10^-9，10^-10，10^-11等。吸弃微孔板各孔培养液，用灭菌PBS洗微孔板2次。用微量移液器将 每个稀释度病毒液依次对号加入各个微孔中，每孔0.1mL，细胞对照不加病毒液，置37℃ CO₂培养箱中培养3～4d，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。按Reed-Muench两氏法计算 病毒TCID₅₀。

结果如附图3所示：锌离子载体PT能够使上清中病毒滴度下降，且随着锌离子载体 PT浓度提高，抑制效果更明显，呈现浓度依赖性。表明锌离子载体PT能够降低病毒滴度，使 HP-PRRSV毒力下降。

3、另外，弃去剩余培养液，PBS洗3遍，0.25%胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度， Western-Blot检测。

结果如附图4所示：锌离子载体PT能够明显抑制HP-PRRSVN蛋白表达，且随着浓度 升高，抑制效果更明显，呈现浓度依赖性。表明锌离子载体PT能够明显抑制病毒蛋白表达。

4、在含10%胎牛血清的DMEM培养基的12孔板中，培养Marc-145细胞至细胞汇合度 70%时，弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37 ℃继续培养5h，PBS洗3遍，分别将包含浓度为10、15、20μg/ml锌离子载体PT的2%胎牛血清 的DMEM培养液加入细胞37℃培养36h，并设对照组，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10min，PBS 洗10min，10%Triton-100穿孔15min，PBS洗10min，然后用PBS稀释的1%BSA封闭30 min，加入抗PRRSVN蛋白一抗（1：200稀释）4℃孵育过夜，抗鼠二抗作用（1：1000稀释）1h， 用DAPI染料染核5min，PBS洗10min，然后IFA检测，在荧光显微镜下观察锌离子载体PT抗 病毒效果。

结果如附图5所示：锌离子载体PT能够明显抑制HP-PRRSVN蛋白表达，且随着浓度 升高，抑制效果更明显，荧光越来越弱，呈现剂量依赖性。进一步表明了锌离子载体PT能够 明显抑制病毒蛋白表达。

实施例3EDTA-Mg对锌离子载体PT抗HP-PRRSV作用的影响

1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛 血清的DMEM培养液中37℃继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20μg/ml锌离子载 体PT的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37℃培养36h，同时加入EDTA-Mg作用36h，并设 对照组。收集细胞，做qRT-PCR检测。

2、结果如附图6所示：当加入EDTA-Mg处理后，PT对N基因表达水平抑制较不加 EDTA-Mg减弱，即加入EDTA-Mg会抑制PT抗HP-PRRSV活性。这种作用可能由于EDTA竞争性螯 合锌离子，使其进入胞内减少，从而使PT抗HP-PRRSV活性减弱。

实施例4血清FBS对锌离子载体PT抗HP-PRRSV作用的影响

1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛 血清的DMEM培养液中37℃继续培养5h，PBS洗3遍，分别将浓度为10、15、20μg/ml锌离子载 体PT的2%胎牛血清的DMEM培养液加入细胞37℃培养36h，同时设立不加血清对照组。收集 细胞，做qRT-PCR和Western-Blot检测。

2、结果如附图7和8所示：与不加胎牛血清（FBS）对照组相比，加血清后PT对N基因 转录水平和蛋白水平抑制效果均更显著，即当培养基中有胎牛血清时，PT对HP-PRRSV抑制 效果更显著。这种作用可能由于血清中含有锌离子，PT使其进入胞内，从而使PT抗HP-PRRSV 活性增强。

实施例5锌离子载体PT促进锌离子进入胞内

1、在Marc-145细胞汇合度70%的6孔板用PBS洗3次，然后加入5μMFluoZin-3 acetoxymethylester(购自Invitrogen公司)在培养箱中培养15min；随后细胞继续在完 全培养基下培养1h（脱酯化反应）；接着加入10、15、20μg/mlPT分别培养0.5、1、1.5h，同 时设立EDTA-Mg和空白对照组。细胞固定后做IFA检测。

2、结果如附图9和10所示：不同浓度PT处理后，随着浓度升高，荧光越来越强，即进 入胞内锌离子浓度越高；经PT不同时间处理后，结果类似，而加入EDTA-Mg竞争性螯合锌离 子后，荧光减弱，即进入胞内锌离子减少。以上研究表明：锌离子载体PT能够促进锌离子进 入胞内。

实施例6锌离子载体PT在PRRSV天然宿主细胞PAMs上的抗病毒作用

1、用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（加双抗：青霉素和链霉素）培养PAMs细胞至60 ～70%，弃去培养液，PBS洗3次，将含HP-PRRSVMOI=0.1的RPMI-1640培养液加入细胞37℃继 续培养5h，PBS洗3遍，将含15μg/mlPT的RPMI-1640培养液加入细胞37℃培养24h，分别 收集细胞和细胞上清做qRT-PCR和TCID₅₀检测。

2、结果如附图11和12所示：在PRRSV天然宿主细胞PAMs上，锌离子载体PT都能够显 著地抑制HP-PRRSV复制。表明锌离子载体PT能够在细胞水平上抑制HP-PRRSV的复制。

实施例7锌离子载体PT在Marc-145和PAMs上对细胞因子影响

1、Marc-145细胞：在含10%胎牛血清的DMEM培养液的6孔板中培养至细胞汇合度70%时， 弃去培养液，PBS洗3次，以MOI=0.1接毒HP-PRRSV，在2%胎牛血清的DMEM培养液中37℃继续 培养18h，同时加入锌离子载体PT，同时设立阴性对照和不加任何处理的空白对照。

2、PAMs细胞：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液（加双抗）培养PAMs细胞至60～ 70%，弃去培养液，PBS洗3次，将含HP-PRRSVMOI=0.1的RPMI-1640培养液加入细胞37℃继续 培养18h，同时加入锌离子载体PT，同时设立阴性对照和不加任何处理的空白对照。

3、收集细胞对细胞因子IL-6、IL-10、IFN-α、IFN-β及TNF-α做qRT-PCR检测。

4、实验结果

在PAMs上，结果如附图13、14、15、16所示：锌离子载体PT+PRRSV处理组与PRRSV处理组 相比，锌离子载体PT+PRRSV处理组能够抑制IFN-α（图13）、IFN-β（图14）、TNF-α（图15）及IL- 10（图16）表达。

在Marc-145细胞上，结果如附图17、18所示：锌离子载体PT+PRRSV处理组与PRRSV 处理组相比，锌离子载体PT+PRRSV处理组能够抑制TNF-α（图17）及IL-6（图18）表达。

以上结果显示，锌离子载体PT通过抑制NF-κB介导的细胞因子上调来发挥抗病毒 作用，即PT通过干扰NF-κB信号通路激活来抑制PRRSV复制。

实施例8包含锌离子载体PT的药物

1、一种包含有效量的锌离子载体Pyrithione的药物，药物的剂型可以为注射制剂或口 服制剂。

该药物具有抗PRRSV病毒的作用，对高致病性猪蓝耳病病毒HP-PRRSV也有非常好 的抗病毒作用，能够预防和/或治疗猪蓝耳病。

2、进一步地，上述药物还可以包括胎牛血清，所述胎牛血清占药物总量的比例为1 ～20%，所述药物中锌离子载体Pyrithione和胎牛血清的比例为1～3：4（优选为1：2）。

添加胎牛血清后药物的抗病毒作用显著增强。