一种大熊猫精子的冷冻保存方法

摘要

本发明提供了一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：收集大熊猫精液；将所述精液放入冻精管中，并将所述冻精管放入程控冷冻仪的腔体，所述腔体的腔体内温度为15℃?24℃；对放置有所述冻精管的所述腔体的所述腔体内温度进行梯度降温，所述梯度降温包括第一降温阶段和第二降温阶段；以及将经过所述梯度降温的所述冻精管放入液氮进行保存。这种方法采用程序梯度降温，操作简单，同时，能够提高大熊猫精液的精子活力和冷冻恢复率，提高冻存精子的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及动物精子保存技术领域，具体而言，涉及一种大熊猫精子 的冷冻保存方法。

背景技术

大熊猫是我国特有的珍稀物种，繁殖能力低下，发情期短。在圈养大 熊猫种群中，由于同时处于繁殖期的雌雄大熊猫数量较少，自然交配的成 功率较低，所以有时候会采取人工受精的方法促使大熊猫怀孕。人工采集 到的大熊猫精液，其中的活性精子在常温环境中会逐渐失去活性，影响人 工受精的受胎率。

现有的大熊猫精液冷冻技术为颗粒冻精技术，这种技术由于冷冻时仅 仅是通过调整冷冻面与液氮面之间的距离来确定精液的初冻温度。由于手 工操作的间歇性，致使在将精液滴到金属板上的过程中，同一批次中精子 与金属板的接触时间有差异，使得同一批次精液冷冻效果不一致，影响冻 存精子的质量。复苏后，由于同一批次精子的活性差异大，会极大的降低 人工受精的成功率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大熊猫精子的冷冻保存方法，这种方法能 够提高冻存精子的质量，以进一步增大熊猫人工受精的成功率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤：

a.收集大熊猫精液；

b.将所述a步骤中所得的所述精液放入冻精管中，将所述冻精管放入程 控冷冻仪的腔体内，所述腔体的温度为15℃-24℃；

c.对所述腔体进行梯度降温：第一降温阶段，以第一冷却速率将所述腔 体的温度降低至第一冷冻温度，所述第一冷却速率为89℃/min-109℃/min， 所述第一冷冻温度为-122℃至-102℃；第二降温阶段，以第二冷却速率将所 述腔体的温度降低至第二冷冻温度，所述第二冷却速率为以65℃/min-85℃ /min，所述第二冷冻温度为-175℃至-155℃；随后将所述冻精管放入液氮 进行保存。

现有技术中，大熊猫精液的冻存方法主要有三种：颗粒法、安瓿法和 冻管法。其中，颗粒法设备简单，在操作过程中容易使冻存精液受到污染， 同时由于在夹取过程中颗粒暴露在室温中的时间过长，使得冻存精子的复 苏率低。安瓿法操作繁琐，封口和拆封均有一定难度，且在封口时可能由 于冷热不均引起爆炸,对操作人员及精液造成损伤。冻管法的操作相对简单， 但由于在手动冷冻的过程中，不同操作员的手法不一，会对大熊猫的精子 活率产生不同程度的影响。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)将装有大熊猫精液的冻精管放置于程控冷冻仪的腔体，采用程序 梯度降温法，以不同的冷却速率分两个阶段降低腔体内温度，操作简单， 便于自动化控制，减少人为操作对熊猫冻存精液质量的影响。

(2)通过控制程控冷冻仪腔体内温度的冷却速率，使腔体内温度以第 一冷却速率89℃/min-109℃/min降低至第一冷冻温度(-122℃至-102℃) 后，再以第二冷却速率65℃/min-85℃/min降低至第二冷冻温度(65℃/min -85℃/min)，这种梯度降温可使位于腔体内冻精管中的精子细胞快速跨越冰 晶期，避免精子细胞中产生冰晶，减少冰晶对精子膜的损伤，提高大熊猫 精液的精子活力和冷冻恢复率，提高冻存精子的质量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的 常规产品。

本实施方式提供的一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤。

步骤a.收集大熊猫精液。

在本发明较佳的实施例中，例如是采用电刺激法收集精液。具体的， 用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电极棒刺激大熊猫。刺激电 压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢增加刺激电压。每次刺激 时间约为2秒，刺激的间隔时间约为3秒。持续刺激直至采出精液。采集 到的精液可用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释，并用甘油 做保护剂。

步骤b.将步骤a中所得的精液放入冻精管中，并将冻精管放入程控冷 冻仪的腔体内，腔体的腔体内温度为15℃-24℃。

在本发明较佳的实施例中，将所得的冻精管放入程控冷冻仪的腔体时， 腔体的腔体内温度优选为17℃-22℃。当腔体的温度优选为17℃-22℃时， 能够减少冻精管转移至程控冷冻仪时对大熊猫精子活力的影响，从而进一 步的提高冻存精子的质量。

进一步优选地，在将精液放入冻精管前，精液在2℃-8℃的冷藏设备中 放置2-8小时。在将精液放入冻精管前，精液在低温中冷藏平衡一段时间， 避免细胞在室温中活性下降，有助于保持精子细胞的活性。进一步优选地， 冻精管装好精液后可使用密封机对冻精管进行密封处理。

步骤c.对腔体进行梯度降温：第一降温阶段，以第一冷却速率将腔体 的温度降低至第一冷冻温度，第一冷却速率为89℃/min-109℃/min，第一 冷冻温度为-122℃至-102℃；第二降温阶段，以第二冷却速率将腔体的温度 降低至第二冷冻温度，第二冷却速率为以65℃/min-85℃/min，第二冷冻 温度为-175℃至-155℃；随后将冻精管放入液氮进行保存。

在本发明较佳的实施例中，第一降温阶段中的第一冷却速率优选为 94℃/min-104℃/min。当第一冷却速率为94℃/min-104℃/min时，冻精管 内的精子细胞能够以较快的速度跨越冰晶期，从而保护精子细胞免受冰晶 的破坏。

进一步优选地，第一降温阶段中的第一冷却速率为92℃/min-98℃/min。 当第一冷却速率为92℃/min-98℃/min时，冻精管内的精子细胞能够以较快 的速度跨越冰晶期，减少细胞内形成冰晶的数量，从而最大限度的降低冰 晶对精子细胞膜的损伤，有利于提高冻存精子的质量。

在本发明较佳的实施例中，第一降温阶段中的第一冷冻温度优选为 -117℃至-107℃。第一降温阶段结束后，程控冷冻仪中腔体的腔体内温度为 -117℃至-107℃，有利于减少精子细胞的损伤，提高冻存精子解冻后的细胞 活力。

进一步的，在本发明较佳的实施例中，第二冷却阶段中的第二冷却速 率为70℃/min-80℃/min。第二冷却速率较第一冷却速率小，腔体内温度在 第二冷却阶段时降温相对比较平缓，当第二冷却速率为70℃/min-80℃/min 时，精液所在环境中的温度变化对精子细胞的损伤相对较小。第二冷却速 率进一步优选为73℃/min-78℃/min，此时腔体内的温度变化对精子细胞的 损伤程度最小。

在本发明较佳的实施例中，第二降温阶段中的第二冷冻温度优选为 -170℃至-160℃。第二降温阶段结束后，程控冷冻仪中腔体的腔体内温度为 -170℃至-160℃，有利于减少精子细胞的损伤，提高冻存精子解冻后的细胞 活力，进一步提高冻存精子的质量。

实施例1

一种大熊猫精子的冷冻保存方法，包括以下步骤:

1.大熊猫精液采集：用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电 极棒刺激大熊猫。刺激电压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢 增加刺激电压。每次刺激时间2秒，刺激的间隔时间为3秒。持续刺激直 至采出精液。

2.将采集到的精液用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释。 稀释前在稀释液TEST中加入冷冻保护剂甘油，从而减少由于冰晶形成造成 的细胞损伤。稀释后的精液中精子的密度为5×108个/ml，即稀释后的每 毫升精液中有5×108个精子细胞。。将上述精液放置于4℃冰箱中平衡4小 时后，把精液吸入冻精管中，装好后使用密封机对冻精管进行密封处理。 然后把冻精管放入程控冷冻仪的腔体中，此时程控冷冻仪的腔体的腔体内 温度为19℃。

3.启动程控冷冻仪的冷冻程序。程控冷冻仪首先以89℃/min的冷却速 率把腔体的腔体内温度降低至-122℃，随后以65℃/min的冷却速率把腔体 的腔体内温度降低至-165℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实施例2

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例1基本一致，不同之处在于，程控冷冻仪中冷冻程序的参数设 置。

在启动程控冷冻仪的冷冻程序，程控冷冻仪首先以94℃/min的冷却速 率把腔体的腔体内温度降低至-117℃，随后以70℃/min的冷却速率把腔体 的腔体内温度降低至-170℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实施例3

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例1基本一致，不同之处在于，程控冷冻仪中冷冻程序的参数设 置。

在启动程控冷冻仪的冷冻程序，程控冷冻仪首先以99℃/min的冷却速 率把腔体的腔体内温度降低至-112℃，随后以75℃/min的冷却速率把腔体 的腔体内温度降低至-165℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实施例4

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例1基本一致，不同之处在于，程控冷冻仪中冷冻程序的参数设 置。

在启动程控冷冻仪的冷冻程序，程控冷冻仪首先以104℃/min的冷却速 率把腔体的腔体内温度降低至-107℃，随后以80℃/min的冷却速率把腔体 的腔体内温度降低至-160℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实施例5

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例1基本一致，不同之处在于，程控冷冻仪中冷冻程序的参数设 置。

在启动程控冷冻仪的冷冻程序，程控冷冻仪首先以109℃/min的冷却速 率把腔体的腔体内温度降低至-102℃，随后以85℃/min的冷却速率把腔体 的腔体内温度降低至-155℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实施例6

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例3基本一致，不同之处在于：将冻精管放入程控冷冻仪时，程 控冷冻仪的腔体的腔体内温度为15℃。

实施例7

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例3基本一致，不同之处在于：将冻精管放入程控冷冻仪时，程 控冷冻仪的腔体的腔体内温度为24℃。

实施例8

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例3基本一致，不同之处在于：将用电刺激法采集到精液，稀释 后放置于2℃冰浴中冷却2小时后，装入冻精管。

实施例9

本实施例提供的大熊猫精子的冷冻保存方法，其实现步骤以及具体参 数和实施例3基本一致，不同之处在于：将用电刺激法采集到精液，稀释 后放置于8℃冰浴中冷却8小时后，装入冻精管。

对照例1

采用传统的细管冻精技术对大熊猫精液进行保存。1.大熊猫精液采集： 用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电极棒刺激大熊猫。刺激电 压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢增加刺激电压。每次刺激 时间2秒，刺激的间隔时间为3秒。持续刺激直至采出精液。

2.将采集到的精液用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释。 稀释前在稀释液TEST中加入甘油，甘油作为保护剂能够减少细胞内冰晶的 形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。稀释后的精液中精子的密 度为5×108个/ml，即稀释后的每毫升精液中有5×108个精子细胞。将上述 精液放置于4℃冰箱中平衡4小时后，把精液吸入冻精管中，装好后使用密 封机对冻精管进行密封处理。

3.先把试管架固定在靠近液氮容器的位置，再将冻精管在试管架的上层 放置1分钟，此时冻精管距离液氮表面的距离为7.5cm；随后再将冻精管转 移至试管架的下层，放置1分钟，此时冻精管距离液氮表面的距离为2.5cm。

对照例2

1.大熊猫精液采集：用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电 极棒刺激大熊猫。刺激电压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢 增加刺激电压。每次刺激时间2秒，刺激的间隔时间为3秒。持续刺激直 至采出精液。

2.将采集到的精液用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释。 稀释前在稀释液TEST中加入冷冻保护剂甘油，从而减少由于冰晶形成造成 的细胞损伤。稀释后的精液中精子的密度为5×108个/ml，即稀释后的每 毫升精液中有5×108个精子细胞。将上述精液放置于4℃冰箱中平衡4小时 后，把精液吸入冻精管中，装好后使用密封机对冻精管进行密封处理。然 后把冻精管放入程控冷冻仪的腔体中，此时程控冷冻仪的腔体温度为13℃。

3.启动程控冷冻仪的冷冻程序。程控冷冻仪首先以88℃/min的冷却速 率把腔体内的温度降低至-123℃，随后以64℃/min的冷却速率把腔体内的 温度降低至-166℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

对照例3

1.大熊猫精液采集：用氯胺酮(7mg/kg)对大熊猫进行麻醉后，用电 极棒刺激大熊猫。刺激电压从2V开始，根据大熊猫后肢收缩的程度，缓慢 增加刺激电压。每次刺激时间2秒，刺激的间隔时间为3秒。持续刺激直 至采出精液。

2.将采集到的精液用稀释液TEST(IrvineScientific的产品)进行稀释。 稀释前在稀释液TEST中加入冷冻保护剂甘油，从而减少由于冰晶形成造成 的细胞损伤。稀释后的精液中精子的密度为5×108个/ml，即稀释后的每 毫升精液中有5×108个精子细胞。将上述精液放置于4℃冰箱中平衡4小时 后，把精液吸入冻精管中，装好后使用密封机对冻精管进行密封处理。然 后把冻精管放入程控冷冻仪的腔体中，此时程控冷冻仪的腔体温度为25℃。

3.启动程控冷冻仪的冷冻程序。程控冷冻仪首先以110℃/min的冷却速 率把腔体内的温度降低至-101℃，随后以86℃/min的冷却速率把腔体内的 温度降低至-154℃后，结束冷冻，将冻精管取出放入液氮中保存。

实验例

分别采用经实施例1-9(实验组)和对照例1-3(对照组)冷冻保存的 大熊猫精液进行对照试验。需要说明的是，实施例1-9(实验组)和对照例 1-3(对照组)中作为实验对象的大熊猫的年龄、体重基本一致。

将经过实施例1-9和对照例1-3处理过的冻精管放入37℃水浴30s后， 剪开冻精管密封的一端，将冻精管中的精液放置于37℃的稀释液Hams (IrvineScientific的产品)中，用显微镜进行精液分析。作为对比，在进行 上述冷冻处理前，将刚采集的精液放入37℃水浴中，进行精液分析。

精子质量用精子活力和冷冻恢复率来进行评价，其中，

精子活力(％)：取少量精液滴于恒温保存于37℃条件下的载玻片上， 随机选定一个区域计数100个，凡是活动的精子记为有活力的精子，100个 精子中有活力的精子的数量即为精子活力，单位为％。

冷冻复苏率＝冷冻后的精子活力/冷冻前的精子活力×100％

表1实验组和对照组的精子质量比较

由表1可以看出：

1.相比于对照例1中采用传统的细管冻精技术来保存大熊猫精液，本发 明提供的方法(实施例1-9)有效的提高了大熊猫的精子活力(实验组为 71％-81％，对照组为56％-60％)，提高了大熊猫的精子冷冻复苏率(实验组 为82.6％-94.2％，对照组为63.6％-68.9％)，进而提高人工受精时的受胎率。 此外，这种方法能够有效减少工作操作对精子活力的影响，使不同批次间 精子的活性差异大幅降低，减少了因不同批次间精子活性差异所造成的人 工授精失败几率。

2.相比于对照例2和对照例3中采用的大熊猫精子的冷冻保存方法，本 发明中限定的参数对精子复苏率有至关重要的影响。例如，在对照例2和 对照例3中，程控冷冻仪的冷冻程序中的各项参数设置在本发明限定的参 数范围之外，则的精子复苏率由82.6％-94.2％急剧减小至63.6％-68.9％。

3.比较实验组中实施例1-5中冷冻后的精子活力和冷冻复苏率可以发 现，实施例3中冷冻后的精子活力(81％±3.5)和冷冻复苏率(94.2％)均 明显高于其他实验组的冷冻后的精子活力(74％-78％)和冷冻复苏率 (85.0％-88.6％)。说明当c步骤中的各项参数：第一冷却速率为99℃/min、 第一冷冻温度为-112℃、第二冷却速率为75℃/min、第二冷冻温度为-165℃ 时，大熊猫冷冻后的精子活力和冷冻复苏率得到明显提高。

4.比较试验组中实施例1、2、4和5，可以发现，实施例2和4中大熊 猫冷冻后的精子活力(77％和78％)和冷冻复苏率(87.5％-88.6％)均高于 实施例1和实施例5的冷冻后的精子活力(74％-75％)和冷冻复苏率 (85.0％-86.0％)。说明当步骤c中的各项参数：第一冷却速率为94℃ /min-104℃/min、第一冷冻温度为-117℃至-107℃、第二冷却速率为70℃ /min-80℃/min、第二冷冻温度为-160℃到-170℃时，提高了大熊猫冷冻后的 精子活力和冷冻复苏率。

5.比较实验组中实施例6、7和实施例3，可以发现，在b步骤中，程 控冷冻仪腔体的温度为19℃时，冷冻后的精子活力(81％±3.5)和冷冻复苏 率(94.2％)均高于实施例6和7中的相应值，而实施例6和7中的精子活 力(分别为77％和78％)和冷冻复苏率(分别为89.5％和88.6％)依然明显 高于对照组的相应值。说明程控冷冻仪腔体的温度为15℃-24℃时，能够 提高大熊猫冷冻后的精子活力和冷冻复苏率，优选为19℃。

6.比较实验组中实施例8、9和实施例3，可以发现，在b步骤中，在 将精液放入冻精管前，精液在4℃的低温冷藏设备中放置4小时，大熊猫冷 冻后的精子活力(81％±3.5)和冷冻复苏率(94.2％)均高于实施例8和9 中的相应值，而实施例8和9中的精子活力(分别为76％和71％)和冷冻 复苏率(分别为82.6％和87.4％)依然明显高于对照组的相应值。说明在将 精液放入冻精管前，在2℃-8℃的低温冷藏设备中放置2-8小时，能够有效 提高大熊猫冷冻后的精子活力和冷冻复苏率。其中，优选为精液在4℃的低 温冷藏设备中放置4小时。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背 离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此， 这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修 改。