用于癌症治疗的包含抗CEACAM1抗体和抗PD抗体的组合物

摘要

本发明提供包含抗CEACAM1抗体的组合物、包含能够抑制或阻断PD?1和其配体之间相互作用的抗体的组合物，以及在治疗癌症中所述组合物组合使用的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及癌症免疫疗法，特别是抗CEACAM1和抗PD-1/PD配体的抗体的组合，及所述组合在治疗癌症中的用途。

发明背景

跨膜蛋白癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1，也被称为胆汁糖蛋白(BGP)、CD66a和C-CAM1)是也属于免疫球蛋白超家族的癌胚抗原家族(CEA)的一员。人类CEACAM1已被分配SwissProt登记号P13688。CEACAM1与其自身以及其他已知的CEACAM蛋白相互作用，所述其他已知的CEACAM蛋白包括CD66e(CEACAM6)和CD66e(CEACAM5，CEA)蛋白。CEACAM1在广范围的细胞上表达，范围从上皮细胞到造血来源细胞(例如免疫细胞)。

许多不同的功能已被归因于CEACAM1蛋白。已显示，CEACAM1蛋白在一些结肠癌、前列腺癌和其他类型的癌症诸如黑素瘤癌中过量表达。另外的数据支持CEACAM1在血管生成和新陈代谢中的核心参与。CEACAM1在调整先天的免疫反应和适应性免疫反应中也发挥作用。例如，CEACAM1被显示是在人类肠上皮内含有的激活的T细胞的抑制性受体(WO 99/52552和Morales等J.Immunol.1999,163,1363-1370)。另外的报告指出，通过T细胞受体与单克隆抗体(mAb)交联或通过淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)Opa蛋白的CEACAM1参与，抑制T细胞激活和增殖。已知抗CEACAM1蛋白的若干单克隆抗体，诸如26H7、5F4、TEC-11、12-140-4、4/3/17、COL-4、F36-54、34B1、YG-C28F2、D14HD11、b18.7.7、D11-AD11、HEA81、B1.1、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、B1.13、YG-C94G7、12-140-5、TET-2以及scFv-DIATHIS1(Watt等Blood,2001,98卷,1469-1479页)。WO 2010/12557描述抗人类CEACAM1的鼠源单克隆抗体。WO 2013/054331描述抗人类CEACAM1CM10的嵌合单克隆抗体。

程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)是属于免疫受体CD28/CTLA-4家族的I类跨膜蛋白，所述免疫受体介导用于调节免疫反应的信号。人类PD-1已被分配SwissProt登记号Q15116。CD28/CTLA-4家族的成员上调(CD28和ICOS)或下调T细胞的激活(CTLA-4和PD-1)。PD-1在激活的T细胞、B细胞、骨髓细胞以及部分胸腺细胞表达。已知抗PD-1蛋白的若干单克隆抗体，诸如MK-3475(人源化IgG4mAb)、AMP514、BMS-936558(完整人类IgG4mAb)以及pidilizumab，也被称为CT-011(人源化IgG1mAb)(Topalian等Curr.Opin.Immunol.,2012,24(2)卷,207-212页)。

程序性细胞死亡配体1(PD-L1)也被称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，是一种在人类中被CD274基因编码的蛋白。PD-L1是40kDa 1类膜蛋白，已被推测在特殊事件诸如怀孕、组织移植以及其他疾病状态诸如肝炎期间，在抑制免疫系统中发挥主要作用。通常地，免疫系统对在淋巴结或脾脏中有一些积累的外源抗原做出反应，所述外源抗原引起抗原特异的CD8⁺T细胞的增殖。PD-1/PD-L1配体复合物的形成传递减少这些CD8⁺T细胞在淋巴结的增殖的抑制信号，并且对PD-1的补充也能够通过凋亡控制在淋巴结中的外源抗原特异的T细胞的积累，所述凋亡进一步被基因Bcl-2的下调介导(Chemnitz>

PD-1和其配体PD-L1和PD-L2传递抑制信号调节在T细胞激活、耐受性和免疫病理学之间的平衡。对外源和自身抗原的免疫反应需要对清楚的病原体和肿瘤的特异和平衡的反应并且也保持耐受性。人类PD-L1和PD-L2已被各自分配SwissProt登记号Q9NZQ7和Q9BQ51。T细胞耐受性的诱导和维持需要PD-1，并且在非造血细胞上的PD-1配体PD-L1可限制效应T细胞反应并且保护组织免受免疫介导的组织损伤。PD-1:PD-L途径也已被微生物和肿瘤侵占以减少抗微生物或肿瘤的免疫从而有利于慢性感染和肿瘤生存。抗PD-L1蛋白的若干单克隆抗体是已知的，诸如MEDI-4736、BMS-936559、MSB0010718C和MPDL3280A(Lu等J.Oncol.Pharm.Pract.,2014)。抗PD-L2蛋白的其他的单克隆抗体也是已知的，诸如在PCT申请公布号WO/2010/027827、WO/2010/036959和WO/2011/066342公开的单克隆抗体。WO/2014/059251涉及用于在受试者中通过施用CEACAM1、PD-1和/或潜伏相关肽(LAP)中的两种或更多种的抑制物增强免疫反应和/或减少T细胞耐受性的组合物和方法。

癌症的免疫疗法是使用免疫系统用于治疗癌症。存在三种主要的免疫疗法组：基于细胞的疗法、抗体疗法和细胞因子疗法。它们都利用癌细胞在其表面经常具有可被免疫系统检测到的不同的分子的事实。这些分子称为癌症抗原。免疫疗法通过使用这些癌症抗原作为靶，被用于驱使免疫系统攻击肿瘤细胞。

抗体疗法是当前免疫疗法的最成功形式，具有许多对大范围癌症的被批准的治疗。抗体是由免疫系统产生的结合细胞表面靶抗原的蛋白。正常生理中，抗体被免疫系统用于对抗病原体。每种抗体特异于一种或数种高度相似的类似蛋白并且结合癌症抗原的抗体被用于治疗癌症。一旦与癌症抗原结合，抗体可诱导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，激活补体系统，阻止受体与其配体相互作用或传递化学疗法或辐射的有效负荷，所有这些都可导致细胞死亡。存在目前已被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗癌症的抗体：利妥昔单抗(Rituximab)(1997)、曲妥单抗(Trastuzumab)(1998)、吉妥单抗奥佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)(2000)、阿伦单抗(Alemtuzumab)(2001)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(2002)、托西莫单抗(Tositumomab)(2003)、西妥昔单抗(Cetuximab)(2004)、贝伐单抗(Bevacizumab)(2004)、帕尼单抗(Panitumumab)(2006)、Ofatumumab(2009)、Ipilimumab(2011)和Brentuximab vedotin(2011)。

虽然最初被批准作为抗癌症的单一疗法，若干抗体进一步被批准与其他抗癌症疗法诸如化学疗法组合使用。例如，FDA批准利妥昔单抗(Rituxan,Genentech,Inc.)与氟达拉滨和环磷酰胺组合用于治疗之前未经治疗的和之前经过治疗的慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者。近期，FDA批准贝伐单抗(Avastin,Genentech,Inc.)与紫杉醇和顺铂或托泊替康组合用于治疗顽固性、复发性或转移性宫颈癌。

对采用针对癌症进程的不同或平行机制的各种抗体的改进的组合的基于抗体的疗法存在未满足的需要。

发明概述

本发明提供改进的组合的基于抗体的疗法，采用靶向癌症进程的不同或平行机制的多种抗体。本发明起源于惊人的发现：抗CEACAM1的抗体和针对破坏PD-1与其天然配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体的组合，显著地并且协同地提高淋巴细胞诸如肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞对于不同类型癌症的细胞毒性。现在首次公开，将淋巴细胞用这两类抗体逐步预孵育，而非并行孵育，使淋巴细胞介导的细胞毒性最大化。这个出乎意料的发现可被有利地开发用于改善不同抗体被分开施用至癌症患者以使效力最大化的临床结果。另一惊人的发现是，通过抗CEACAM1抗体阻断CEACAM1增加癌细胞上PD-L1的表达。而且，首次在免疫活性(immuno-competent)小鼠模型中发现抗CEACAM1抗体与针对破坏PD-1与其天然配体PD-L1和PD-L2结合的抗体的抗体组合协同地减弱已建立的肿瘤的进程。

因此本发明在一方面提供，包含抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1和PD-L2中的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在另一方面，本发明还提供包含抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含能够抑制或阻断人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和其配体间相互作用的单克隆抗体或抗原结合片段的药物组合物，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在另一方面，本发明还提供抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段、和能够抑制或阻断人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)和其配体间的相互作用的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在又另一方面，本发明还提供一种用于治疗患癌症的患者的方法，所述方法包括向患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2中的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，由此治疗癌症。

在另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含含有抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2中的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在另一方面，本发明提供上述试剂盒，用于治疗癌症。

在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够以至少约10^-8M的亲和力结合人类CEACAM1蛋白。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够以至少约5×10^-7M的亲和力结合人类CEACAM3和人类CEACAM5蛋白的至少一种。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体选自由以下组成的组：CM-24、26H7、5F4、TEC-11、12-140-4、4/3/17、COL-4、F36-54、34B1、YG-C28F2、D14HD11、b18.7.7、D11-AD11、HEA81、B1.1、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、B1.13、YG-C94G7、12-140-5、scFvDIATHIS1、TET-2、其抗原结合片段以及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在特定的实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体是CM-24或其抗原结合片段，或其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段包含至少一个重链CDR和至少一个轻链CDR，所述至少一个重链CDR包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述至少一个轻链CDR包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段包含至少两个重链CDR和至少一个轻链CDR，所述至少两个重链CDR包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3，所述至少一个轻链CDR包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段，包含来源于选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组的序列的至少五个连续的氨基酸的至少一个重链CDR序列，和来源于选自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组的序列的至少五个连续的氨基酸的至少一个轻链CDR序列。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的6个CDR组成。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:1显示的序列的重链CDR1、含有SEQ ID NO:2显示的序列的重链CDR2、含有SEQ ID NO:3显示的序列的重链CDR3、含有SEQ ID NO:4显示的序列的轻链CDR1、含有SEQ ID NO:5显示的序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO:6显示的序列的轻链CDR3，以及其类似物和衍生物。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:7显示的序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8显示的序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:9显示的序列的重链CDR3。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13显示的序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:14显示的序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:15显示的序列的重链CDR3。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:10显示的序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:11显示的序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:12显示的序列的轻链CDR3。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:16显示的序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO:17显示的序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:18显示的序列的轻链CDR3。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的CDR序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的CDR序列。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:25显示的序列的重链可变域序列，或与所述重链序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:26显示的序列的轻链可变域序列，或与所述轻链序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:25显示的序列的重链可变域和具有SEQ ID NO:26显示的序列的轻链可变域，或与抗体或片段序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：

i.选自由以下组成的组的框架序列：小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3；和

ii.具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的序列的6个CDR；或具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的序列的6个CDR；和与所述CDR序列具有至少97％序列同一性的其类似物和衍生物，其中单克隆抗体或片段以至少约5×10^-7M的亲和力结合至少两个CEACAM亚型。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的人类来源恒定区：人类IgG1、人类IgG2和人类IgG3。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含人类IgG1亚型的恒定区子集。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的序列的6个CDR；或具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的序列的6个CDR；和与所述CDR序列具有至少95％序列同一性的其类似物和衍生物，其中单克隆抗体以至少约10^-8M的亲和力结合CEACAM1。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27显示的重链序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28显示的轻链序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27显示的重链序列以及SEQ ID NO:28显示的轻链序列。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段至少包含抗原结合部分，所述抗原结合部分能够结合CEACAM1分子上具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的6个CDR序列、或具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的6个CDR序列的单克隆抗体结合的相同表位。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段分别与具有序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:32)和YPNASLLIQNVT(SEQ ID NO:33)的人类CEACAM1的位于残基17-29和68-79内的表位反应。

在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与包含序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)的至少四个氨基酸的表位反应。在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与包含在序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)和YPNASLLIQNVT(SEQ ID NO:30)内的氨基酸残基的表位反应。在某些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段与在序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)和PNASLLI(SEQ ID NO:31)内的表位反应。

在某些实施方案中，所述抗原结合片段保持相应全长抗体对所示表位或抗原亲和力的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些实施方案中，所述抗原结合片段保持相应全长抗体对所示表位或抗原亲和力的至少50％。在某些实施方案中，所述抗原结合片段保持相应全长抗体对所示表位或抗原亲和力的至少90％。

在一些实施方案中，所述抗人类PD-1的单克隆抗体选自由以下组成的组：MK-3475、AMP514、BMS-936558、CT-011、其抗原结合片段及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述抗人类PD-L1的单克隆抗体选自由以下组成的组：MEDI-4736、BMS-936559、MSB0010718C、MPDL3280A、其抗原结合片段及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是AMP-224。

在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体是人类或人源化的单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体是人类或人源化的单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体是人类或人源化的单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体是人类或人源化的单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些实施方案中，人类抗体是分离的人类抗体，即从人类供体分离的。在某些实施方案中，人类抗体是从杂交瘤细胞系分离的人类抗体。在某些实施方案中，人类抗体指的是重组的人类抗体，即通过重组DNA技术产生的。

在某些实施方案中，以上描述的药物组合物还包含一个淋巴细胞或多个淋巴细胞。

在一些实施方案中，所述淋巴细胞表达CEACAM1、PD-1或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些此类实施方案中，所述淋巴细胞表达CEACAM1和PD-1。

在一些实施方案中，所述淋巴细胞选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、T细胞、B细胞、NK细胞及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些此类实施方案中，所述淋巴细胞选自由肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞组成的组。在某些此类实施方案中，所述淋巴细胞是一个肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞或多个TIL细胞。在某些此类实施方案中，所述淋巴细胞是一个淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞或多个LAK细胞。

在某些实施方案中，所述淋巴细胞是激活的。在一些实施方案中，所述淋巴细胞对癌细胞是细胞毒性的。

在一些实施方案中，所述癌细胞表达CEACAM1、PD-L1、PD-L2或其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述癌细胞表达CEACAM1、PD-L1或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述癌细胞表达CEACAM1、PD-L2或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这类实施方案中，所述癌细胞表达CEACAM1和PD-L1和PD-L2。

在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤癌、淋巴瘤癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、白血病、骨髓癌、卵巢癌、子宫癌、肉瘤、胆囊癌以及子宫内膜细胞癌。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述癌症选自由黑素瘤癌和淋巴瘤癌组成的组。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述癌症是黑素瘤癌。在一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤癌。

在一些实施方案中，抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2中的至少一种的单克隆抗体能够抑制或阻断人类PD-1和其配体间的相互作用。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，和包含抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，和包含抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，所述方法包含向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，和包含抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是同时完成的。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是顺序完成的。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是同时完成的。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是顺序完成的。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。

在一些实施方案中，以上所述的方法还包括向所述患者施用包含淋巴细胞的药物组合物的步骤。在所述方法的一些实施方案中，包含淋巴细胞的药物组合物与包含抗体的药物组合物的至少一种的施用同时完成。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用顺序完成。

在一些实施方案中，在施用之前，所述淋巴细胞用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段或用抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这样的实施方案中，在施用之前，所述淋巴细胞用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育。在其他某些这样的实施方案中，在施用之前，所述淋巴细胞用抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育，且然后用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段培养。

在一些实施方案中，选自由抗CEACAM1、抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2组成的组的至少两种不同抗体被包含在至少两种不同的药物组合物中。在一些实施方案中，选自由抗CEACAM1、抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2组成的组的至少一种抗体和至少一个淋巴细胞被包含在同一药物组合物中。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在某些实施方案中，包含抗体或其抗原结合片段的每种药物组合物被包含在试剂盒内的单独容器内。

在某些实施方案中，所述试剂盒还含有包含淋巴细胞的药物组合物。在某些这样的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这样的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些这样的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有试剂盒的使用说明。

附图简述

图1A-B.人类黑素瘤癌细胞经IFN-γ激活表达CEACAM1和PD-L1。MALME 3M细胞用IFN-γ孵育24小时，且用PE缀合的抗PD-L1抗体(空直方图)或同种型对照匹配的抗体(满的直方图)(A)，或用PE缀合的抗人类CEACAM1单克隆抗体(空直方图)或同种型对照匹配的抗体(满的直方图)(B)通过FACS分析。

图2A-B.人类TIL细胞表达PD-1和CEACAM1。TIL细胞被用抗人类PD-L1的单克隆抗体染色且被FACS分析。呈现了PD-1(空直方图)相比于匹配的同种型对照抗体(满的直方图)的表达(A)，或用PE缀合的抗人类CEACAM1单克隆抗体(空直方图)或同种型对照匹配的抗体的表达(满的直方图)(B)。

图3.抗CEACAM1和抗PD-1的抗体对人类TIL细胞针对人类黑素瘤癌细胞的细胞毒性的协同效应。人类黑素瘤癌细胞在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-1表达。TIL细胞用各种浓度的抗人类CEACAM1(虚黑线，球形标记)的单克隆抗体、抗人类PD-1(实灰线，矩形标记)的单克隆抗体或两种抗体的组合(实黑线，三角形标记)孵育。IFN-γ处理的黑素瘤癌细胞被添加用于过夜孵育。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性％±SE的平均值。*P<0.05相比于仅抗人类CEACAM1的单克隆抗体的成对T检验。

图4A-B.当在添加抗CEACAM1抗体之前添加抗PD-1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-1的抗体对颗粒酶B水平和人类TIL细胞针对人类黑素瘤癌细胞的细胞毒性的协同效应。人类黑素瘤癌细胞在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-1表达。人类TIL细胞用仅培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(白色)、各种浓度的抗人类CEACAM的单克隆抗体(垂直线)、抗人类PD-1(水平线)的单克隆抗体或两种抗体的组合(点)孵育。

抗人类PD-1的单克隆抗体被首先在37℃添加持续30分钟，然后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。IFN-γ处理的MALME 3M细胞被添加用于过夜孵育。(A)结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性％±SE的平均值。*P≤0.05相比于仅抗PD-1(a-PD-1)的成对T检验。(B)结果代表由来自每个处理三个重复孔的被商用颗粒酶B ELISA试剂盒确定的颗粒酶B水平±SE。

图5A-B.当在添加抗CEACAM1抗体之前添加抗PD-L1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-L1的抗体对颗粒酶B水平和人类TIL细胞针对人类黑素瘤癌细胞的细胞毒性的协同效应。人类黑素瘤癌细胞在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-1表达。人类TIL细胞用仅培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(白色)、各种浓度的抗人类PD-L1的单克隆抗体(水平线)、抗人类CEACAM1的单克隆抗体(垂直线)或两种抗体的组合(点)孵育。抗PD-L1的单克隆抗体被首先在37℃添加持续30分钟，然后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。在细胞毒性评估前，IFN-γ处理的MALME 3M细胞被添加用于过夜培养。(A)结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性％±SE的平均值。(B)结果代表由来自每个处理三个重复孔的被商用颗粒酶BELISA试剂盒确定的颗粒酶水平±SE。*P≤0.05相比于仅抗PD-L1(a-PD-L1)的成对T检验。

图6.当在添加抗CEACAM1抗体之前添加抗PD-1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-1的抗体对人类LAK细胞针对人类黑素瘤癌细胞的细胞毒性的协同效应。人类黑素瘤癌细胞在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-L1表达。通过用IL-2激活来自健康人供体的PBMC产生的人类LAK细胞用仅培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(白色)、各种浓度的抗人类CEACAM1的单克隆抗体(垂直线)、抗人类PD-1的单克隆抗体(水平线)或两种抗体的组合(点)孵育。抗人类PD-1的单克隆抗体被首先在37℃添加持续30分钟，然后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。IFN-γ处理的SKMEL28细胞被添加用于24小时孵育。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性％±SE的平均值。*P≤0.05相比于仅抗PD-1(a-PD-1)的成对T检验。组合系数(combination index)被如以上所述计算。

图7A-B.用抗CEACAM1的抗体处理增加靶癌细胞上的PD-L1表达。NK细胞(NK92MI)用或不用抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)(10μg/ml)孵育，然后添加人类黑素瘤癌细胞(SKMEL28)。所述细胞被孵育24、48和72小时，且在每个时间点PD-L1水平通过FACS分析被测量。A.在不同的时间点对于指定的处理抗PD-L1相比于合适的同种型对照的平均比率。B.48小时后PD-L1表达水平的代表性FACS分析。

图8.抗CEACAM1和抗PD-1的抗体在免疫活性小鼠中对肿瘤进程的协同效应。鼠淋巴瘤细胞被皮下植入BALB/C小鼠的腹腔(第1天)。第10、15和20天，小鼠被静脉施以PBS(虚黑线、空圆)、抗鼠CEACAM1抗体(实灰线、灰色矩形)、抗鼠PD-1抗体(实灰线、灰色三角形)或两种抗体的组合(实黑线、黑色球形)。实验终止于第22天。

图9A-D.个体肿瘤进展曲线。用PBS(A)、抗鼠CEACAM1抗体(B)、抗鼠PD-1抗体(C)或两种抗体的组合(D)处理的小鼠的个体肿瘤进展曲线。

发明详述

本发明起源于惊人的发现：抗CEACAM1抗体和针对破坏PD-1与其天然配体PD-L1和PD-L2结合的抗体的组合显著地提高淋巴细胞诸如肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞针对不同类型癌症的细胞毒性。还惊人地发现，将淋巴细胞用这些抗体进行步进式预孵育，而不是同时孵育，使淋巴细胞的细胞毒性最大化。也已发现，癌细胞上的CEACAM1和PD配体的表达是相互关联的，因为抗CEACAM1抗体结合至癌细胞增加PD-L1的表达。另外发现，此类抗体的组合显著地减弱在免疫活性小鼠模型中建立的肿瘤的进程，推测是利用小鼠的天然淋巴环境。

不受限于任何理论或机制，根据本发明的发现设想，通过与其相应配体例如被癌细胞展示的CEACAM1和/或PD-L1和/或PD-L2的相互作用，表达CEACAM1和/或PD-1的淋巴细胞可基本上被抑制。在另一方面，当这些抑制性的相互作用被阻断，这些淋巴细胞在激活后可变成对这些癌细胞有细胞毒性的并且导致杀死恶性细胞。

因此本发明提供药物组合物，所述药物组合物针对阻断两个主要的免疫抑制同型相互作用，CEACAM1^淋巴细胞/CEACAM1^癌细胞和PD-1^淋巴细胞/PD配体^癌细胞，并且增加诊断患癌症的患者身体内抗癌的细胞毒性细胞的水平。不受限于任何理论或机制，猜测本发明的组合物产生“双效”(“two-punch”)组合，其中癌症患者内的抗癌症的细胞毒性淋巴细胞的水平升高，同时其细胞毒性通过以下被保留：与抗CEACAM1抗体和/或抗PD-1/PD-L1/PD-L2抗体的保护性相互作用，结合至由淋巴细胞自身展示的CEACAM1和/或PD-1分子，结合至由癌细胞展示的CEACAM1和/或PD-L1/PD-L2分子或二者。

因此，在一方面，本发明提供包含抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、PD-L1和PD-L2的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在另一方面，本发明还提供包含抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含能够抑制或阻断在人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)与其配体间的相互作用的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在另一方面，本发明还提供抗人类癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1)的单克隆抗体或其抗原结合片段、和能够抑制或阻断在人类程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)与其配体间的相互作用的单克隆抗体或其抗原结合片段，用于通过单独施用在治疗癌症中使用。

在又另一方面，本发明还提供用于治疗患癌症患者的方法，包括向患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物，从而治疗癌症。

此外，在另一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含含有抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和含有抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2的至少一种的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在另一方面，本发明提供以上所述的试剂盒，用于治疗癌症。

如本文所用的术语“单独施用”指不同的治疗剂诸如被包含在单独药物组合物中的抗体。在某些实施方案中，不同的治疗剂或不同的药物组合物被同时或相继地施用至癌症患者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。例如，通过短语“抗人类CEACAM1的单克隆抗体、和抗人类PD-1的单克隆抗体，用于通过单独施用在治疗癌症中使用”意味着抗CEACAM1的抗体被包括在与包含抗PD-1抗体的组合物不同的组合物中。

术语“CEACAM1”被用于指CEACAM1基因例如NP_001020083.1、NP_001703.2的蛋白产物。在人类中，到目前为止已检测到11种不同的CEACAM1剪接变体。关于细胞外免疫球蛋白样结构域的数目(例如，具有四个细胞外免疫球蛋白样结构域的CEACAM1被称为CEACAM1-4)、膜锚定和/或其胞质尾区的长度(例如，具有长胞质尾区的CEACAM1-4被称为CEACAM1-4L而具有短胞质尾区的CEACAM1-4被称为CEACAM1-4S)，个体的CEACAM1亚型不同。CEACAM1的N末端结构域紧随信号肽之后开始并且其结构被认为是IgV类型。例如在CEACAM1注释号P13688中，N末端IgV类型结构域包括从氨基酸35至142的108个氨基酸。这个结构域被鉴定对于亲同种抗原的结合活性起作用(Watt等2001,Blood.98,1469-79)。所有变体，包含这些剪接变体被包括在术语“CEACAM1”内。

如本文所用的术语“药物组合物”指包含至少一种生物活性成分的组合物。抗体、其抗原结合片段和淋巴细胞是生物活性成分的非限制性实例。

术语“抗体”以广义被使用并且包括单克隆抗体(包含全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、免疫调节剂以及尺寸足以保留和表现完整抗体的期望的生物活性的抗体片段。

如可互换使用的术语“免疫调节剂”或“免疫调节蛋白”或“抗体片段”包括通过结合特异性抗原形成复合体来类似于抗体起作用的合成的或遗传工程的蛋白。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段以及轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。片段可被以不同的方式构建以产生多价和/或多特异性结合形式。根据本发明的一种或更多种抗体包括完整的抗体，诸如多克隆抗体或单克隆抗体(mAb)和其蛋白水解的片段诸如Fc、Fab或F(ab′)₂片段。另外被包括在本发明的领域内的是嵌合抗体；人类和人源化抗体；重组和工程的抗体及其片段。

“抗人类CEACAM1的单克隆抗体”、“识别CEACAM1的抗体”、“针对CEACAM1的抗体”或“抗CEACAM1的抗体”是以足够亲和力和特异性结合CEACAM1蛋白的抗体。代表性地，抗人类CEACAM1的单克隆抗体能够以约10^-8或10^-9M的最小亲和力结合CEACAM1。一些单克隆抗CEACAM1抗体能够以约5×10^-7M的最小亲和力结合CEACAM3、5和/或8。在某些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体能够阻止、干扰或解离由淋巴细胞展示的CEACAM1和由癌细胞展示的CEACAM1间的相互作用。

如本文所用的“中和抗体”指对特定受体或配体靶具有抗原结合位点的分子，所述分子能够减少或抑制(阻断)活性或通过受体的信号传导，如按说明书通过体内或体外测定确定的。

如本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本上同型的抗体获得的抗体，即构成群体的单独的抗体是相同的，除了可能以小量存在的可能自然发生的突变外。单克隆抗体是高度特异的，针对单一抗原。而且，与代表性地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰词“单克隆”不解释为要求以任何特定的方法产生抗体。单克隆抗体可通过本领域技术人员已知的方法获得。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过第一次被Kohler等Nature 1975,256,495描述的杂交瘤的方法制备，或可通过重组DNA的方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等Nature 1991，352，624-628或Marks等J.Mol.Biol.,1991，222:581-597所述的技术从噬菌体抗体库被分离。

如本文所用的术语“多个”指两个或更多个特定的对象。

mAb可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA。产生mAb的杂种瘤可在体外或体内被培养。高效价的mAb可在体内生产获得，其中来自单独杂交瘤的细胞经腹腔地注入原始的初免的BALB/c小鼠以产生含有高浓度期望mAb的腹水。同种型IgM或IgG的单克隆Ab可从上述腹水，或从培养上清液使用本领域技术人员已知的柱层析的方法被纯化。

根据本发明的术语“抗原决定簇”或“表位”指抗原分子特异地与特定的抗体起反应的区域。“抗原”是能够诱发抗体形成和被抗体结合的分子或分子的部分。抗原可具有一个或多于一个表位。根据本发明的抗原是CEACAM1蛋白或其片段。

抗体或免疫球蛋白包括通过二硫键连接在一起的两条重链和两条轻链，每条轻链通过二硫键被连至各自的重链，呈“Y”形结构。蛋白水解消化抗体产生Fv(可变片段)和Fc(结晶片段)结构域。抗原结合结构域Fab包括多肽序列变化的区域。术语F(ab′)₂代表通过二硫键连接在一起的两个Fab′臂。抗体的中央轴被称为Fc片段。每个重链具有在一端的可变结构域(VH)随后是一些恒定结构域(CH)。每个轻链具有在一端的可变结构域(VL)和在另一端的恒定结构域(CL)，轻链的可变结构域与重链的可变结构域对齐且轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。每对轻链和重链的可变结构域形成抗原结合位点。位于轻链和重链的结构域具有同样的通用结构并且每个结构域包含四个序列相对保守，被三个被称为互补决定区(CDR1-3)的高变结构域连接的框架区。这些结构域有助于抗原结合位点的特异性和亲和力。重链的同种型(γ、α、δ、ξ或μ)决定免疫球蛋白类型(分别是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM)。轻链是发现于所有抗体类型中的两种同种型(κ或λ)中的任一种。

如本文所用的术语“抗人类CEACAM1的单克隆抗体”、“抗人类PD-1的单克隆抗体”、“抗PD-L1抗体”和“抗PD-L2抗体”指能够结合其指定靶的完整的免疫球蛋白分子，如IgM、IgD、IgE、IgA或IgG，这些免疫球蛋白分子的抗原结合结构域例如Fab片段、Fab′片段、F(ab)₂片段、嵌合的F(ab)₂或嵌合的Fab′片段、嵌合的Fab片段或分离的VH或CDR区，以及已知的免疫球蛋白的亚型和修饰型例如单链抗体或单链Fv片段(scAB/scFv)或双特异性抗体结构。如本文所用的术语“抗人类CEACAM1抗体”、“抗人类PD-1抗体”、“抗人类PD-L1的单克隆抗体”和“抗人类PD-L2的单克隆抗体”指能够结合其指定靶的抗体，其中这些靶是人类来源的。

如本文可互换使用的术语“抗体的抗原结合片段”和“抗原结合片段”指抗体的一个或更多个保留特异结合所公开的抗原的能力的片段。例如，抗原结合片段可包括但不限于Fab片段、F(ab′)₂片段、scFv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离的CDR。因此，抗人类CEACAM1的单克隆抗体的抗原结合片段可以是例如抗人类CEACAM1的单克隆抗体的Fab片段、或模仿所述Fab片段的序列和结构的任何分子，不需从抗人类CEACAM1的单克隆抗体例如通过化学或酶学分解直接获得。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，一般包含完整抗体的抗原结合位点因此保留结合抗原的能力。被本定义包含的抗体片段的例子包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C末端具有一个或更多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域以及在CH1结构域的C末端的一个或更多个半胱氨酸残基的Fd′片段；(v)具有抗体的单一臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等Nature 1989,341,544-546)；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)₂片段，包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等Science>

术语“单链可变片段(scFv)”意指由短接头(通常是丝氨酸、甘氨酸)连接在一起的免疫球蛋白的重链和轻链可变区的融合物。单链抗体可以是单链复合多肽，具有抗原结合能力并且包含与免疫球蛋白轻链和重链可变区(连接的VH-VL或单链Fv(scFv))同源或类似的氨基酸序列。VH和VL二者都可拷贝天然的单克隆抗体序列或一条或两条链可包含在美国专利5,091,513(其全部内容通过引用被并入本文)中所述的类型的CDR-FR构建体。与轻链和重链的可变区类似的单独的多肽通过多肽接头被连在一起。生产此类单链抗体的方法，特别是当编码VH和VL链的多肽结构的DNA是已知的时，可根据例如在美国专利4,946,778、5,091,513和5,096,815所述的方法被完成，每个专利的全部内容通过引用被并入本文。

单链抗体可以是单链复合多肽，具有抗原结合能力并且包含与免疫球蛋白轻链和重链可变区，即连接的V_H-V_L或单链Fv(scFv)，同源或类似的氨基酸序列。

如本文所用的术语“具有抗体的抗原结合部分的分子”意指不仅包括任何同种型和通过任何动物细胞系或微生物产生的完整的免疫球蛋白分子而且包括其抗原结合活性部分，包括但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微型抗体(参见WO>

如本文所用的术语“抗原”指能够诱发抗体形成和/或被抗体结合的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多于一个表位。例如，蛋白CEACAM1、PD-1、PD-L1和/或PD-L2的每个被认为是本发明的抗原。在优选的实施方案中，抗原是人类抗原。

如本文所用的术语“能够抑制或阻断PD-1和其配体间相互作用的抗体”指干扰、抑制、减少、消除或阻止PD-1分子(例如由淋巴细胞展示的)与PD-L1和/或PD-L2分子(例如由癌细胞展示的)间相互作用的任何抗体或其抗原结合片段，所述干扰、抑制、减少、消除或阻止任选地通过化学地和/或物理地与PD-1和/或PD-L1和/或PD-L2相互作用。

如本文所用的术语“治疗癌症”是指对被诊断患有癌症的患者施用治疗有效量的药剂诸如抗体和/或淋巴细胞以抑制患者中恶性细胞的进一步生长、抑制患者中恶性细胞的扩散，和/或导致患者中恶性细胞死亡。因此，在某些实施方案中，治疗癌症意思是减弱肿瘤的进程，抑制患者中恶性细胞的扩散，导致患者中恶性细胞死亡和其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些实施方案中，治疗癌症意思是减弱肿瘤的进程，导致患者中恶性细胞死亡，或二者。

术语“治疗有效量”指对于治疗哺乳动物中的疾病或紊乱有效的药物量。在癌症的情况，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；减少肿瘤的大小；抑制(即减慢至某种程度并且优选地停止)癌细胞浸润至外围器官；抑制(即减慢至某种程度并且优选地停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长，至某些程度；和/或减轻与紊乱相关的一种或更多种症状至某些程度。关于药物可阻止现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度，可以是抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，在体内的效价例如可通过评估存活的持续时间、疾病进程的时间(TTP)、反应速度(RR)、反应的持续时间、和/或生活质量来测量。

术语“癌症”和“癌的”指或描述在哺乳动物中其典型特征是不受调节的细胞生长的生理状况。癌症的例子包括但不限于上皮细胞癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更具体的例子包括黑素瘤癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓癌、卵巢癌、子宫癌、肉瘤、胆囊癌或子宫内膜癌。

术语“抗肿瘤组合物”指包含能够抑制或阻止肿瘤生长或功能，和/或导致肿瘤细胞被摧毁的至少一种活性治疗剂的在治疗癌症中有用的组合物。适合在用于治疗癌症的抗肿瘤组合物中的治疗试剂包括但不限于化学治疗剂、放射性同位素、毒素、细胞因子诸如干扰素和靶向与肿瘤细胞相关的细胞因子、细胞因子受体或抗原的拮抗试剂。

如本文所用的术语“试剂盒”指试剂和其他材料的组合。预期试剂盒可包括试剂诸如抗体、抗体混合物、缓冲液、稀释剂和其他水性溶液、和/或一种或更多种储存小瓶或其他容器。术语“试剂盒”并不意图被限于试剂和/或其他材料的特定组合。

本发明还提供药物组合物，所述药物组合物针对于同时地阻断两个主要的免疫抑制相互作用：CEACAM1^淋巴细胞/CEACAM1^癌细胞和PD-1^淋巴细胞/PD配体^癌细胞。因此在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段、抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段、抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一个方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1单克隆抗体或其抗原结合片段、和选自由以下组成的组的单克隆抗体：抗人类PD-1抗体或其抗原结合片段、抗人类PD-L1抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L2抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段、抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段、抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

短语“多种药物组合物(pharmaceutical compositions)包含抗体A和抗体B”指至少两种单独的药物组合物，每种包含至少一种与在另一种药物组合物中包含的抗体不同的抗体。短语“一种药物组合物(pharmaceuticalcomposition)包含”指包含至少两种不同抗体的单一药物组合物。

针对CEACAM1蛋白的许多单克隆抗体是已知的，其所有的被认为适合用于本发明的组合物和方法。然而，在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体选自由以下组成的组：CM-24、26H7、5F4、TEC-11、12-140-4、4/3/17、COL-4、F36-54、34B1、YG-C28F2、D14HD11、b18.7.7、D11-AD11、HEA81、B1.1、CLB-gran-10、F34-187、T84.1、B6.2、B1.13、YG-C94G7、12-140-5、scFv DIATHIS1和TET-2、其抗原结合片段和其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在特定的实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体是CM-24、其抗原结合片段和其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

使用两种不同的算法方法鉴定CM-24的CDR区段：

1.IMGT算法(Lefranc等1999,Nucleic Acids Research,27,209-212)；

2.KABAT算法(Wu T.T.和Kabat E.A.,1970,J.Exp.Med.132,211-250)。

表1总结了使用上述两种方法确定的CDR序列和最小共有序列和使用两种方法鉴定的序列的组合序列。

表1.CDR序列

*其中X₁不存在或是Thr(T)并且X₂不存在或是Ile(I)。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段包括包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的序列的

至少一个重链CDR，和包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6组成的组的序列的至少一个轻链CDR。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段包括包含选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成的组的序列的至少两个重链CDR，和包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6组成的组的序列的至少一个轻链CDR。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段包括，来源于选自由SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21组成的组的序列的至少五个连续的氨基酸的至少一个重链CDR序列，和来源于选自由SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24组成的组的序列的至少五个连续的氨基酸的至少一个轻链CDR序列。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18的6个CDR组成。在一些实施方案中，识别CEACAM1的单克隆抗体或其片段的结合位点由SEQ ID NO:19、20、21、22、23和24的6个CDR组成。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:1显示的序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:2显示的序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:3显示的序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:4显示的序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:5显示的序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:6显示的序列的轻链CDR3、及其类似物和衍生物。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:7显示的序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:8显示的序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:9显示的序列的重链CDR3。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13显示的序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO:14显示的序列的重链CDR2和具有SEQ ID NO:15显示的序列的重链CDR3。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:10显示的序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO:11显示的序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:12显示的序列的轻链CDR3。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:16显示的序列的轻链CDR1、具有SEQ IDNO:17显示的序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO:18显示的序列的轻链CDR3。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的CDR序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的CDR序列。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:25显示的序列的重链可变结构域序列、或与所述重链序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQID NO:26显示的序列的轻链可变结构域序列、或与所述轻链序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:25显示的序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:26显示的序列的轻链可变结构域、或与抗体或片段序列具有至少97％序列同一性的其类似物或衍生物。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：

i.选自由以下组成的组的框架序列：小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3；和

ii.具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的序列的6个CDR；或具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的序列的6个CDR；及与所述CDR序列具有至少97％序列同一性的其类似物和衍生物，其中所述单克隆抗体或片段以至少约5×10^-7M的亲和力结合至少两种CEACAM亚型。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的人类来源的恒定区：人类IgG1、人类IgG2和人类IgG1。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含人类IgG1亚型的恒定区子集。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的序列的6个CDR；或具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的序列的6个CDR；及与所述CDR序列具有至少95％序列同一性的其类似物和衍生物，其中所述单克隆抗体以至少约10^-8M的亲和力结合CEACAM1。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27显示的重链序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源化单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:28显示的轻链序列。在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的人类或人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27显示的重链序列和SEQ ID NO:28显示的轻链序列。

在某些实施方案中，识别人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段至少包含抗原结合部分，所述抗原结合部分能够结合CEACAM1分子上具有SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12显示的序列的6个CDR序列或具有SEQ ID NO:13、14、15、16、17和18显示的序列的6个CDR的单克隆抗体结合的表位的相同表位的抗原结合部分。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与位于人类CEACAM1的残基17-29和68-79内分别具有序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:32)和YPNASLLIQNVT(SEQ ID NO:33)的表位反应。

在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与包含序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)中的至少四个氨基酸的表位反应。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与包含序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)和YPNASLLIQNVT(SEQ ID NO:30)中的氨基酸残基的表位反应。在某些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合片段与在序列VLLLVHNLPQQLF(SEQ ID NO:29)和PNASLLI(SEQID NO:31)内的表位反应。

在某些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够以至少约10^-8M的亲和力结合人类CEACAM1蛋白。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段能够以至少约5×10^-7M的亲和力结合人类CEACAM3和人类CEACAM5蛋白中的至少一个。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

一些抗PD-1蛋白的单克隆抗体是已知的，其全部被认为适合用于在本发明的组合物和方法中使用。然而，在一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体选自由以下组成的组：MK-3475、AMP514、BMS-936558、CT-011、其抗原结合片段及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

一些抗PD-L1蛋白的单克隆抗体是已知的，其全部被认为适合用于在本发明的组合物和方法中使用。然而，在一些实施方案，抗人类PD-L 1的单克隆抗体选自由以下组成的组：MEDI-4736、BMS-936559、MSB0010718C、MPDL3280A、其抗原结合片段及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。根据本发明的抗体的非限制性实例是AMP-224，也被称为B7-DCIg，其是在PCT申请公布号WO/2010/027827和WO/2011/066342中所述的，PD-L1可溶受体和抗体的Fc结构域的融合蛋白。

一些抗PD-L2蛋白的单克隆抗体是已知的，诸如之前在PCT申请公布号WO/2010/036959中公开的那些，其全部被认为适合用于在本发明的组合物和方法中使用。

当开发特定抗体的过程涉及在非人类免疫系统(诸如小鼠免疫系统)生成时，产生的抗体的蛋白序列与在人类天然产生的同源抗体部分地不同，因此当向人类患者施用时，可能是免疫原性的。

因此，为了避免当向人类患者施用时的免疫原性，在一些实施方案中，抗人类CEACAM1的单克隆抗体是人类或人源化单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体是人类或人源化单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体是人类或人源化单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体是人类或人源化单克隆抗体。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

如本文所用的术语“人类抗体”意指包括具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人类抗体可，例如在CDR中，包括不被人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机诱变或定点诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”并不意指包括这样的抗体：其中来自于另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已被接枝至人类框架序列。在某些实施方案中，术语“人类抗体”指分离的人类抗体，即从人类供体分离的。在某些实施方案中，术语“人类抗体”指从杂交瘤细胞系分离的人类抗体。在某些实施方案中，术语“人类抗体”指重组的人类抗体，即通过重组DNA技术产生的。

“人类抗体”指具有对应于由人类产生的和/或使用如本文公开的用于制备人类抗体的任何技术被制备的抗体的氨基酸序列的抗体。人类抗体的这个定义特别的排除了包含非人类抗原结合残基的人源化抗体。人类抗体可使用在本领域已知的各种技术被生产。在一个实施方案，人类抗体选自表达人类抗体的噬菌体库(Vaughan等Nature Biotechnology 199614,309-314；Sheets等PNAS(USA),1998,95,6157-6162；Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,1991,227,381；Marks等J.Mol.Biol.,1991,222,581)。人类抗体也可通过向转基因动物例如内源的免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠，引入人类免疫球蛋白基因座被制备。攻击后，观察到人类抗体的生产，人类抗体的生产在所有的方面包括基因重排、组装和抗体库与在人类中观察的极其类似。方法被描述在例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和下列科学出版物：Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)；Lonberg等Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等NatureBiotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。可选地，人类抗体可由针对靶抗原产生抗体的人类B淋巴细胞的永生系制备(所述B淋巴细胞可从个体回收或可在体外被免疫)。参见Cole等MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerne等J.Immunol.,147(1):86-95(1991)和美国专利号5,750,373。

如本文所用的术语“重组的人类抗体”意指包括通过重组途径被制备、表达、创造或分离的所有人类抗体，诸如使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组的、合并的人类抗体文库分离的抗体，从人类免疫球蛋白转基因的动物中(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.,等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过包括剪接人类免疫球蛋白基因序列成其他DNA序列的任何其他途径被制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组的人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中，然而，这种重组的人类抗体经受体外诱变(或当使用人类Ig序列转基因的动物时，在体内体细胞诱变)因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人类种系VH和VL序列并且与人类种系VH和VL序列有关，可能并非在体内的人类抗体种系库中天然存在的序列。

如本文所用的术语“人源化抗体”意指包括具有来源于非人类物种免疫球蛋白的CDR(互补决定区)且抗体分子的其余部分主要来源于人类免疫球蛋白的抗体。

非人类(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大多数部分，人源化抗体是这样的人类免疫球蛋白(受体抗体)：来自受体的高变区的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和容量的非人类物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人类的灵长类的高变区的残基(供体抗体)替换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰被进行以便进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体包含至少一个、代表性的两个可变结构域的基本上全部，其中所有的或基本上全部的高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环并且所有的或基本上所有的FR是人类免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，代表性地人类免疫球蛋白的Fc。关于进一步的细节参见Jones等Nature 1986,321,522-525；Riechmann等Nature 1988,332,323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992 2,593-596。

如本文所用的术语“重组的人类抗体”意指包括通过重组途径被制备、表达、创造或分离的所有人类抗体，诸如使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组的、合并的人类抗体库分离的抗体，从人类免疫球蛋白基因转基因的动物中(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.,等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过包括剪接人类免疫球蛋白基因序列成其他DNA序列的任何其他途径被制备、表达、创造或分离的抗体。这种重组的人类抗体具有来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在某些实施方案中，然而，这种重组的人类抗体经受体外诱变(或当使用人类Ig序列转基因的动物时，在体内体细胞诱变)因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然来源于人类种系VH和VL序列并且与人类种系VH和VL序列有关，可能并非在体内的人类抗体种系库中天然存在的序列。

不限于任何机制或理论，表明由本发明的抗体组合既在体外也在体内显示的基本的抗癌症的细胞毒性效应可被外源的淋巴细胞强化。因此，在某些实施方案中，以上所述的药物组合物还包含一个或更多个淋巴细胞。

如本文所用的术语“淋巴细胞”(“lymphocyte cell”或“lymphocyte”)指自然杀伤(NK)细胞(通常参与细胞介导的、细胞毒性先天免疫)、T细胞(通常参与细胞介导的、细胞毒性适应性免疫)、B细胞(通常参与体液、抗体驱动的适应性免疫)、其多个和其任何组合中的任何一个。外周血单核(PBMC)细胞、肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞和淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞(通常参与肿瘤细胞的杀伤)也被认为是淋巴细胞。淋巴细胞的非限制性实例包括细胞毒性淋巴细胞(CTL，CD8⁺或CD4⁺)、NK细胞(CD2⁺)和T辅助细胞(CD4⁺)。

术语“淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞”、“淋巴因子激活杀伤细胞”和“LAK细胞”可互换使用并且指已被刺激或激活以杀伤肿瘤细胞，即变成对肿瘤细胞更具细胞毒性的淋巴细胞。由于LAK细胞可从同质或异质细胞群体产生，以上术语还指被刺激或激活以变成对肿瘤细胞更具细胞毒性的同质或异质细胞群体。在特定的实施方案中，LAK细胞通过IL-2由PBMC细胞产生。

以前已经很好地确立，已知的淋巴细胞激活试剂诸如IL-2、干扰素γ(IFN-γ)和/或抗CD-3单克隆抗体能够转化淋巴细胞诸如PBMC细胞变成更具细胞毒性，由此既在体外也在体内产生被称为“激活的细胞毒性淋巴细胞”、“激活的淋巴细胞”、“细胞毒性淋巴细胞”或“激活的淋巴细胞”的细胞群。本发明和其他对本领域的一般技术人员提供关于如何激活PBMC产生多种激活的细胞毒性淋巴细胞而不产生毒副作用的丰富的指导。例如，Stephen E.Ettinghausen和同事已经确立，系统施用重组的IL-2在体内刺激组织中的淋巴样细胞的增殖(Stephen E.Ettinghausen等TheJournal of Immunology,1985,135卷,No.2,第1488-1497页)，且重组的IL-2在体内刺激过继性转移的LAK细胞的增殖(Stephen E.Ettinghausen等TheJournal of Immunology,1985,卷135,No.5,第3623-3635页)。Joseph H.Phillips和同事已经确定，在患晚期结肠癌、恶性黑素瘤癌或肾细胞癌的患者中连续施用100,000U IL-2/kg/q8足以使PBMC细胞变成LAK细胞(J.Clin.Oncol.,1987,卷5,第1933-1941页)。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞是在体外激活的已获得非特异性抗肿瘤细胞毒性的人类CD8T细胞，因此代表具有双重T细胞和NK细胞表型的细胞群体。由于CIK细胞的体内瘤内归巢和缺少移植物抗宿主(GVH)反应性，CIK细胞在自体或异体背景下，已经被广泛地用于癌症患者。M.Introna等(Immunology Letters,2013,卷155,第27-30页)提供了CIK细胞主要的生物学特征和其最主要的临床结果的总结。

在一些实施方案中，淋巴细胞表达CEACAM1、PD-1或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些所述实施方案中，淋巴细胞表达CEACAM1和PD-1。

在一些实施方案中，淋巴细胞选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、T细胞、B细胞、NK细胞以及其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这类实施方案中，淋巴细胞选自由肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)组成的组。在这类所述实施方案中，淋巴细胞是一个肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞或多个TIL细胞。在某些这类实施方案中，淋巴细胞是一个淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)或多个LAK细胞。

不限于任何机制或理论，表明由本发明的淋巴细胞在体外显示的期望的抗癌症的细胞毒性效应通过使用激活的淋巴细胞可被最大化。因此，在某些实施方案中，所述淋巴细胞是被激活的。

如本文所用的术语“激活的”指呈现细胞毒性活性，例如对抗癌细胞系诸如人类黑素瘤癌细胞(MALME 3M或SKMEL28)，或呈现升高的颗粒酶B产生水平的任何淋巴细胞。

在一些实施方案中，所述淋巴细胞对癌细胞有细胞毒性。

如本文所用的术语“细胞毒性”指试剂(诸如淋巴细胞)对细胞(诸如癌细胞)的结构和/或功能是有害的。例如，当暴露于机能失调的体细胞时，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)释放细胞毒性穿孔素、颗粒酶和粒溶素。通过穿孔素的作用，颗粒酶进入靶细胞的细胞质并且其丝氨酸蛋白酶功能激发半胱天冬酶级联，半胱天冬酶级联是最终导致凋亡(程序化细胞死亡)的一系列的半胱氨酸蛋白酶。

由本发明提供的组合物和方法被证明对一些癌症类型有效，与来源无关。在一些实施方案中，癌细胞表达CEACAM1、PD-L1、PD-L2或其任何组合。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，癌细胞表达CEACAM1、PD-L1或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，癌细胞表达CEACAM1、PD-L2或二者。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些所述的实施方案中，癌细胞表达CEACAM1和PD-L1和PD-L2。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：黑素瘤癌、淋巴瘤癌、肺癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、白血病、骨髓癌、卵巢癌、子宫癌、肉瘤、胆囊癌以及子宫内膜细胞癌。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，癌症选自由黑素瘤癌和淋巴瘤癌组成的组。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。

在一些实施方案中，抗人类PD-1、PD-L1和PD-L2中的至少一种的单克隆抗体能够抑制或阻断人类PD-1和其配体间相互作用。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。

如以上所述，本发明提供使用药物组合物的方法，所述药物组合物针对同时阻断两个主要的免疫抑制相互作用：CEACAM1^淋巴细胞/CEACAM1^癌细胞和PD-1^淋巴细胞/PD配体^癌细胞。因此，在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者施用包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是同时完成的。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是顺序完成的。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之前施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段与抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段同时施用。在所述方法的一些实施方案中，抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段在抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段之后施用。

在一些实施方案中，以上所述的方法还包括向所述患者施用包含淋巴细胞的药物组合物的步骤。在所述方法的一些实施方案中，包含淋巴细胞的药物组合物的施用与包含抗体的药物组合物的至少一种同时完成。在所述方法的一些实施方案中，两种或更多种药物组合物的施用是顺序完成的。

惊人地发现，抗CEACAM1的抗体和抗PD-1的抗体与淋巴细胞上其各自靶的结合以某种方式互相关联。因此，在一些实施方案中，在施用前，淋巴细胞用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段或用抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这样的实施方案中，在施用前，淋巴细胞用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育。在其他某些这样的实施方案中，在施用前，淋巴细胞用抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段预孵育，并且然后用抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段孵育。

如本文所用的短语“用……预孵育”指被包含在同一种药物组合物中的淋巴细胞、抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段处于允许一种或两种抗体或其抗原结合片段以特异性的方式结合其被淋巴细胞呈现的靶的条件下。

人类白细胞抗原(HLA)系统是编码细胞表面上负责调节人类的免疫系统的蛋白的基因的基因座。所述HLA基因是在大多数脊椎动物中发现的主要组织相容性复合体(MSC)基因的人类版本。HLA常规地被用于使患疾病的患者和用于细胞或器官移植的健康供体相匹配。当患者的HLA与供体的HLA极其匹配、优选一致的时，产生最好的移植结果。如本文所用的术语“自体的淋巴细胞”指从癌症患者获得的或来源的淋巴细胞，所述淋巴细胞被任选地扩展或用抗CEACAM1抗体或其抗原结合片段和/或抗PD-1抗体或其抗原结合片段孵育，并且被施用至同一癌症患者。如本文所用的术语“自体的淋巴细胞”还指从人类白细胞抗原(HLA)相匹配的供体获得的或来源的淋巴细胞。

在一些实施方案中，选自由抗CEACAM1、抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2组成的组的至少两种不同的抗体被包含在至少两种不同的药物组合物中。在一些实施方案中，选自由抗CEACAM1、抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2组成的组的至少一种抗体和至少一种淋巴细胞被包含在同一药物组合物中。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒含有包含抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物、和包含抗人类PD-L2的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。

在某些实施方案中，包含抗体或其抗原结合片段的每种药物组合物被包含在试剂盒内的单独容器中。

在某些实施方案中，所述试剂盒还含有包含淋巴细胞的药物组合物。在某些所述的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段或抗人类PD-1的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。每个可能性代表本发明的一个单独的实施方案。在某些这样的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类CEACAM1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些这样的实施方案中，所述试剂盒含有包含淋巴细胞和抗人类PD-1的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含试剂盒的使用说明书。

下列实施例意指阐明如何制造和使用本发明的化合物和方法，并且绝不被解释为限制。尽管现在将结合其具体的实施方案描述本发明，显然对于本领域的技术人员许多改进和变化将是明显的。相应的，意图包括落入所附权利要求的精神和广范围内的所有此类的改进和变化。

实施例

实施例1-人类黑素瘤细胞经IFN-γ激活后表达CEACAM1和PD-L1

人类黑素瘤细胞(MALME 3M)用IFN-γ(2000单位/ml)孵育24小时，随后用PE缀合的抗PD-L1抗体(克隆29E.2A3)或用PE缀合的抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24，由cCAM Biotherapeutics开发的)通过FACS分析。对于同种型对照进行了类似的测定。

图1展示在实验中所用的人类黑素瘤细胞表达CEACAM1和PD-L1二者。

实施例2-人类TIL细胞表达PD-1和CEACAM1。

人类TIL细胞(肿瘤浸润淋巴细胞从Ella institute的患者#14扩增，批次14，TIL14)被用抗人类PD-1的单克隆抗体(克隆E12.2H7)或用PE缀合的抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)染色，随后FACS分析。呈现了与匹配的同种型对照相比，PD-1(A)和CEACAM1(B)的表达。

图2展示，在实验中所用的人类TIL细胞表达PD-L1和CEACAM1二者。

实施例3-抗CEACAM1和抗PD-1抗体对人类TIL细胞针对人类黑素瘤细胞的细胞毒性的协同效应。

人类黑素瘤癌细胞(MALME 3M)在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-L1表达。人类TIL细胞(TIL14)用抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)(0.01μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml)、抗人类PD-1的单克隆抗体(克隆E12.2H7)或用两种抗体的组合(每种抗体为0.005、0.025、0.05和0.25μg/ml)在37℃孵育30分钟。

细胞毒性评估前，IFN-γ处理的人类黑素瘤癌细胞被添加用于过夜孵育(图3)。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性的平均值％±SE。*P<0.05相比于仅CM-24的成对T检验。根据下列等式，组合系数(CI)被计算为≤0.2。

图3展示，抗CEACAM1抗体和抗PD-1抗体二者均能够结合人类淋巴细胞诸如TIL细胞上其各自的靶，并且相比于每个单独的单药治疗，所述结合显著增加人类TIL细胞针对人类癌细胞的毒性。因此，在图3中呈现的数据指示，保护淋巴细胞免受来自靶癌细胞的免疫抑制信号导致对于这些癌细胞的实质的细胞毒性。

实施例4-当在添加抗CEACAM1抗体前添加抗PD-1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-1抗体对颗粒酶B水平和人类TIL细胞针对人类黑素瘤细胞的细胞毒性的协同效应。

人类黑素瘤癌细胞(MALME 3M)在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-L1的表达。人类TIL细胞(TIL14)用仅培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(0.8μg/ml，白色)、各种浓度的(0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml)抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)、抗人类PD-1的单克隆抗体(克隆E12.2H7)或两种抗体的组合(每种0.05μg/ml、每种0.1μg/ml、每种0.2μg/ml、每种0.4μg/ml、每种0.8μg/ml)孵育。

抗人类PD-1的单克隆抗体在37℃被首先添加30分钟，随后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。在细胞毒性评估之前，IFN-γ处理的人类黑素瘤癌细胞被添加用于过夜孵育(图4A)。组合系数(CI)被计算是0.15。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性的平均值％±SE。*P<0.05相比于仅抗PD-1(a-PD-1)的成对T检验。在同一测定中，通过商用颗粒酶B ELISA试剂盒评估经细胞毒性细胞激活分泌的细胞毒性蛋白颗粒酶B的水平(图4B)。结果代表来自每个处理三个重复孔的平均颗粒酶B水平。

图4展示，抗CEACAM1抗体和抗PD-1抗体能够结合人类淋巴细胞诸如TIL细胞上的其各自靶，并且这种结合增加颗粒酶B的分泌和人类TIL细胞针对人类癌细胞的毒性。图4还展示，这些抗体与人类TIL细胞的结合以某种方式相互关联，成为其结合机制的进一步研究的根据。与图3中呈现的数据类似，图4再次指示，保护淋巴细胞免受来自靶癌细胞的免疫抑制信号导致对靶癌细胞的实质的细胞毒性并且预示时机可能是组合疗法中的关键因素。

实施例5-当在添加抗CEACAM1抗体前添加抗PD-L1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-L1抗体对颗粒酶B水平和人类TIL细胞针对人类黑素瘤细胞的细胞毒性的协同效应。

人类黑素瘤细胞(MALME 3M)在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-L1的表达。人类TIL细胞(TIL14)用仅培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(0.8μg/ml，白色)、各种浓度的(0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml)抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)、抗人类PD-L1的单克隆抗体(克隆29E.2A3)或两种抗体的组合(每种0.05μg/ml、每种0.1μg/ml、每种0.2μg/ml、每种0.4μg/ml、每种0.8μg/ml)孵育。抗PD-L1抗体在37℃被首先添加30分钟，随后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。

在细胞毒性评估之前，IFN-γ处理的人类黑素瘤癌细胞被添加用于过夜孵育(图5A)。组合系数(CI)被计算是0.67。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性的平均值％±SE。*P<0.05相比于仅抗PD-L1(a-PD-L1)的成对T检验。在同一测定中，通过商用颗粒酶B ELISA试剂盒评估经细胞毒性细胞激活分泌的细胞毒性蛋白颗粒酶B的水平(图5B)。结果代表来自每个处理三个重复孔的平均颗粒酶B水平。

图5展示，抗CEACAM1抗体和抗PD-L1抗体能够结合人类淋巴细胞(诸如TIL细胞)和人类癌细胞(诸如黑素瘤细胞)上的其各自靶，并且这种结合增加颗粒酶B的分泌和人类TIL细胞针对人类癌细胞的毒性。图5还展示，阻断PD-1/PD-L1和CEACAM1/CEACAM1的相互作用可导致协同效应。因此，图5呈现的数据指示，保护淋巴细胞免受PD-1^淋巴细胞/PD配体^癌细胞的免疫抑制信号导致对这些癌细胞的实质的细胞毒性，无论靶向的抗原是PD-1、PD-L1或PD-L2。

实施例6-当在添加抗CEACAM1抗体前添加抗PD-1抗体时，抗CEACAM1和抗PD-1抗体对人类LAK细胞针对人类黑素瘤细胞的细胞毒性的协同效应。

人类黑素瘤细胞(SKMEL28，CEACAM1阳性，PD-L1阳性)在IFN-γ的存在下生长以诱导PD-L1的表达。通过用IL-2(500单位/ml)持续7天激活来自健康的人供体的PBMC产生的人类LAK(淋巴因子激活杀伤)细胞用单独培养基(黑色)、非特异性IgG抗体(0.8μg/ml，白色)、各种浓度的(0.05μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml)抗人类CEACAM1的单克隆抗体(CM-24)、抗人类PD-1的单克隆抗体(克隆E12.2H7)或两种抗体的组合(每种0.05μg/ml、每种0.1μg/ml、每种0.2μg/ml、每种0.4μg/ml、每种0.8μg/ml)孵育。抗人类PD-1单克隆抗体在37℃被首先添加30分钟，随后添加抗人类CEACAM1的单克隆抗体。

在细胞毒性评估之前，IFN-γ处理的人类黑素瘤癌细胞被添加用于24小时孵育(图6)。组合系数(CI)被计算为<0.2。结果代表由来自每个处理三个重复孔的经典LDH释放测定确定的细胞毒性的平均值％±SE。*P≤0.05相比于仅抗PD-1(a-PD-1)的成对T检验。

图6展示，抗CEACAM1抗体和抗PD-1抗体能够结合激活的人类淋巴细胞诸如LAK细胞上的其各自靶，并且这种结合增加人类LAK细胞针对人类癌细胞的毒性。图6还展示，这些抗体与LAK细胞的结合以某种方式相互关联，成为其结合机制的进一步研究的根据，且这一机制存在于多种激活的淋巴细胞中。

实施例7-用抗CEACAM1抗体处理增加靶癌细胞上PD-L1的表达。

人类NK细胞(NK92MI)用或不用抗人类CEACAM1的单克隆抗体(10μg/ml CM-24)孵育，随后添加人类黑素瘤癌细胞(SKMEL28)。细胞被孵育24、48和72小时并且在每个时间点通过FACS分析测量PD-L1水平。图7A展示与合适的同种型对照相比，对于在不同时间点的所示处理抗PD-L1的平均比率水平。B.48小时后PD-L1水平的代表性FACS分析。

图7展示，癌细胞上CEACAM1和PD-L1的表达确实是相互关联的。添加抗CEACAM1抗体导致存活的癌细胞上增加的PD-L1表达，因此提供关于用两种试剂组合处理的额外支持。因此，通过首先施用抗CEACAM1抗体，并且然后另外施用抗PD-L1和/或抗PD-L2抗体对于治疗癌症可以是有益的，因为癌细胞上PD-L1蛋白的数目保持相对较高，使细胞对于抗PD-1/PD-L1抗体处理更加敏感，预示着组合疗法可改善临床结果。

在实施例4至6呈现的数据说明了惊人的发现，根据该发现，在分开的时间施用不同的抗体，而不是同时地施用抗体，使淋巴细胞针对癌细胞的细胞毒性效应最大化。不限于任何理论或机制，此发现可与本发明的另一个惊人发现关联，根据该发现，用抗CEACAM1抗体处理增加靶癌细胞上PD-L1的表达。假设地，这将支持需要多种抗体以获得细胞毒性淋巴细胞的改善的效价。可预期，首先施用抗PD-1抗体阻断淋巴细胞上的PD-1分子，然后施用抗CEACAM1抗体阻断淋巴细胞和/或靶癌细胞上的CEACAM1分子并且增加靶癌细胞上PD-1配体的表达。然而，由于淋巴细胞上的PD-1分子已被阻断，靶癌细胞上提高的表达水平的PD-1配体不阻止淋巴细胞有效地施加其全部的细胞毒性潜能。

实施例8-在免疫活性小鼠中，抗CEACAM1抗体和抗PD-1抗体对肿瘤进程的协同效应。

鼠淋巴瘤细胞(5*10⁶，A20)在第1天通过皮下注射被同种异体移植进入Balb/C小鼠的腹腔。在第10天，肿瘤达到45mm³的平均体积，并且小鼠被随机地分成4个单独的组(每组11-12只小鼠)，并且静脉施用PBS(图8，黑虚线、空圆)、CC-1(抗鼠CEACAM1抗体，6mg/kg，图8，实灰线、灰色矩形)、PRM-1(抗鼠PD-1抗体，6mg/kg，图8，实灰线、灰色三角形)或CC-1和PRM-1的组合(每个6mg/kg，图8，实黑线、黑色球形)。在第15天和20天重复处理。在第22天终止实验。单独的抗人类CEACAM1单克隆抗体、单独的抗人类PD-1单克隆抗体以及两种抗体的组合对肿瘤生长抑制的效果被追踪。

免疫活性Balb/C小鼠被选用于此实验以允许在具有完整免疫系统的小鼠中评估抗鼠CEACAM1和抗鼠PD-1抗体的生物活性，并且评估对抗鼠癌细胞的整体免疫系统反应。作为整体，所述模型模拟在人类中的治疗，其中癌症患者将接受抗人类CEACAM1和抗人类PD-1/PD-L1/PD-L2抗体的组合。不限于任何理论或机制，设想，抗CEACAM1和抗PD-1/PD-L1/PD-L2抗体的组合将抑制癌细胞避开患者免疫系统的激活和细胞毒性，因此产生显著的抗癌症反应。

图8展示，抗CEACAM1抗体和抗PD-1/PD-L1/PD-L2抗体能够在体内结合肿瘤细胞和/或免疫细胞上其各自的靶，且与每个单一疗法相比，组合的结合显著地减弱肿瘤的进程。此结果非常重要，因为其证实使用组合的抗CEACAM1和抗PD-1/PD-L1/PD-L2抗体，甚至在模拟其中具有确定肿瘤的患者被治疗的临床情况的建立的可观体积的肿瘤中的效价和潜能。

图9提供每个个体小鼠的肿瘤进程曲线，小鼠通过其各自治疗被分组(对照、抗CEACAM1抗体、抗PD-1抗体、或抗CEACAM1和抗PD-1抗体的组合)。

实施例9-用抗CEACAM1抗体和抗PD-1或抗PD-L1抗体的组合处理癌症异种移植物模型

肿瘤通过皮下(SC)注射癌细胞系(例如黑素瘤细胞系诸如SKMEL5)被异种移植进入SCID NOD小鼠。在具有或不具有TIL细胞下，仅抗CEACAM1抗体(例如CM-24)的效果、仅抗人类PD-1单克隆抗体或抗人类PD-L1单克隆抗体的效果、和两种抗体组合的效果通过肿瘤根除、肿瘤生长抑制和/或小鼠死亡率被检查。

例如，SCID-NOD小鼠被随机分成在表2中公开的组。

表2.SCID-NOD小鼠组

*TIL被过继地施用以补偿在此小鼠株系中免疫系统的不存在。

肿瘤起始-每只小鼠通过SC注射至小鼠右胁被施用PBS中的癌细胞(例如黑素瘤)。处理-处理起始于肿瘤接种日。肿瘤生长测量-每周进行两次测量，由对实验步骤盲的人使用卡尺。测量起始于肿瘤的起始日。终止点-从肿瘤起始日～60-80天。在测定结束日，所有小鼠在整体流血和血清分离后被处死。肿瘤被转移至每只小鼠单独的管中固定。

实施例10-在带有未治疗的、不可切除的或转移癌的人受试者中，抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2/抗CEACAM1单一疗法对抗CEACAM1和抗PD-1/抗PD-L1/抗PD-L2疗法组合。

*实验继续直至记录的疾病进展、由于毒性终止、受试者的同意撤回或研究结束。