包含苹果根系发育相关基因MdMIEL1的遗传构建体及其应用

摘要

包含苹果根系发育相关基因MdMIEL1的遗传构建体及其应用。本发明涉及一种遗传构建体，其包含处于强启动子控制下的编码嘎啦苹果的E3泛素连接酶的DNA序列SEQ ID NO:1。本发明还涉及该遗传构建体用于产生转基因拟南芥的用途。本发明还涉及一种用于产生侧根增多的拟南芥株系的方法，其特征在于，包括将本发明的遗传构建体导入拟南芥中，得到转基因拟南芥种子，然后通过对所述转基因拟南芥种子的子代进行多轮筛选来得到纯合拟南芥株系。通过本发明得到了侧根增多的转基因拟南芥株系。

说明书

技术领域

本发明涉及植物遗传工程领域，更特别地，涉及使用遗传工程技术得到侧根数量 更多的拟南芥的方法。

背景技术

植物根系在水分吸收、养分吸收、固定植物、合成植物生长物质以及与根际周围的 微生物相互作用等方面发挥着重要的作用。植物的根从发生部位上可分为主根和侧根。测 根的发生首先从主根的中柱鞘细胞启动，其后该细胞通过分离、分化形成侧根原基，然后继 续发育并突破表皮形成侧根。

拟南芥的侧根发育过程中，受到一系列因子的调控。生长素运输基因表达产物 AuxI将生长素转运至中柱鞘细胞，PIN家族成员输出生长素，使得中柱鞘细胞中形成生长素 浓度梯度。当生长素浓度高时，其诱导细胞中的抑制物AUX/IAA通过泛素/蛋白酶体途径降 解，从而激活与侧根发生和发育相关的基因通路。

E3泛素连接酶是参与泛素/蛋白酶体途径的分子，其能识别靶位点并将泛素分子 连接到靶位点，在蛋白质的泛素/蛋白酶体降解过程中起重要作用。因此，E3泛素连接酶有 可能参与到了拟南芥侧根发生和发育的过程中。

发明内容

本发明的目的是得到侧根增多的拟南芥转基因株系。发明人以SEQIDNO:2和3所 示的正向和反向引物，以嘎啦苹果为模板，通过PCR的方式扩增得到了嘎啦苹果中的E3泛素 连接酶基因MdMIEL1，然后通过分子生物学技术和遗传工程的手段实现了本发明的目的。

本发明提供了一种遗传构建体，包含处于强启动子控制下的嘎啦苹果的E3泛素连 接酶基因(MdMIEL1)片段，所述基因片段具有SEQIDNO:1所示的序列。

进一步地，所述强启动子是能在拟南芥中组成型表达的强启动子。例如病毒来源 的启动子，如CaMV35S、CsVMV启动子、BSV启动子、MMV启动子等；植物来源的启动子，例如 actin2基因启动子、Ubi.U4基因启动子等。

进一步地，所述遗传构建体还包含一个或多个产生抗抗生素的抗性基因，例如抗 潮霉素基因。通过包含这样的基因，可有利于对带有该遗传构建体的转基因拟南芥细胞和 所述用于筛选转化的细菌进行筛选。

进一步地，所述遗传构建体包含所述MdMIEL1基因片段的pCAMBIA1300质粒，其中 所述MdMIEL1基因片段处于所述pCAMBIA1300质粒上的CaMV35S启动子的控制下。

本发明还涉及一种用于产生侧根增多的拟南芥株系的方法，包括将权利要求1所 述的遗传构建体导入到拟南芥中，得到转基因拟南芥种子，然后通过对所述转基因拟南芥 种子的子代进行多轮筛选来得到纯合拟南芥株系。。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)用本发明所述的遗传构建体转化农杆菌感受态细胞，并筛选得到单克隆转化 子；

2)培养步骤1)中得到的单克隆转化子，收集菌体，并制成侵染液；

3)用步骤2)中得到的侵染液侵染拟南芥花序，通过侵染得到转基因的拟南芥；

4)收集所述花序产生的拟南芥种子，进行多代的抗生素(潮霉素)和PCR筛选，以得 到纯合的转基因拟南芥株系。所述筛选方法是本领域已知的，例如首先将侵染花序产生的 种子在含50mg/l潮霉素的培养基中培养，对能在其中生长的拟南芥植株进行PCR，以确认其 基因组中存在所转基因。然后，收集所述植株产生的种子，进行下一轮筛选，以后的筛选过 程中潮霉素浓度为100mg/l。这种筛选可进行三轮至多轮，直至确保得到纯合的转基因拟南 芥株系为止。

附图说明

图1为本发明的遗传构建体的质粒图；

图2示出了通过本发明的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南 芥(col)中MdMIEL1的表达水平；

图3为本发明通过本发明的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟 南芥(col)萌发后的植株及根系的照片；

图4示出了通过本发明的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南 芥(col)的主根长度；

图5示出了通过本发明的方法得到的转基因拟南芥(#1、#7和#8)以及野生型拟南 芥(col)的侧根数量。

具体实施方式

发明人在对嘎啦苹果的研究过程中发现其E3泛素连接酶基因(MdMIEL1)在嘎啦苹 果处于逆境过程中上调表达，暗示其可能在嘎啦苹果的抗逆境过程中起着一定作用。将该 基因克隆出来，在模式生物拟南芥中进行研究时，出乎意料地，发现该基因在拟南芥中的过 表达能够增加拟南芥的侧根数量。发明人根据这个特性，完成了本发明。

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并 非用于限定本发明的范围。

实施例

实施例1嘎啦苹果MdMIEL1基因的克隆

1.嘎啦苹果组培叶片RNA提取

通过CTAB法提取嘎啦苹果组培叶片的总RNA，包括以下步骤：

1)取1.5g经200mMNaCl盐处理24小时的嘎啦苹果组培苗，放入预冷的研钵，加液 氮磨碎，转入预冷的50ml离心管中；

2)迅速加入10ml预热到65℃的提取缓冲液(CTAB20％w/v，Tris-HCl0.1mol/l， EDTA25mol/l，NaCl2mol/l，巯基乙醇2％w/v，PVP2％w/v，无RNA酶的双蒸水定容，其中 PVP和巯基乙醇现用现加)，轻轻混匀，65℃水浴中0.5小时；

3)加入与上步离心管液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴 振荡0.5小时，4℃、12,000rpm离心20分钟；将上清液转移到新的50ml离心管中；

4)加入1/3上清液体积的10mol/L预冷LiCl，-20℃放置3小时，12,000rpm离心30分 钟，弃上清液；

5)加入500μlSSTE缓冲液(NaCl1mol/l，SDS0.5％w/v，EDTA10mol/l，无RNA酶 的双蒸水定容)充分悬浮沉淀后，平均分装到2支1.5ml离心管中；

6)分别加入与悬浮液等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合物，冰浴振 荡10分钟，4℃、12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管；

7)分别加入与上清液等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合物，冰浴振荡10分钟，4℃、 12,000rpm离心10分钟；将上清液转移到新的1.5ml离心管；

8)加入2.5倍上清液体积的预冷无水乙醇，-20℃放置1-2小时；

9)于4℃、12,000rpm离心20分钟，70％乙醇洗2次；

10)于4℃、14,000rpm离心10分钟，超净台上风干沉淀；加入20μlDEPC水溶解RNA。

11)置-80℃储藏备用，或立即进行以下反转录实验。

2.将总RNA反转录得到cDNA

总RNA的反转录使用市售的反转录试剂盒，并根据制造商的说明书来进行。

3.MdMIEL1全长DNA序列的扩增

用引物对MdMIEL1-F/MdMIEL1-R，以上述反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

MdMIEL1-F：5’-ATGGAAGGCTCAGCCAATGAAC-3’(SEQIDNO:3)；

MdMIEL1-R：5’-TTGAGGAAGAACTGGAGGGGC-3’(SEQIDNO:4)。

扩增体系：纯化的cDNA产物25μl，5×TdT缓冲液10μl，0.1％BSA5μl，10mMdCTP 2.5μl，TdT15U，双蒸水定容至50μl。

扩增程序：94℃预变性5分钟；循环参数为94℃变性30秒、56℃退火30秒、72℃延伸 60秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。

PCR反应结束后，回收PCR产物并将其连接到pMD-18T载体上，测序结果显示，其核 苷酸序列如SEQIDNO:1所示；其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

实施例2.用于转基因的质粒的构建

1.使用引物对EMdMIEL1-F/EMdMIEL1-R，以上述得到的带有MdMIEL1的pMD18-T质 粒为模板，PCR扩增带有EcoRI和PstI酶切位点的MdMIEL1序列。

EMdMIEL1-F：5’-GAATTCATGGAAGGCTCAGCCAATGAAC-3’(SEQIDNO:5)，划横线部分 为EcoRI酶切位点；

EMdMIEL1-R：5’-CTGCAGTTGAGGAAGAACTGGAGGGGC-3’(SEQIDNO:6)，划横线部分 为PstI酶切位点。

扩增体系和扩增程序如上文所述，仅将引物和模板进行替换。

2.回收PCR产物并将其连接到pMD-18T载体上，并进行测序，以确保所得片段的序 列正确。

3.分别对上述质粒和pCAMBIA1300载体使用EcoRI和PstI双酶切，回收MdMIEL1片 段和载体，用T4DNA连接酶将二者连接起来，并用于转化大肠杆菌，选择带有正确插入方向 的质粒的大肠杆菌，即，MdMIEL1片段以顺着pCAMBIA1300载体上的CaMV35S启动子所启动 的转录方向插入pCAMBIA1300上(图1)。

4.用构建好的重组子pCAMBIA1300-MdMIEL1转化农杆菌LB4404感受态细胞。进行 PCR鉴定，挑取阳性菌落进行测序。测序正确的重组子pCAMBIA1300-MdMIEL1单克隆用于后 面拟南芥的转化。

实施例3.获得转基因拟南芥

1.将获得的拟南芥种子，分别用70％酒精消毒3min，4％次氯酸钠消毒8-10min(期 间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播种于种子萌发培养基上(直接铺于表面)，光培养 (25-28℃，16h长日照/8h短日照，10d)，至小苗长出。移栽到基质培养到开花。

2.挑取农杆菌单克隆菌落接种于10mLYEP液体培养基(含50mg/L潮霉素)中，28 ℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为06-0.8(约48h)；取其中lmL菌液加入20mLYEP液体培养基 内，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为06-0.8(约5h)。离心收集菌体，用侵染液(含0.05g/ml 蔗糖、0.03-0.05％Silweet)悬浮稀释20倍，备用；

3.将拟南芥花序浸到侵染液中15-20s，收集果荚，50mg·L^-1潮霉素抗性筛选后， PCR检测得到阳性转基因植株，经过连续3代筛选得到T3代纯合体，收取种子，进行表型分 析。

4.利用筛选培养基(含100mg/L潮霉素)筛选抗潮霉素阳性的候选转基因株系，共 获得3个35S:MdMIEL1阳性株系(#1、#7和#8)；为进一步鉴定转基因株系，在进行继代培养 时，每株系各取0.1g左右的组培苗，提取相应的RNA，反转录并进行定量PCR检测，以确定这 些株系中MdMIEL1的表达水平。结果显示如图2显示，在#1、#7及#8中的MdMIEL1表达远高于 野生型。

实施例4：转基因拟南芥的根系表型

为了进一步确定转基因植株的功能，将拟南芥播种在竖直的MS培养基上，观察拟 南芥根系发育表型。

(1)种子处理。将获得的野生型(col)和转基因株(#1，#7，#8)的拟南芥种子分别用 70％酒精消毒3min，4％次氯酸钠消毒8-10min(期间多次摇晃)，灭菌水冲洗5次，吸干水。播 种于种子萌发培养基上。4℃层积处理4天后至光下培养(21-24℃，16h长日照/8h短日照)。

(2)选择萌发后4天左右、根系发育一致的野生型拟南芥(col)和转基因拟南芥(# 1，#7，#8)，转移到MS培养基上竖直培养(21-24℃，16h长日照/8h短日照)。继续培养8天后， 观察拟南芥根系表型并拍照。

结果如图3-5所示，与野生型拟南芥相比，过表达MdMIEL1的转基因拟南芥主根长 度没有明显差异，但侧根数目显著增多。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。