一种用于桑树植原体基因组的纯化方法

摘要

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，利用植原体具有细胞膜且其基因组为半自主复制的特点，采用DNA甲基化结合蛋白，从纯化的感染植原体的桑树全基因组中去除桑树基因组，通过半定量和定量PCR均证实所获的DNA纯度较高，浓度较大的桑树植原体基因组DNA，解决了木本植物植原体含量低，脉冲电泳纯化困难的问题，并利用定量PCR对本发明效果进行了验证，所获得的植原体基因组浓度和比例较高，可以用于PCR实验和高通量测序。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，特别涉及一种用于直接测序等需要高纯度基因组的桑树植原体DNA的纯化方法。

背景技术

1967年土居等首次发现桑树黄化型萎缩病、泡桐丛枝病等多种植物的丛枝病均系植物类菌原体寄生所引起，1974年我国通过电子显微镜研究，在发生萎缩病的桑树韧皮部筛管内观察到类菌原体，1998年邱并生等分别扩增了桑黄化型萎缩病和萎缩型萎缩病16SRNA片段，按照植原体的分子分类系统，初步确定两种病害的植原体隶属于翠菊黄化组。1992年类菌原体被正式命名为植原体(Phytoplasma)。植原体归属于柔膜菌属，细胞通常呈圆形或椭圆形，没有细胞壁，在细胞质外具有单层膜，细胞质内有颗粒状的核糖体、可溶性蛋白质、RNA及代谢物等，基因组是双链闭合环状的DNA，目前已知植原体的种类有12个类群，25个亚群。桑树植原体属于翠菊黄化病组B亚组。由于植原体不能进行人工培养，所以植原体全基因组序列对于植原体研究的重要性，许多实验室用不同的方法对植原体进行全基因组测序。

在测序技术非常成熟的今天，分离技术是其基因组学研究的瓶颈，目前植原体基因组的纯化方法有先组织浸提液简单过滤法，差速离心法，密度梯度离心法，植株韧皮部汁液渗出发和植物组织冷冻法，这些方法的分离效果均不够理想。由于这些提取液的渗透压难以达到韧皮部的环境，而植原体有缺乏细胞壁，导致渗透压稍有变化就会引起植原体个体的崩解。PFGE是一种分离大分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（>10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。但该方法对于植原体的基因组含量要求较高，而且对于木质化高的植物非常不适用，一般是利用菟丝子转到草本植物中再进行，这大大增加了纯化难度。而利用酶促反应从病株总基因组中直接纯化植原体的方法未见报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，加快桑树植原体的全基因组序列的解析，首先对桑树植原体的分子生物学地位和结构特点进行分析，桑树植原体虽然没有细胞壁，但是具有细胞膜，属于半自主复制，这样就可以避免被桑树的DNA甲基化酶进行甲基化修饰，同时植原体的GC含量在40%左右，偏低，也可以有效避免被甲基化的比例，同时，已有的植原体染色实验证实植原体主要存在于桑树的韧皮部，所以本发明利用从桑树韧皮部提取全基因组DNA，然后利用甲基化DNA结合蛋白，去除桑树的宿主DNA，就可以获得纯度较高的桑树植原体基因组。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，包括以下步骤：

步骤一、样品处理，利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g，放入干净的研钵中，加入液氮冷冻后研磨均匀；

步骤二、提取基因组DNA，采用1.5ml离心管收集步骤一粉末，并迅速加入500-700ul缓冲液SLX和5-10ul核糖核酸酶A，利用涡旋器混合均匀，于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟，仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中，加入30-50ul磁珠和300-500ul无水乙醇，混合均匀，利用磁力架吸附磁珠，丢弃上清，并用70-75%的乙醇洗涤,重复3次后，利用60-100ul缓冲液TE洗脱，完成基因组DNA的提取；

步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组，首先在1.5ml的离心管中加入100-200ul蛋白A磁珠，置于磁力架吸附5分钟后，去除上清，加入缓冲液C（稀释比例为1:10）和无核酸酶的水（根据要求补充至所需总体积），加入10-20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2，22-25摄氏度震荡孵育10-15分钟，置于磁力架吸附5-7分钟，去除上清，再加入10-20ul缓冲液C、15-30ul水和25-50ul与步骤二提取的基因组DNA，25摄氏度震荡孵育20分钟，置于磁力架吸附5分钟，仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，加入2-3倍体积的无水乙醇和10-20ul5M氯化钠，冷冻2小时后4度14000转离心10分钟，沉淀用70-75%的乙醇洗涤2次后用80-100ul缓冲液TE溶解，电泳检测；

步骤四、去除碎片DNA段，步骤三产物利用琼脂糖电泳，在1.5%的胶浓度，电压5V/CM，由细菌噬菌体BacteriophageλcI857Sam7DNA用EcoT14I酶切反应后配制而成的λ-EcoT14ⅠdigestDNAMarker为指示，利用玻璃奶吸附的方法回收19329bp以上的DNA，用于下一步骤；

步骤五、基因定量PCR所使用的引物，在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水，计算后补充总体至100ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25-30ul、反应缓冲液10ul、步骤二和步骤四所得的产物分别10-15ul，于95摄氏度加热3分钟，置于冰上20分钟，然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP（10mM）4-5ul，2-3ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA，phi29聚合酶4-5ul，30摄氏度孵育12小时，65摄氏度10分钟灭活合成酶，处理后浓度为126ng/ul，可以满足测序或PCR要求，稀释至500ul分装冷冻保存备用；

其中所用的引物为：

所述的100微摩3端双硫代修饰的6随机引物为常用引物，硫代修饰为防止酶对引物的降解。

步骤六、利用CFXConnect?荧光定量系统，使用PowerSYBR?GreenPCRMasterMix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析。

所述的缓冲液SLX为1%的去氢胆酸钠Sodiumdeoxycholate，0.5%的亮抑蛋白酶肽Leupeptin，1%的聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100混合溶液。

所述的缓冲液C为25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，62.5mM氯化镁，5mMDTT，50%甘油，0.5M氯化钾的混合溶液。

所述的反应缓冲液为为0.5MTris，0.1M氯化镁，0.1M硫酸铵，0.1M二硫苏糖醇DTT的混合溶液。

所述的缓冲液TE为10mM的Tris-HCl缓冲液，1mMEDTA的混合溶液。

本发明的有益效果是：

首次利用酶促反应的办法，获得纯度较高，浓度较大的桑树植原体基因组DNA，解决了木本植物植原体含量低，脉冲电泳纯化困难的问题，并利用定量PCR对本发明效果进行了验证，所获得的植原体基因组可以用于PCR实验和高通量测序。

附图说明

图1为利用本发明纯化的植原体基因组结果，其中，M1为λ-HindⅢdigest(Takara)分子标记，BR为基因组对照，1为桑树植原体基因组。

图2为利用桑树基因和植原体16SRNA基因做的PCR验证，其中1、2、3为桑树的基因；4、5、6为植原体的基因；1、4为步骤2的产物；2、5为步骤3的产物；3、6为步骤4的产物；M为DL2000分子标记。

图3为利用定量PCR，对利用步骤5处理后和处理前的基因组DNA定量结果，其中横轴为不同的基因NCBI登录号，其后3位数为对应的引物。纵轴为相对荧光单位，灰色柱为处理前，黑色柱为处理后。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进一步叙述，但本发明不局限于以下实施例。

一种用于桑树植原体基因组的纯化方法，包括以下步骤：

步骤一、样品处理，因为植物的韧皮部筛管细胞不具有细胞核，桑树的基因组含量较低，而植原体的含量较高。利用解剖刀取桑树感染植原体的病株的枝条的韧皮部1g，放入干净的研钵中，加入液氮冷冻后研磨均匀；

步骤二、提取基因组DNA，比较离心柱、磁珠、乙醇沉淀三种基因组的提取方法，磁珠法提取的片段最长，可以达到50kbp以上，为了提高下一步宿主蛋白的去除效率，所以利用磁珠法进行样品的基因组抽提，采用1.5ml离心管收集步骤一粉末，并迅速加入500ul缓冲液SLX和5ul核糖核酸酶A，利用涡旋器混合均匀，于70摄氏度孵育10分钟后经14000转离心5分钟，仔细吸取上清液到一个干净的1.5ml离心管中，加入50ul磁珠和300ul无水乙醇，混合均匀，利用磁力架吸附磁珠，丢弃上清，并用70%的乙醇洗涤,重复3次后，利用100ul缓冲液TE洗脱，完成基因组DNA的提取；

步骤三、利用甲基化结合蛋白去除桑树的基因组，首先在1.5ml的离心管中加入200ul蛋白A磁珠，置于磁力架吸附5分钟后，去除上清，加入40ul缓冲液C（25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，62.5mM氯化镁，5mMDTT，50%甘油，0.5M氯化钾，pH7.4）和160ul无核酸酶的水，加入20ul链霉亲和素标记的甲基化结合蛋白MBD2，25摄氏度震荡孵育10分钟，置于磁力架吸附5分钟，去除上清，再加入20ul缓冲液C、30ul水和50ul与步骤二提取的基因组DNA，25摄氏度震荡孵育20分钟，置于磁力架吸附5分钟，仔细吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和10ul5M氯化钠，冷冻2小时后4度14000转离心10分钟，沉淀用70%的乙醇洗涤2次后用100ul缓冲液TE溶解，电泳检测，如图1所示；

步骤四、去除碎片DNA段，由于利用任何一种植物基因组提取试剂盒，都会产生碎片DNA，这些DNA的存在会严重影响植原体基因组的纯度步骤三产物利用琼脂糖电泳，在1.5%的胶浓度，电压5V/CM，由细菌噬菌体BacteriophageλcI857Sam7DNA用EcoT14I酶切反应后配制而成的λ-EcoT14ⅠdigestDNAMarker为指示，利用玻璃奶回收19329bp以上的DNA，用于下一步骤；

步骤五、基因定量PCR所使用的引物，在2只200ul薄壁管中分别加入双蒸水43ul、100微摩3端双硫代修饰的6随机引物25ul、反应缓冲液10ul（0.5MTris，0.1M氯化镁，0.1M硫酸铵，0.1MDTT，pH7.5）、步骤二和步骤四所得的产物分别10ul，于95摄氏度加热3分钟，置于冰上20分钟，然后加入脱氧核糖核苷三磷酸dNTP（10mM）5ul，2ul的10mg/ml牛血清白蛋白BSA，phi29聚合酶5ul，30摄氏度孵育12小时，65摄氏度10分钟灭活合成酶，处理后浓度为126ng/ul，可以满足测序或PCR要求，稀释至500ul分装冷冻保存备用，如图2所示，

其中所用的引物为：

植原体16SRNA(27F:5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1429R:5GGTTACCTTGTTACGACT)；桑树PP2基因（登录号exc24759）F:TTGACAAGATGGGCAAGAATTG；R:ACTCAACATGTTGTTTTTGGTTG；

步骤六、利用CFXConnect?荧光定量系统，使用PowerSYBR?GreenPCRMasterMix进行定量PCR对步骤五所得样品中的植原体基因组和桑树基因组进行定量分析。

引物序列为，317F：ctgctcaaatggatgctgct；317R：ggaatgtcgtctcctgggaa；608F：agcgaaaacaaaccaaatcagt；608R：agcaaatgaacctatcgcaaaa；866F：agcaactgggatgacatgga；866R：gtaaagggagagaacggcct；050F：ggtgcaggtgagtgtaaagc；050R：acttccccttccacttaccg，分别通过上述步骤处理后，定量PCR的程序为95度3分钟预变性；95度10秒；55度20秒；72度20秒；75度5秒；40个循环。MeltCurve为65到95摄氏度，增量为0.5度。发现引物序列为317和608的样品在纯化前后变化不大，而引物序列为866和050的样品则显著降低，如图3所示。

结论：从该实施可以看出，利用该方法可以从提取的桑树基因组中纯化桑树植原体基因组，从图1亮度可以看出，植原体的比例非常低，而图2显示进一步利用植原体16SRNA和桑树PP2基因的半定量PCR检测发现步骤一产物中植原体基因组和桑树基因组的含量都非常高，而步骤二产物中桑树的基因组含量开始下降，植原体基因组的含量维持不变，图3和表1显示步骤四后桑树基因组的比例进一步下降，普通电泳已经难以观察，而植原体基因组的含量继续维持不变，说明该方法切实可行。而进一步利用定量PCR对桑树基因组和植原体基因组进行定量分析，为提高数据的代表性，我们选择了和半定量PCR不同的2对引物，结果也证明在经过该方法纯化后，桑树基因组的比例已经很低，而植原体的基因组变化很小。

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