人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法

摘要

本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法，通过将人参丛生芽低温?高渗预处理后，转至装载液中并经脱水处理后转入装有玻璃化溶液的冷冻管中，并迅速投入液氮进行超低温保存；保存过后可经过特定的复苏处理及再生培养条件得到遗传性状稳定的再生植株。通过提供人参丛生芽超低温保存方法，保持了人参组织培养物的遗传稳定性，利于人参种质资源的长期保存。而通过配套使用本申请提供的再生培养方法，可使超低温保存后的人参植株再生成活率高达70％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，具体而言，涉及一种人参丛生芽超低 温保存及植株再生培养方法。

背景技术

植物组织培养技术作为一项保存种质资源的方法，已经广泛应用于各 种植物材料的离体保存上。它具有不受季节限制，培养条件可控，可周年 实验或生产，生长快、周期短，管理方便等优点。

人参(PanaxginsengC.A.Mey.)是五加科(Araliaceae)人参属多年 生草本植物。是我国传统名贵中草药，被誉为药中之王。人参丛生芽是以 人参子叶胚为外植体，经消毒灭菌后，接种在无菌培养基上培养而成的。 人参丛生芽再生是实现人参组培快繁的重要途径。

在组织培养中，为防止人参培养材料老化、培养基养分减少造成的植 物生长不良和代谢物质积累，需要定期进行继代培养对人参丛生芽进行保 存。但是采用这种保存方法，一方面要耗费大量的人力、物力和财力，另 一方面随着培养材料保存时间的延长，在多次继代过程中，使植物组织细 胞一直处于分化期，加之外源激素的刺激与积累，极易导致材料发生基因 突变、染色体漂移等一系列遗传变异的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方 法，所述的方法提供了一种经济、稳定的人参丛生芽保存方法，从而克服 长期继代培养导致的再生能力丧失和染色体、基因型的改变的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种人参丛生芽超低温保存方法，包括：

1)、将人参丛生芽进行低温锻炼后切成小块并接种于含0.45～0.55mol/L 蔗糖和0.15～0.25mol/L甘露醇的MS培养基上进行预培养；

2)、将预培养后的人参丛生芽于室温条件下经装载液脱水处理后再用 PVS₂玻璃化液于-1～1℃下处理110～130min，换一次PVS₂玻璃化液后转入 装有PVS₂玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入液氮中低温保存。

超低温保存(Cryopreservation)是指在-80℃一下的超低温中保存种质 资源的一套生物学技术。在超低温条件下保存材料，可以大大减慢甚至终 止代谢和衰老过程，保存生物材料的稳定性，最大限度地抑制生理代谢强 度，减少遗传变异的发生。超低温保存技术是目前唯一可行的、不需继代 的长期保存方式。

由于植物的基因型，抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态 等因素对超低温保存效果有较大的影响，从而要求在整个保存处理过程中 采取相应的符合其生物特性的各种措施。不同基因型的植物材料对超低温 保存的反应各不相同，冻后存活率的显著差异不仅存在于种间，而且存在 于不同品种(系)间。植物抗寒力的提高与细胞的分裂和生长等生理状态 有密切关系，所以组织细胞培养物的生长年龄与生理状态也是决定冷冻细 胞存活率的重要因素。由于目前本领域还没有任何关于人参丛生芽超低温 保存方法的相关记载，因而，为了解决长期继代培养导致的人参再生能力 丧失和染色体、基因型的改变等问题，本申请提供了人参丛生芽超低温保 存及植株再生培养方法以解决上述问题。

其中，与培养所用的培养基中，蔗糖能降低植物组织中的水分含量。 提高其中的糖和蛋白质含量，而且还能影响膜质成分。在培养基中加入甘 露醇能减少超低温保存造成的伤害，增大膜对水分的通透性，促进细胞外 冰冻造成的脱水效果，降低细胞内水分冰点温度，保护蛋白质和酶类。

所述PVS₂玻璃化液的配方为MS大量元素+MS微量元素 +15％DMSO+15％乙二醇+30％甘油+0.4mol/L蔗糖。

优选的，如上所述的人参丛生芽超低温保存方法，在步骤1)中，所述 人参丛生芽的获取方式为：

A)、将人参子叶期胚接种于MS基本培养基上进行萌发培养；

B)、将步骤A)萌发后长出的幼苗基部作为外植体接种于含有 0.8～1.2mg/L6-苄基腺嘌呤，0.4～0.6mg/L6-糠基氨基嘌呤和0.4～0.6mg/Lα -萘乙酸的MS培养基上进行培养获得初级人参丛生芽；

C)、将步骤B)得到的初级人参丛生芽切块后接种于含有0.9～1.1mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.1～0.3mg/Lα-萘乙酸的MS培养基进行扩繁培养得到人 参丛生芽。

进一步优选的，如上所述的人参丛生芽超低温保存方法，在步骤B) 中，培养条件为：光照强度为2800～3200lx，光照时间为13～15h，培养温 度为21～25℃，培养20～25天；

在步骤C)中，培养条件为：光照强度为2800～3200lx，光照时间为 13～15h，培养温度为21～25℃，培养40～45天。

优选的，如上所述的人参丛生芽超低温保存方法，在步骤1)中，所述 低温锻炼的操作包括：

将所述人参丛生芽于光照强度为2800～3200lx，光照时间为13～15h， 2～6℃的培养环境下培养13～15天。

低温锻炼又称冷驯化。在降低温度时，细胞膜发生膜脂相变，即膜脂 由液晶态向凝胶态转变，相变温度越低抗寒能力越强。低温锻炼可提高膜 磷酸酯的不饱和程度而增加抗低温的能力。此外，经过低温锻炼，细胞发 生保护性脱水，从而免遭细胞内大量结冰引起的细胞死亡。低温锻炼还可 以诱导产生抗冻蛋白，其抗冻机理是当细胞内水分形成冰核后，抗冻蛋白 与之结合，阻止冰盒的扩大，起到抗冻的效果。

由于不同材料低温处理温度和时间不尽一致，因而本申请优选低温锻 炼的时间为13～15天。

优选的，如上所述的人参丛生芽超低温保存方法，在步骤1)中，所述 预培养的条件为：

光照强度为2800～3200lx，光照时间为13～15h，培养温度为21～25℃， 培养1～3天。

预培养的目的在于增加细胞分裂与分化的同步性，提高材料的存活率。

优选的，如上所述的人参丛生芽超低温保存方法，在步骤2)中，所述 装载液为含1.8～2.2mol/L甘油和0.3～0.5mol/L蔗糖的MS培养基；装载液 脱水处理的时间为28～32min。

将人参丛生芽直接投入到PVS₂玻璃化液中会使其遭受严重的渗透伤害 和化学毒害。因此，在玻璃化之前，用一定浓度的冷冻保护剂在室温下处 理一段时间，可进一步降低组织含水量，避免由于渗透压剧烈变化对植物 组织造成伤害，还可以增加细胞内保护剂的含量。

不同植物装载处理的最适时间并不相同，例如芋头茎尖装载的最佳时 间是20min，而甜土豆茎尖装载的最佳时间为60min。本申请提供的装载时 间为28～32min，更优选的为30min。

如上所述的人参丛生芽超低温保存方法的植株再生培养方法，包括：

将低温保存的人参丛生芽取出并进行复苏处理，随后用MS基本培养 基洗涤；

将洗涤后的人参丛生芽依次于黑暗条件、900～1100lx光强、 2800～3200lx光强下培养后得到再生植株。

本申请还提供了后续配套的再生培养方法，该再生培养方法人参再生 成活率高。

如上所述的植株再生培养方法，所述复苏处理的条件为：

37～40℃水浴1～2min。

植物材料的冻伤常常发生在冰冻和化冻两个环节中，合适的化冻方法 可以避免在化冻过程中出现细胞内的次生结冰，并可防止在化冻吸水过程 中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。不同植物材料有着不同的化冻方式， 对于草本植物人参来说，37～40℃水浴化冻即可达到较好的效果。

优选的，如上所述的植株再生培养方法，所用培养基为含有0.4～0.6mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.9～1.1mg/Lα-萘乙酸的MS培养基。

其中，6-苄氨基腺嘌呤即6-BA(6-Benzylaminopurine)，属广谱性植 物生长调节剂，具有促进植物细胞生长与分裂，抑制植物叶绿素的降解， 提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等功能。

α-萘乙酸即NAA(1-Naphthaleneaceticacid)，属广谱型植物生长调节 剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根等功能。

培养基中添加的植物激素对于诱导和促进再生至关重要。为避免中间 愈伤组织的形成，激素的类型和浓度必须认真选择。

进一步优选的，如上所述的植株再生培养方法，在黑暗条件、900～1100 lx光强、2800～3200lx光强下培养的时长依次为6～8d、6～8d、8～12d；光照 时间依次为0h、13～15h、13～15h；培养温度分别为18～22℃、21～25℃、 21～25℃。

暗培养可以防止迅速分裂的愈伤细胞老化，使得愈伤组织能够较快地 恢复生长，提高存活率。而光照培养则可以诱导植物更好的分化。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、通过提供人参丛生芽超低温保存方法，保持了人参组织培养物的 遗传稳定性。

2)、利于长期保存植物种质资源。植物离体材料的超低温保存是长期 保存种质资源的理想方法，甚至被认为是实现生物种质永久保存的唯一途 径。

3)、可长期保存人参的优良品种及其育种亲本材料的种质。

4)、本申请还提供了后续配套的再生培养方法，通过该方法可使超低 温保存后的人参植株再生成活率高达70％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下 面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普 通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获 得其他的附图。

图1为实验例2中PCR扩增结果；M：Marker；1,3,5,7,9为样品；2,4,6,8,10 为对照。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技 术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明 的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的 常规产品。

实施例1

一种人参丛生芽超低温保存方法，包括：

S11、将人参丛生芽进行低温锻炼后切成小块并接种于含0.45mol/L蔗 糖和0.15mol/L甘露醇的MS培养基上进行预培养；

S12、将预培养后的人参丛生芽于室温条件下经装载液脱水处理后再用 PVS₂玻璃化液于-1℃下处理110min，换一次PVS₂玻璃化液后转入装有PVS₂玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入液氮中低温保存；

如上所述的人参丛生芽超低温保存方法的植株再生培养方法，包括：

S13、将低温保存的人参丛生芽取出并进行复苏处理，随后用MS基本 培养基洗涤；

S14、将洗涤后的人参丛生芽依次于黑暗条件、900lx光强、2800lx光 强下培养后得到再生植株。

实施例2

一种人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法，包括：

S21、人参丛生芽的获得

A)、将人参子叶期胚接种于MS基本培养基上进行萌发培养；

B)、将步骤A)萌发后长出的幼苗基部作为外植体接种于含有0.8mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.4mg/L6-糠基氨基嘌呤和0.4mg/Lα-萘乙酸的MS培养基 上进行培养获得初级人参丛生芽；

培养条件为：光照强度为2800lx，光照时间为15h，培养温度为25℃， 培养25天；

C)、将步骤B)得到的初级人参丛生芽切块后接种于含有0.9mg/L6- 苄基腺嘌呤和0.3mg/Lα-萘乙酸的MS培养基进行扩繁培养得到人参丛生 芽；培养条件同步骤B)，不同之处在于培养45天。

S22、人参丛生芽的低温锻炼

将步骤S21中得到的人参丛生芽于光照强度为2800lx，光照时间为 15h，2℃的培养环境下培养13天；所用培养基同步骤C)。

S23、人参丛生芽的预培养

将低温锻炼后的人参丛生芽进行切成小块并接种于含0.45mol/L蔗糖 和0.25mol/L甘露醇的MS培养基上进行预培养；培养条件同步骤B)，不 同之处在于培养1天。

S24、人参丛生芽的超低温保存

将预培养后的人参丛生芽于室温条件下经含1.8mol/L甘油和0.5mol/L 蔗糖的MS培养基处理28min，后再用PVS₂玻璃化液于1℃下处理130min， 换一次PVS₂玻璃化液后转入装有PVS₂玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入 液氮中低温保存。

S25、人参丛生芽的解冻和再培养

培养一段时间后，将低温保存的人参丛生芽快速从液氮中取出，37℃ 水浴1min，随后用MS基本培养基洗涤2次，每次间隔15min。

S26、植株再生培养

将洗涤后的人参丛生芽接种到含有0.4mg/L6-苄基腺嘌呤和1.1mg/L α-萘乙酸的MS培养基上，18℃黑暗培养8d后，转移到900lx光强下，于 25℃培育6d，最后转移到2800lx光强下25℃培养12d得到再生植株。

实施例3

一种人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法，包括：

S31、人参丛生芽的获得

A)、将人参子叶期胚接种于MS基本培养基上进行萌发培养；

B)、将步骤A)萌发后长出的幼苗基部作为外植体接种于含有1.2mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.6mg/L6-糠基氨基嘌呤和0.6mg/Lα-萘乙酸的MS培养基 上进行培养获得初级人参丛生芽；

培养条件为：光照强度为3200lx，光照时间为13h，培养温度为21℃， 培养20天；

C)、将步骤B)得到的初级人参丛生芽切块后接种于含有1.1mg/L6- 苄基腺嘌呤和0.1mg/Lα-萘乙酸的MS培养基进行扩繁培养得到人参丛生 芽；培养条件同步骤B)，不同之处在于培养40天。

S32、人参丛生芽的低温锻炼

将步骤S31中得到的人参丛生芽于光照强度为3200lx，光照时间为 13h，6℃的培养环境下培养15天；所用培养基同步骤C)。

S33、人参丛生芽的预培养

将低温锻炼后的人参丛生芽进行切成小块并接种于含0.55mol/L蔗糖 和0.15mol/L甘露醇的MS培养基上进行预培养；培养条件同步骤B)，不 同之处在于培养3天。

S34、人参丛生芽的超低温保存

将预培养后的人参丛生芽于室温条件下经含2.2mol/L甘油和0.3mol/L 蔗糖的MS培养基处理32min，后再用PVS₂玻璃化液于-1℃下处理110min， 换一次PVS₂玻璃化液后转入装有PVS₂玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入 液氮中低温保存。

S35、人参丛生芽的解冻和再培养

培养一段时间后，将低温保存的人参丛生芽快速从液氮中取出，40℃ 水浴2min，随后用MS基本培养基洗涤3次，每次间隔10min。

S36、植株再生培养

将洗涤后的人参丛生芽接种到含有0.6mg/L6-苄基腺嘌呤和0.9mg/L α-萘乙酸的MS培养基上，22℃黑暗培养6d后，转移到1100lx光强下， 于21℃培育8d，最后转移到3200lx光强下21℃培养8d得到再生植株。

实施例4

一种人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法，包括：

S41、人参丛生芽的获得

A)、取子叶期人参种子，用清水洗净种皮后，再用75％酒精和0.1％Hg Cl将种子表面消毒灭菌，无菌水冲洗4～5遍后，剥取子叶期胚，放在MS 基本培养基上进行萌发培养；

B)、将步骤A)萌发后长出的幼苗基部作为外植体接种于含有1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.5mg/L6-糠基氨基嘌呤和0.5mg/Lα-萘乙酸的MS培养基 上进行培养获得初级人参丛生芽；

培养条件为：光照强度为3000lx，光照时间为14h，培养温度为23℃， 培养23天；

C)、将步骤B)得到的初级人参丛生芽切块后接种于含有1.0mg/L6- 苄基腺嘌呤和0.2mg/Lα-萘乙酸的MS培养基进行扩繁培养得到人参丛生 芽；培养条件同步骤B)，不同之处在于培养43天。

S42、人参丛生芽的低温锻炼

将步骤S41中得到的人参丛生芽于光照强度为3000lx，光照时间为 14h，4℃的培养环境下培养14天；所用培养基同步骤C)。

S43、人参丛生芽的预培养

将低温锻炼后的人参丛生芽进行切成2～3mm小块并接种于含0.5mol/L 蔗糖和0.2mol/L甘露醇的MS培养基上进行预培养；培养条件同步骤B)， 不同之处在于培养2天。

S44、人参丛生芽的超低温保存

将预培养后的人参丛生芽于室温条件下经含2mol/L甘油和0.4mol/L 蔗糖的MS培养基处理30min，后再用PVS₂玻璃化液于0℃下处理120min， 换一次PVS₂玻璃化液后转入装有PVS₂玻璃化溶液的冷冻管中并迅速投入 液氮中低温保存。

S45、人参丛生芽的解冻和再培养

培养一段时间后，将低温保存的人参丛生芽快速从液氮中取出，37℃ 水浴1min，随后用MS基本培养基洗涤2次，每次间隔15min。

S46、植株再生培养

将洗涤后的人参丛生芽接种到含有0.5mg/L6-苄基腺嘌呤和1.0mg/L α-萘乙酸的MS培养基上，20℃黑暗培养7d后，转移到1000lx光强下， 于23℃培育7d，最后转移到3000lx光强下23℃培养10d得到再生植株。

实验例1

丛生芽预培养培养基对冻存后存活率的影响

丛生芽预培养基中的蔗糖浓度对存活率有显著影响。由表1可以看出， 随着蔗糖浓度的增加，超低温保存后的存活率呈现先升高后又降低的趋势， 而未经过高浓度蔗糖预培养的不定芽存活率为0。原因可能是未经过高浓度 蔗糖或经过较低蔗糖浓度预培养，不定芽含水量处于较高的水平，超低温 保存造成细胞内结晶导致存活率低，当蔗糖浓度为0.7mol/L时，会造成细 胞的过度失水，影响了细胞的正常的生理形态，进而导致存活率下降。0.5 mol/L的蔗糖浓度(即最佳实施例S43中提供的培养基的浓度)，存活率最 高，为71％。

表1蔗糖浓度对存活率的影响

注：同列数据后的不同小写英文字母代表经SPSS方差分析在0.05水 平下差异显著。

实验例2

对实施例4得到的再生植株遗传稳定性进行分子鉴定。

本申请采用DNA试剂盒提取人参丛生芽超低温再生前后的DNA，然 后利用SSR分子标记技术评价再生植株的稳定性。

本申请从30对SSR引物中筛选出4对扩增条带清晰、稳定性好的引物 用于SSR-PCR扩增，结果如下：

表2筛选出的10对SSR引物序列及其退火温度

以上述4对为扩增引物，经PCR扩增，扩增结果如图1所示。对照组 与处理组相比较，均未发现有变异条带。说明人参超低温再生材料具有很 高的遗传稳定性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非 对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域 的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案 进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范 围。