两种斑蝥酰亚胺二聚体衍生物的晶体结构、制备方法和用途

摘要

本发明涉及两种斑蝥酰亚胺二聚体衍生物的晶体结构、制备方法及部分性质。两种晶体外观均呈无色棒状结晶：第一种晶体熔点165.0‑166.0℃，分子式C

说明书

技术领域

本发明涉及药物化学和晶体学领域，具体为两种不饱和去甲基斑蝥酰亚胺二聚体 的晶体结构、制备方法和在抗癌药物领域的用途。

背景技术

作为一种典型的小分子蛋白磷酸酶（proteinphosphatase，PP）抑制剂,从1264 年开始，斑蝥素已经在世界范围内作为抗癌药物使用了，它对肝癌，胰腺癌，结肠癌，口腔 癌，膀胱癌，乳腺癌，肺癌，消化道肿瘤均有一定的治疗效果。值得注意的是，对常规药物产 生了抗药性的癌细胞仍能被斑蝥素杀死，这使得该类化合物成为治疗癌症的新希望。不难 理解，斑蝥素能杀死癌细胞的同时，对一些正常细胞也有毒性，尤其是胃肠道、尿道、肾脏处 的正常细胞，这阻碍了它们在医药领域的广泛应用。因此，设计合成毒性小并且能高效抑制 肿瘤细胞的斑蝥素衍生物具有重要的意义。一般认为，在斑蝥素核心的三环结构中，7号位 上的杂原子种类对其活性影响很大，该位氧原子换成其他任何原子都会降低其活性，而5,6 位上的双键对活性影响不大。如不饱和斑蝥素和斑蝥素具有类似的抑制PP2A的活性，不饱 和去甲基斑蝥素和去甲基斑蝥素具有相似的抑制PP1、PP2A和PP2B的活性。当然，也有人认 为5,6位上的化学键如果是双键会减弱对肿瘤的抑制，不过这种减弱不是特别明显。重要的 是，不饱和去甲基斑蝥素相对要容易合成的多，通过呋喃与马来酸酐发生D-A反应一步即可 完成，因此该步骤也往往成为合成去甲基斑蝥素及其衍生物的第一步。但是目前对于不饱 和去甲基斑蝥酰亚胺衍生物的抗癌活性研究相对较少。

另一方面，在天然产物中广泛存在的二聚体结构被普遍认为具有比相应的单体结 构更好的生物活性，具有二聚体结构的药物分子已被大量合成，并用于治疗癌症、艾滋病、 阿尔茨海默病、疟疾和各种寄生虫病。但是基于斑蝥酰亚胺的二聚体种类非常少，这与大量 斑蝥素衍生物的广泛研究极不相称。值得注意的是，在屈指可数的斑蝥酰亚胺二聚体衍生 物中，未见一种该类化合物的晶体结构被报道。研究发现，大部分(>90%)小分子药物都以晶 体状态入药，并且当前市场上有至少一半的固态化学药物存在多晶型问题，所以确定药物 分子的晶体结构意义重大。同时，在药物化学中，全面可靠的分子结构对确定其与生物靶点 间的关键作用点具有重要意义。这些都需要确定药物分子的晶体结构。斑蝥酰亚胺二聚体 至今未见一例晶体结构被报道，说明其结晶困难，这对进一步设计基于斑蝥酰亚胺的药物 分子并确定其构效关系是一个短板。

发明内容

本发明的内容是通过多种方法制备得到了两种不饱和去甲基斑蝥酰亚胺二聚体 晶体，这两种二聚体晶体的结构及有关参数如下。

第一种是丁二胺连接的不饱和去甲基斑蝥酰亚胺二聚体晶体，该晶体外观呈无色 棒状，熔点165.0-166.0℃，分子式C₂₀H₂₀N₂O₆，分子量为384.38，化学名为：2,2'-(丁烷-1,4- 二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚-1,3-二酮)，英文系统命名为：2,2'- (1,4-butanediyl)bis(3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-epoxy-1,3-bishydroisoindole-1,3- dione)，其结构如下。

。

元素分析表明，该二聚体C、H、N的百分含量分别为62.57%、5.31%和7.33%（按分子 式C₂₀H₂₀N₂O₆计算的理论值分别为62.49%、5.24%和7.29%）；单晶结构分析表明，其结晶为单 斜晶系，P2₁/c空间群，a=11.362(3)?，b=5.8986(17)?，c=13.186(4)?，α=γ=90°，β= 98.318(4)°，V=874.4(4)?³，Z=2，有关的¹HNMR谱、¹³CNMR谱分别见附图1、附图2；附图3、 附图4分别是该化合物的热椭球晶体结构图和晶体结构堆积图。

第二种是己二胺连接的不饱和去甲基斑蝥酰亚胺二聚体晶体，该晶体外观同样呈 无色棒状，熔点158.8-159.4℃，分子式C₂₂H₂₄N₂O₆，分子量为412.43，化学名为：2,2'-(己烷- 1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚-1,3-二酮)，英文系统命名为： 2,2'-(1,6-hexanediyl)bis(3a,4,7,7a-hexahydro-4,7-epoxy-1,3-bishydroisoindole- 1,3-dione)，其结构如下。

。

元素分析表明，该二聚体C、H、N的百分含量分别为64.15%、5.91%和6.83%（按分子 式C₂₂H₂₄N₂O₆计算的理论值分别为64.07%、5.87%和6.79%）；单晶结构分析表明，其结晶为单 斜晶系，P2₁/n空间群，a=5.246(3)?，b=28.643(17)?，c=6.546(4)?，α=γ=90°，β= 94.401(10)°，V=980.8(10)?³，Z=2，有关的¹HNMR谱、¹³CNMR谱、热椭球晶体结构图和晶体 结构堆积图分别见附图5、附图6、附图7和附图8。

这两种二聚体晶体均有三种合成方法：方法一是以不饱和去甲基斑蝥素和丁二胺 （或己二胺）为原料，步骤如下。

将不饱和去甲基斑蝥素和丁二胺（或己二胺）分别溶于合适的有机溶剂后，按照一 定的物质的量之比混合，在一定温度下搅拌反应一定时间，得到白色粉末状固体，挥发浓缩 溶液，过滤，粉末状固体用合适的溶剂洗涤，然后通过合适的溶剂重结晶，得无色棒状晶体， 即为目标产物晶体。

方法二是以不饱和去甲基斑蝥酰亚胺和1,4-二溴丁烷（或1,6-二溴己烷）为原料， 步骤如下。

将不饱和去甲基斑蝥酰亚胺和1,4-二溴丁烷（或1,6-二溴己烷）溶于合适的有机 溶剂后，按照一定的物质的量之比混合，在一定温度下搅拌反应一定时间，得到白色粉末状 固体，挥发浓缩溶液，过滤，粉末状固体用合适的溶剂洗涤，然后通过合适的溶剂重结晶，得 无色棒状晶体，即为目标产物晶体。

方法三是以1,1’-(丁烷-1,4-二基)-二(1H-吡咯-2,5-二酮)[或1,1’-(己烷-1, 6-二基)-二(1H-吡咯-2,5-二酮)]与呋喃为原料，步骤如下。

将1,1’-(丁烷-1,4-二基)-二(1H-吡咯-2,5-二酮)[或1,1’-(己烷-1,6-二基)- 二(1H-吡咯-2,5-二酮)]溶于合适的有机溶剂后，按照一定的物质的量之比加入呋喃，在一 定温度下搅拌反应或静置一定时间，得到白色粉末状固体，挥发浓缩溶液，过滤，粉末状固 体用合适的溶剂洗涤，然后通过合适的溶剂重结晶，得无色棒状晶体，即为目标产物晶体。

以上三种方法的区别在于反应物不同，但反应物的摩尔比均介于4:1与1:4之间。

以上三种方法中的有机溶剂（反应、洗涤、重结晶用溶剂）选自：甲醇、乙醇、乙腈、 二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）等。

优选的,所述反应温度和重结晶温度为常温或加热，反应方法为搅拌或静置，重结 晶方法为静置状态下自然挥发。

优选的，所述反应时间和重结晶时间选自：2小时－3天。

本发明的有益效果是：能够以比较简单的步骤和反应物合成比较复杂的药物分子 材料。

体外抗肿瘤活性测试。

将处于对数期生长的A549肺癌细胞，4T₁乳腺癌细胞和CT-26结肠癌细胞，分别用 0.25%胰酶消化细胞，使其成为单细胞，分别用含10%胎牛血清的F12K培养液制成浓度为 1.25×10⁷个/L的单细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔200μL（每孔2.5×10³个细 胞）。将96孔细胞培养板置于CO₂培养箱中，在37℃，5%CO₂条件下，培养48h。

当孔内细胞长满（90%满即可）时，按实验分组加入不同剂量的本斑蝥酰亚胺二聚 体溶液（200μL/孔），使待测化合物的终浓度分别为5μM、10μM、30μM、50μM、100μM，150μM，200 μM，250μM，300μM，每组设3个复孔，培养96h。

各个孔中分别加入20μL浓度为0.5g/L的MTT，继续培养4h，使MTT还原为甲瓒 （Formazan）。吸出全部上清液后，每孔加入200μL的DMSO，震摇15min，使甲瓒充分溶解后，运 用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度（OD值）。然后按照下式进行计算。

细胞抑制率%=（对照组OD值-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

测试结果表明，第一种二聚体晶型[即2,2'-(丁烷-1,4-二基)二(3a,4,7,7a-四 氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚-1,3-二酮)]对肺癌细胞A549、乳腺癌细胞4T₁和结肠癌细胞 CT-26的IC50（药物的半数抑制浓度）分别为262.0μM、256.0μM、229.0μM；第二种二聚体晶型 [即2,2'-(己烷-1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚-1,3-二酮)] 对肺癌细胞A549、乳腺癌细胞4T₁和结肠癌细胞CT-26的IC50分别为234.0μM、226.0μM、 205.0μM；这表明这两种斑蝥酰亚胺二聚体晶型对三种癌细胞均具有温和的抑制效果。

具体实施方式。

为了更好的理解本发明内容，下面通过三个具体实施例进一步说明本发明的技术 方案。

实施例1。

将0.33g不饱和去甲基斑蝥素溶解于30ml丙酮中，以物质的量比例2:1加入丁二胺 0.09g，常温搅拌24h，得白色粉末状沉淀，待溶剂挥发至剩余约10ml，过滤，分别用二氯甲烷 和乙醇洗涤沉淀，然后用甲醇重结晶，可得无色棒状晶体，即为目标产物。

实施例2。

将0.33g不饱和去甲基斑蝥酰亚胺溶解于30ml丙酮中，以物质的量比例2:1加入1, 4-二溴丁烷0.22g，常温搅拌24h，得白色粉末状沉淀，待溶剂挥发至剩余约10ml，过滤，用二 氯甲烷洗涤沉淀，然后用甲醇重结晶，可得无色棒状晶体，即为目标产物。

实施例3。

将0.25g1,1’-(丁烷-1,4-二基)-二(1H-吡咯-2,5-二酮)溶解于50ml甲苯中，以物 质的量比例1:2加入0.20g呋喃，加热回流10h后浓缩溶液至20ml，静置两天，若得无色棒状 结晶，即为目标产物；若得白色粉末状沉淀，则为粗产品，过滤后用二氯甲烷洗涤沉淀，然后 用甲醇重结晶，可得无色棒状晶体，即为目标产物。

附图说明。

附图1是2,2'-(丁烷-1,4-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的¹HNMR谱图。

附图2是2,2'-(丁烷-1,4-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的¹³CNMR谱图。

附图3是2,2'-(丁烷-1,4-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的晶体结构图，椭球概率30%。

附图4是2,2'-(丁烷-1,4-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的晶体结构堆积图。

附图5是2,2'-(己烷-1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的¹HNMR谱图。

附图6是2,2'-(己烷-1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的¹³CNMR谱图。

附图7是2,2'-(己烷-1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的晶体结构图，椭球概率30%。

附图8是2,2'-(己烷-1,6-二基)二(3a,4,7,7a-四氢-4,7-环氧-1,3-二氢异吲哚- 1,3-二酮)的晶体结构堆积图。