抗PD-1/PD-L1单克隆抗体的制备及其应用于慢性乙型肝炎病毒感染治疗的初步研究

摘要

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染，可造成严重肝脏疾病，威胁人类健康。当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要包括干扰素类(Interferon)和核苷/核苷酸类似物(Nucleoside/Nucleotide analogues)两类。治疗慢性HBV感染的目标是阻止重症肝炎（肝衰竭）、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病的发生，其临床最佳治疗终点是使患者达到乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清学阴转或血清学转换(HBsAg loss or HBsAg SR)，但现有药物实现该目标的疗效十分有限（1年期治疗HBsAg阴转率通常＜5％，延长治疗HBsAg阴转率通常亦＜10％），因此，针对慢性HBV感染者发展创新的、能促进逆转免疫耐受的创新治疗药物和方法是迫切而必要的。
　　 慢性HBV感染者通常缺乏有效的抗HBV免疫应答，使得宿主无法有效清除体内病毒。此种免疫耐受状态可能是由于病毒免疫防御机制使得宿主免疫应答活化通路被抑制而造成。新近研究表明慢性HBV感染者免疫耐受状态的形成与程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein1，PD-1)及其配体(programmed cell death1 ligand1，PD-L1)相互作用而介导的免疫应答负调控信号的活化密切相关。通过抗体或其他拮抗物阻断该信号通路可能逆转免疫耐受，从而刺激抗HBV特异性的T细胞活化，激活宿主抗HBV免疫应答以促进病毒的清除，是发展慢性HBV治疗新药物的重点研究方向之一。
　　 本研究旨在获得具有治疗潜力的抗PD-1和抗PD-L1单克隆抗体，并在持续携带HBV的小鼠动物模型中初步探索其应用于治疗慢性HBV感染的可行性。我们利用大肠杆菌原核表达系统和系列层析纯化手段，表达并纯化获得人源和鼠源的PD-1和PD-L1蛋白的胞外区(Human PD-1-aa21-aa170、HumanPD-L1-aa20-aa238、Mouse PD-1-aa1-a167、Mouse PD-L1-aa20-aa240)，以此为基础建立了检测人及鼠PD-1/PD-L1重组蛋白体外相互作用的酶联化学发光免疫分析方法。采用纯化后的人PD-1和人PD-L1蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠，本研究共计制备了38株稳定分泌鼠抗人PD-1和18株稳定分泌鼠抗人PD-L1的单克隆抗体杂交瘤细胞株，通过间接化学发光免疫法评估了这些抗体与相应人源及鼠源重组蛋白的反应性，同时采用间接免疫荧光检测分析这些抗体与稳定表达hPD-1与hPD-L1的293细胞的反应性，并定量地评估了它们对PD-1/PD-L1体外相互作用的阻断活性。基于抗人PD-1/PD-L1对鼠PD-1/PD-L1具有交叉反应性这一特点，我们在HBV转基因小鼠中测试了其中代表性的6株Anti-PD1抗体和6株Anti-PD-L1抗体。结果显示直接静脉注射Anti-PD1或Anti-PD-L1抗体可使得HBV小鼠血清HBV DNA及HBsAg水平发生显著降低，其中最为有效的两株抗体，分别是Anti-PD-17A1和Anti-PD-L110E4，单剂注射48小时后可使得HBV转基因小鼠较注射前血清HBV DNA水平降低约1.0 log10，血清HBsAg水平降低约50％。
　　 综上所述，本研究发展了针对免疫分子PD-1和PD-L1的系列单克隆抗体，并在HBV转基因小鼠动物模型中证实了Anti-PD-1和Anti-PD-L1单克隆抗体用于治疗慢性HBV感染的应用潜力，为进一步人源化治疗性抗体奠定了基础。

目录

声明

摘要

Abbreviations

第一章 前言

1．乙型肝炎病毒

1．1 HBV病毒结构

1．2 HBV感染的全球流行情况

1．3 HBV感染的免疫致病作用

1．4 HBV感染的治疗现状

2．PD-1／PD-L1通路与免疫调节的研究

2．1 PD-1、PD-L1和PD-L2的分子特征

2．2 PD-1／PD-Ls抑制信号对T、B细胞活性的影响

2．3 PD-1／PD-Ls抑制信号转导的分子机制

2．4 PD-1／PD-Ls抑制信号与疾病的关系

2．5 PD-1／PD-Ls信号通路作为免疫治疗靶标的应用前景

3．本研究的设计思路、目的和意义

第二章 材料与方法

1．材料

1．1 主要设备

1．2 主要耗材

1．3 菌株、质粒、细胞株

1．4 常用试剂

1．5 常用溶液及培养基配制

2．方法

2．1 常规分子生物学实验方法

2．2 常规细胞生物学实验方法

2．3 单克隆抗体的制备

2．4 动物实验的一般检测方法

第三章 结果与分析

1．重组PD-1／PD-L1蛋白的表达与纯化

1．1 人PD-1／PD-L1与小鼠PD-1／PD-L1表达质粒的构建

1．2 人PD-1／PD-L1与小鼠PD-1／PD-L1蛋白的表达与纯化

1．3 人PD-1／PD-L1与小鼠PD-1／PD-L1蛋白的生物活性鉴定

1．4 第一部分小结

2．Anti-PD-1／PD-L1抗体的制备与性质鉴定

2．1 Anti-PD-1／PD-L1单抗的制备

2．2 Anit-PD-1／PD-L1单抗反应活性鉴定

2．3 Anti-PD-1／PD-L1单抗阻断活性的鉴定

2．4 第二部分小结

3．Anti-PD-1／PD-L1抗体在慢性HBV感染治疗中的应用研究

3．1 Anti-PD-1／PD-L1单抗在HBV转基因小鼠中的治疗效果评估

3．2 Anti-PD-L1单抗可在体内和体外模型中刺激γ干扰素水平上升

3．3 第三部分小结

第四章 讨论

1．PD-1、PD-L1蛋白膜外区序列在E．Coli中的表达及纯化

2．Anti-PD-1／PD-L1单克隆抗体的制备和评估

3．Anti-PD-1／PD-L1单抗对HBV转基因小鼠中HBV表达复制的抑制

小结与展望

1．小结

2．展望

参考文献

致谢