重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用

摘要

本发明涉及重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。本发明的目的是提供以重组乳酸菌L.lactisNZ9000 pCYT:SNase为载体的疫苗所具有的在抗1型糖尿病作用中的新应用。该重组菌经乳糖诱导之后能够表达目的蛋白葡萄球菌核酸酶Staphylococcal nuclease,SNase。通过口服给药的方式将L.lactisNZ9000 pCYT:SNase活菌疫苗免疫4周龄雌性NOD/LtJ小鼠，并对一系列药效学指标进行评估，发现：与对照组相比，口服L.lactisNZ9000 pCYT:SNase可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率，能够较好地控制NOD小鼠的血糖和体重，并且显著提高NOD小鼠的生存率。由此可知，重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000 pCYT:SNase可以明显抑制NOD小鼠糖尿病的发生发展，可用于1型糖尿病药物的开发。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有抗1型糖尿病作用的重组乳酸菌，以及含有该重组乳酸菌的衍生物和类似的药物制剂，本发明涉及药学及医学相关领域。

背景技术

糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是由于胰岛素绝对或相对不足而引起的、以高血糖和多发并发症并存等为特点的内分泌代谢性疾病,是最常见的慢性病之一。通常将糖尿病分为两大类型，1型糖尿病（Type1diabetesmellitus，T1DM）和2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）。T1DM通常被认为是一种以遗传为基础的，多因素共同参与的，器官特异性自身免疫疾病。患者胰岛β细胞受到T淋巴细胞介导的免疫损伤，导致胰岛素分泌绝对不足。同时T1DM也是大量未知的环境因素综合影响的结果，比如病毒感染、饮食等，但其致病机制至今尚未明确。患者主要症状是三多一少，即多饮、多食、多尿、体重减轻。目前，对于T1DM的治疗仍多采用注射胰岛素的方法，但是对大多数患者而言，胰岛素治疗不仅无法将患者血糖水平时刻维持在正常范围内，还有发生急性低血糖的危险，更无法从根本上改善或终止T1DM的主要病因——免疫调节紊乱，而且频繁的皮下注射，有创性的血糖监测等都是长期胰岛素注射治疗的制约因素，并且常规免疫抑制剂并不能直接做降糖药物，应用于临床，因此说明T1DM是一个复杂、多因素引起病症，仅仅免疫抑制并不能起到良好效果，故找到新靶点，研究新的治疗方法势在必行。

乳酸菌长期应用于食品工业各个领域，比如发酵制品的生产和保存，已被证明无致病性，是一种公认的安全级（generallyrecognizedassafe,GRAS）微生物。目前，对于乳酸菌来说，除了利用基因工程菌进行食品发酵之外，其作为载体递呈治疗性蛋白或抗原的功能已成为研究热点。乳酸菌NZ9000是乳酸乳球菌Lactococcuslactissubsp.cremorisMG1363的衍生菌株。它是1998年由Kuipers等将表达乳酸链球菌素（nisin）的调控基因nisR和nisK整合到MG1363的氨基肽酶N基因(pepN)中构建而成(pepN::nisRnisK)。由于其诸多优点，现已广泛用于外源蛋白的表达，并且作为活载体疫苗递呈抗原。比如，其生理生化特点简单；遗传背景清楚；抗原性弱；菌体自身分泌蛋白少，降低对外源分泌蛋白的干扰；不产生内毒素；不产生任何细胞外蛋白酶，避免分泌蛋白发生细胞外降解；安全性高，2010年，Lee等首次从毒理学角度评估了NZ9000的安全性，证明NZ9000不含抗药性基因，不产生毒性蛋白。NZ9000表达系统通常采用NICE（nisin-controlledexpression,NICE）表达系统，即nisin诱导的基因表达系统。该表达系统应用广，可控性强。有效的NICE系统主要包括带有nisRK基因的宿主菌、含有PnisA或PnisF启动子片段的质粒（含有可插入目的基因的多克隆位点）以及作为诱导物的nisin或其类似物。

pCYT:SNase（文献为pCYT:NUC）是常用的nisin诱导的外源基因表达载体，其带有氯霉素抗性，含有PnisA启动子，若在其多克隆酶切位点中插入目的基因，就能够在nisin诱导下进行外源目的蛋白的表达。其中的nuc基因编码的SNase常被作为报告蛋白（reporter）监测蛋白靶定和构象状态。SNase分子量小，遗传背景和生化性质清楚，稳定性好，不易变性，活性易于检测，当作为表达标签与目的蛋白融合表达时，一方面不会影响目的蛋白的活性，另一方面可以降低胞内酶对目的蛋白的降解作用。

所述的SNase为葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease)，属于最早发现的一类非特异核糖核酸酶，成熟形式的SNase由149个氨基酸残基组成，其中同源序列SNc含有135个氨基酸残基，催化位点含有67个氨基酸残基，能够非特异性地降解DNA和RNA，并释放出3’-磷酸单核苷酸和二核苷酸，它同时具有外切酶和内切酶活性，另外与其他DNase相比还具有分子量小、热稳定性好、pH活性范围广（pH4~10）等优点。

上述pCYT:SNase是常规载体，目前并没有任何降血糖的报道。

本发明首次发现SNase或含有SNase的乳酸乳球菌表达菌株即L.lactisNZ9000pCYT:SNase具有降血糖作用，并且乳酸乳球菌表达菌株即L.lactisNZ9000pCYT:SNase可以口服，克服了胰岛素等不能口服等难题。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是提供表达SNase的重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase的新用途。

技术方案：

SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。

一种重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。

本发明涉及的重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase,即乳酸乳球菌NZ9000pCYT:SNaseLactococcuslactisNZ9000pCYT:SNase保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学;保藏号为CCTCCNO：M2016084，保藏时间为2016年3月4日。

所述的以重组乳酸菌或SNase为有效成分的制剂为含有重组乳酸菌以及SNase的注射剂、缓释剂、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液。

一种检测试剂盒，其特征含有所述的重组乳酸菌或SNase。

本发明所提供的重组乳酸乳球菌可为LactococcuslactisNZ9000型，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌。

本发明所提供的表达载体也可为其它许可在人体使用的乳酸菌表达载体。

有益效果：

1、本发明采用葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease,SNase)首次发现其具有降血糖作用。并且发现重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase也具有降糖作用，并且可以口服给药，本发明涉及其新用途。

2、现有技术表明诸多如HSP65之类的蛋白可用于1型糖尿病的防治，工程菌对于此类蛋白的表达打破了其难以大批量生产的桎梏，但是也存在其他的问题，例如在分离纯化过程中融合蛋白的降解，调控操作条件严格，纯化效率过低等。此发明采用乳酸乳球菌来递送目的蛋白，使得蛋白在机体中进行表达，巧妙地规避了蛋白降解以及纯化步骤繁琐复杂的问题，节约了生产成本，对于大规模的生产以用于1型糖尿病的防治具有重要意义。

传统疫苗一般是通过皮下注射的方式进行给药，但是皮下注射对病患而言过于痛苦，所以难以被接受，另外，这种给药方式还存在严重的安全性问题。而本专利所涉及的重组乳酸菌通过口服给药，黏膜吸收的方式，克服了上述的种种局限，易于为病患接受。

乳酸菌长期应用于食品工业各个领域，已被证明无致病性，是一种公认的安全级（generallyrecognizedassafe,GRAS）微生物。乳酸乳球菌是乳酸菌的模式菌株，其作为表达外源蛋白的理想载体有其独特的优势：首先,常用的疫苗载体，如沙门氏菌、大肠杆菌和痘病毒等，大多数是病原菌，具有一定危险性，而乳酸乳球菌是一种食品级微生物，尤其是对于特定人群如老年人、婴幼儿来说有更好的安全性；其次乳酸乳球菌作为一种革兰氏阳性菌，没有脂多糖这一促炎物质，因此具有弱抗原性，其作为载体本身不会引起强烈的免疫应答；再者，乳酸乳球菌自身分泌蛋白较少，从而减少了对外源分泌蛋白的干扰，而且不产生胞外蛋白酶，从而保证分泌蛋白不被降解，保证其结构和功能的完整性；另外乳酸乳球菌在所有肠段都具有代谢活性，直接接触肠粘膜，促进外源蛋白向黏膜的呈递；乳酸乳球菌还能够给外源性治疗蛋白提供一种胶囊化保护屏障，保护其在胃肠道中不被降解（90%~98%存活率），成功到达肠粘膜处释放，而且研究表明乳酸乳球菌只在肠道中短暂定植，不会危害

肠道内正常益生菌或造成正常菌群紊乱。

与其它表达系统相比，NICE表达系统优势明显：首先其诱导效率高，可达1000倍以上；其次诱导物nisin是一种食品级的生物安全肽,在一些国家的食品工业中可作为保鲜剂；受控严格,非诱导条件下目的蛋白不表达或表达量少,使细菌生长与外源基因的表达阶段分开,从而减轻了目的蛋白表达时宿主菌的代谢负荷。另外虽然nisin是一种细菌素，能够对大多数革兰氏阳性菌起到抑制作用，但这种抑制作用所需的nisin量是微克级别的，而作为诱导剂只需要纳克级别的量，因此其作为诱导剂对乳酸乳球菌的抑制作用较小。

附图说明

图1pCYT:SNase质粒组成示意图

质粒中的目的基因SNase片段大小为516bp，共编码171个氨基酸残基，含有同源结构域SNc（135个氨基酸残基），后者包括催化位点（67个氨基酸残基）。

图2pCYT:SNase质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果

M：marker；lane1：目的条带，即pCYT:SNase质粒条带。

图3SNase蛋白SDS-PAGE电泳检测结果

M：marker；lane1：乳糖诱导前L.lactisNZ9000pCYT:SNase的总蛋白；lane2~6：诱导后0.5h、1h、1.5h、2h以及2.5hL.lactisNZ9000pCYT:SNase的总蛋白。

图4重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠发病率的影响

图5重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠血糖的影响

图6重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠体重的影响

图7重组乳酸乳球菌疫苗对NOD小鼠生存能力的影响

其中图4-7中LL-pCYT:SNase为L.lactisNZ9000pCYT:SNase组。

具体实施方式

实施例1：pCYT:SNase质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳验证

使用质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行质粒提取，过程如下：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸出上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1（事先加入RNaseA以及溶菌酶），使用移液枪彻底悬浮菌体沉淀，并置于37℃水浴锅中裂解40min；向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6~8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6~8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000rpm离心10min；将上清液转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），尽可能避免吸出沉淀，12000rpm离心30~60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μL漂洗液PW（事先加入无水乙醇），12000rpm离心30~60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中，并将这一步重复一次；将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，将吸附柱中残留的漂洗液去除；将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部分滴加70μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。用琼脂糖凝胶电泳对质粒进行验证，如图2所示。

实施例2：诱导重组乳酸乳球菌菌株L.lactisNZ9000pCYT:SNase表达SNase。

将重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase，按照文献“LuisG.Bermúdez-Humaránetal.Controlledintra-orextracellularproductionofstaphylococcalnucleaseandovineomegainterferoninLactococcuslactis[J].FEMSMicrobiologyLetters,224(2003):307-313”所提供的方法制备获得，在文献中命名为pCYT:NUC。所述的重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase,即乳酸乳球菌NZ9000pCYT:SNaseLactococcuslactisNZ9000pCYT:SNase保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学;保藏号为CCTCCNO：M2016084，保藏时间为2016年3月4日。

将重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase接种于GM17培养基中，30℃过夜培养；过夜培养液1∶100转接GM17培养基，30℃扩大培养，待菌生长至OD600值为0.4～0.6时加入诱导剂nisin（50ng/mL），继续培养一段时间,直至OD600值达到1.2开始收菌，收菌过程如下：4000rpm离心5min，弃上清；用灭菌PBS洗涤菌体两次（4000rpm离心5min），弃上清；用无菌PBS缓冲液重悬菌体；调整菌体终浓度为2×10¹⁰CFU/mL，所得活菌重悬液立即用于免疫。

实施例3：重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase抗1型糖尿病疫苗药效学评价。

将24只4周龄雌性NOD/LtJ小鼠（购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0004）随机分为2组，分别是L.lactisNZ9000组和L.lactisNZ9000pCYT:SNase组，每组12只，在小鼠为五周龄时开始灌胃给药，第一周每天灌胃一次，从给药后第二周开始每周灌胃给药一次，直到小鼠20周龄时结束给药。灌胃前，调整每组活菌菌浓度为2×10¹⁰CFU/ml，给药量为4×10⁹CFU/200μL/次/只。

（1）重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase疫苗对NOD小鼠的发病率影响。

从实验开始起，每两周从NOD小鼠眼眶静脉丛取血一次，并用血糖检测仪检测小鼠的血糖水平，同时称量其体重。糖尿病发病的情况用高血糖值来表示，连续两次血糖值高于11.1mmol/L，并伴有多食、多饮、多尿、体重减轻等情况则判定为发病。如图4所示，与对照组（L.lactisNZ9000组）相比，给药组（L.lactispCYT:SNase组）小鼠发病情况明显受到抑制（P=0.002，n=12）。在4周龄时，各组小鼠都是健康且未发病的，而从12周龄起，对照组NOD小鼠即陆续发病，在16周龄时发病率明显上升；在20周，最后一次给药结束时，实验组发病率只有8.3%（1只），而此时对照组的发病率已达66.7%（8只）；观测期结束时，对照组累积有91.7%（11只）的NOD小鼠发病，而给药组的发病率为50%（6只）。因此结果表明，重组乳酸乳球菌疫苗可以明显抑制NOD小鼠糖尿病的发生发展。

（2）重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase疫苗对NOD小鼠的血糖和体重的影响。

观测期间，给药组和对照组小鼠血糖变化如图5所示，体重变化如图6所示。对照组小鼠平均血糖最大值达到13.63mmol/L，而给药组小鼠平均血糖始终处于11.1mmol/L以下，最高值为10.29mmol/L，小于对照组。观测期内，各组小鼠平均体重先升后降，停止给药时，L.lactispCYT:SNase组小鼠平均体重显著高于对照组（P＜0.05），终末期体重也高于对照组。

（3）重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase疫苗对NOD小鼠生存能力的影响。

记录每组每只小鼠的生存状况，直至观测期结束。小鼠的生存状况如图7所示：L.lactisNZ9000组小鼠从14周开始陆续死亡，20周给药结束时，已死亡三只，生存率为75%，32周观测期结束时，小鼠已死亡7只，生存率为41.7%；而L.lactispCYT:SNase组小鼠在24周前，生存率一直维持在100%，给药结束六周后，小鼠开始出现死亡，但到观测期结束时，生存率仍为66.7%。实验结果表明，L.lactispCYT:SNase能够显著地提高NOD小鼠的生存能力。

结论：由此可知，重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase可以明显抑制NOD小鼠糖尿病的发生发展，较好控制NOD小鼠的血糖和体重，能够显著地提高NOD小鼠的生存能力，可用于1型糖尿病药物的开发。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照发明的某些优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

SEQUENCELISTING

<110>中国药科大学

<120>重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用

<130>

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>171

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

MetAsnAlaSerGlnThrAspAsnGlyValAsnArgSerGlySerGlu

151015

AspProThrValTyrSerAlaThrSerThrLysLysLeuHisLysGlu

202530

ProAlaThrLeuIleLysAlaIleAspGlyAspThrValLysLeuMet

354045

TyrLysGlyGlnProMetThrPheArgLeuLeuLeuValAspThrPro

505560

GluThrLysHisProLysLysGlyValGluLysTyrGlyProGluAla

65707580

SerAlaPheThrLysLysMetValGluAsnAlaLysLysIleGluVal

859095

GluPheAspLysGlyGlnArgThrAspLysTyrGlyArgGlyLeuAla

100105110

TyrIleTyrAlaAspGlyLysMetValAsnGluAlaLeuValArgGln

115120125

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130135140

GlnHisLeuArgLysSerGluAlaGlnAlaLysLysGluLysLeuAsn

145150155160

IleTrpSerGluAspAsnAlaAspSerGlyGln

165170