一种叶面锌肥肥效的原位评价方法

摘要

本发明涉及一种叶面锌肥肥效的原位评价方法，包括如下步骤：配制同位素68Zn标记液；选取实验植株中的待标记叶片，对待标记叶片的特定部位标记同位素68Zn标记液；选定实验植株的待测部位，所述的待测部位与特定部位没有重合区域，对待测部位进行前置处理；对经过前置处理的待测部位进行μ-XRF原位分析、LA-ICPMS验证分析、ICP-MS定量分析中的两种或三种。该原位评价方法突破了传统叶面肥肥效评价技术存在的耗时长、见效慢等技术瓶颈，率先在细胞水平上原位表征了植物体内锌的分布特征及其动态变化规律。

说明书

技术领域

本发明涉及叶面肥肥效评价技术，具体涉及一种叶面锌肥肥效的原位评 价方法。

背景技术

锌是动植物和人体必需的微量营养元素，直接或间接参与生命体内的代 谢过程，在生命活动中起着极其重要的作用，被誉为“生命之花”、“智慧元素”。 然而，我国缺锌状况十分严重，土壤缺锌面积高达40％，严重影响了作物产 量与品质，直接或间接导致了人体对锌的摄入不足，成为威胁人类健康尤其 是儿童智力发育的重要限制因子。在解决人类对微量元素需求的途径中，粮 食作物微量元素的生物强化被认为是最有前景的途径之一，因此，通过农艺 措施改善作物锌营养状况，对提高作物生产力和保障人体健康均具有非常重 要的现实意义。

叶面施肥是公认的实现微量元素生物强化目标最直接、高效的农艺措施 之一，叶面锌肥可以有效弥补土壤施锌肥存在的易被土壤吸附固定、淋失、 施用不均等局限性，补充作物锌素营养、矫正作物缺锌症，提高作物产量品 质。作为土壤施肥的辅助措施，叶面肥已成为农业生产中施用微量元素肥料 的主导技术，显示出明显的效能优势和应用前景。

然而，叶面施锌普遍存在着吸收难、转运慢的问题，严重影响了叶面施 锌的作用效果和施用效率。叶面喷施的养分从叶表面渗透到叶片内部后，其 营养功效和生理有效性不仅取决于植物叶片细胞对养分的吸收利用，还与养 分向其他部位的转运与再利用能力相关。但是，迄今关于叶面喷施的锌在植 物叶片内部如何被吸收利用、储存与再转运等关键机理仍知之甚少，如何促 进锌从叶片喷施部位向其他部位的转运仍然是叶面锌肥及其施用技术研发中 的瓶颈。

可见，全面了解和阐明叶面锌肥作用机理，不仅能为研发新型叶面锌肥 及其促效技术提供理论依据，而且是提高叶面锌肥施用效率的关键所在。然 而，长期以来，叶面喷施的锌在植物体内的追踪和定位技术未能突破。传统 评价叶面肥的肥效技术，通常采用长期定位试验方法，结合破坏性采样等分 析测试手段，费时长、见效慢，且由于易产生污染而常导致评价结果出现较 大的偏差。同位素标记技术，虽可在一定程度上追踪叶面喷施后锌在植物中 的吸收和转运特征，但难以对进入到植物组织内部的锌进行细胞与亚细胞定 位，不能原位解析锌在植物体内的吸收、运输与再转运机制。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种叶面锌肥肥效的原位 评价方法，利用该方法能够简便高效地追踪叶面喷施后，锌在植物中的吸收 和转运特征，实现叶面锌肥肥效的快速原位评价。

本发明所提供的技术方案为：

一种叶面锌肥肥效的原位评价方法，包括如下步骤：

1)配制同位素⁶⁸Zn标记液；

2)选取实验植株中的待标记叶片，对待标记叶片的特定部位标记同位素 ⁶⁸Zn标记液；

3)选定步骤2)中实验植株的待测部位，所述的待测部位与特定部位没 有重合区域，对待测部位进行前置处理；

4)对步骤3)中经过前置处理的待测部位进行μ-XRF原位分析、LA-ICPMS 验证分析、ICP-MS定量分析中的两种或三种。

作为改进，所述的待标记叶片优选成熟叶片；所述的待标记叶片的特定 部位标记同位素⁶⁸Zn标记液前，用去离子水清洗待标记叶片的上表皮和下表 皮。

作为进一步改进，在所述的待标记叶片的特定部位标记同位素⁶⁸Zn标记 液前，在所述的待测部位用羊毛脂(Lanolin)涂抹并用Teflon膜包裹，避免待测 部位受到同位素⁶⁸Zn标记液的污染。

作为改进，所述的特定部位的同位素⁶⁸Zn标记液的标记是通过粘贴含同 位素⁶⁸Zn标记液的滤纸或浸泡在同位素⁶⁸Zn标记液中的两种方式对特定部位 进行标记。

作为优选，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的整个叶面，所述的 步骤3)中待测部位为待标记叶片的叶柄以及实验植株新生的新叶。

作为进一步优选，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指：将所述 的待标记叶片的叶柄进行冷冻切片，然后冷冻干燥；另外分别将待标记叶片 的叶柄和实验植株新生的新叶烘干磨碎，进行三酸消煮。

作为优选，所述的烘干磨碎，烘干温度为60～70℃，时间为60～80h。

作为优选，所述的步骤2)中特定部位为待标记叶片的局部叶面，所述的 步骤3)中待测部位为待标记叶片的剩余叶面。

作为进一步优选，所述的步骤3)中待测部位进行前置处理是指：将所述 的待标记叶片的剩余叶面进行冷冻干燥。所述的冷冻干燥的温度为-85～-75℃， 时间为60～80h。

作为优选，所述的步骤1)中同位素⁶⁸Zn标记液包括150～250mgL^-1的 ZnSO₄水溶液，所述的ZnSO₄水溶液中⁶⁸Zn的摩尔比为5～15％。作为改进， 所述的同位素⁶⁸Zn标记液还包括0.05～0.15vol％的表面活性剂SilwetL-77。表 面活性剂用于降低同位素⁶⁸Zn标记液的表面张力，提高同位素⁶⁸Zn标记液在 叶片表面的吸附量，增强叶面喷施效果。

作为优选，所述的三酸消煮是指：将烘干磨碎后的样品分散于三酸消煮 液中，先进行常温消煮，消煮温度为20～28℃，时间为1.5～2.5h，再进行高温 消煮，消煮温度为120～140℃，时间为4～6h；所述的三酸消煮液组成为：体 积比为4.5～5.5:0.5～1.5:1的浓硝酸、高氯酸和氢氟酸的混合液。

作为优选，所述的冷冻切片的温度为-16～-20℃，切片厚度为60～100μm。 温度依据样品的性质可作适当调整，过低容易使样品组织破碎，过高则组织 冷冻硬度不够，易导致切片不成型或出现褶皱。

作为优选，所述的冷冻切片是指：将叶柄用OCT包埋剂包埋固定，置于 冷冻切片机中进行切片。

作为优选，所述的步骤4)中的μ-XRF原位分析、LA-ICPMS验证分析 和ICP-MS定量分析是指：将冷冻干燥后的样品通过同步辐射荧光探针μ-XRF 技术对样品中锌元素进行定位，同时利用激光刻蚀-电感耦合等离子体质谱 LA-ICPMS技术进一步定量分析样品中⁶⁸Zn的原位分布特征；利用电感耦合 等离子体质谱ICP-MS技术测定三酸消煮后液体样品中的锌含量。

上述同步辐射微荧光探针μ-XRF技术可原位无损分析生命体内各金属元 素的分布特征和形态信息。新一代XRF技术检测限可达ppm量级，空间分辨 率为微米乃至纳米级(Nano-XRF，Nano-XRF-CT)，可表征生命体中元素在 亚细胞水平上的定位信息。

上述μ-XRF实验条件优选为：利用带有谐波抑制的Si(220)双晶单色仪使 得入射光为单色光，利用Kirkpatrick-Baez显微镜聚集光斑，光斑大小为2μm， 样品打点角度为45°，利用单通道涡流Si检测仪检测荧光信号；光斑步长及 扫描时间依据样品性质可作适当调整。

上述激光烧蚀电感耦合等离子体质谱LA-ICPMS技术是近几年发展起来 的生物组织样品中元素成像技术，其可分析元素的同位素丰度，检测限为亚 ppm级，分辨率为10μm。相较于XRF，LA-ICPMS优势在于灵敏度高，在分 析低丰度样品时有一定优势，但分辨率不如前者。

上述LA-ICPMS实验条件优选为：LA系统采用Nd:YAG激光器(波长213 nm，重复频率10Hz,激光参数设置为40％)，扫描光斑直径为5μm；植物样 品切片固定于样品台上，置于样品室内聚焦激光束按行扫描样品，行与行之 间的间隔设置为10μm，灼烧后的样品物质由载气氦气和氢气混合气体送入 ICP检测离子强度。为了校正水分流失及样品厚度对ICP的影响，需要同时检 测¹³C的离子强度，将¹³C作为内标元素；用Ba和Rh标准样品最优化ICP-MS 参数，并选取美国标准与技术研究院(NIST)的标准参比物作为参比物质。

若无特殊说明，本发明中各溶液均采用超纯水配制。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

基于同位素示踪与金属组分析技术(μ-XRF、LA-ICPMS、ICP-MS)，创 建并优化了叶面锌肥肥效的原位评价方法，突破了传统叶面肥肥效评价技术 存在的耗时长、见效慢等技术瓶颈，率先在细胞水平上原位表征了植物体内 锌的分布特征及其动态变化规律。

附图说明

图1为实施例1中同位素⁶⁸Zn标记液标记示意图；

图2为实施例1中空白对照组的Zn元素的微区分布特征示意图；

图3为图1中区域B的Zn元素的微区分布特征示意图；

图4为图3中区域B进一步细扫的微区分布特征示意图；

图5为图4进一步细扫的微区分布特征示意图；

图6为实施例1中LA-ICPMS定量分析待测叶片的锌元素分布图；

图7为实施例2中同位素⁶⁸Zn标记液标记示意图；

图8为实施例2中叶柄切片样品的显微组织图；

图9为实施例2中叶柄切片样品的Zn元素的微区分布特征示意图，ck 为对照组，Zntreatments为实验组；

图10为实施例2中LA-ICPMS定量分析叶柄切片样品的锌元素分布图；

图11为实施例2中ICP-MS定量分析图，ck为对照组，Zn为实验组， Petiole为叶柄切片样品，Newleaf为新生的新叶。

具体实施方式

实施例1

1、溶液配制

同位素⁶⁸Zn标记液：4mL⁶⁸Zn溶液(Isotec公司，Miamisburg,Ohio)， 0.8g硫酸锌，1mLSilwetL-77，溶于超纯水中并定容至1L。

2、标记同位素⁶⁸Zn标记液

用两层塑料薄膜覆盖住土壤表面，防止喷施同位素⁶⁸Zn标记液时肥料滴 入土壤中，再于塑料薄膜上覆盖两层吸水纸，用胶纸将塑料薄膜和吸水纸封 严实，仅留出可供安装滴灌的开口。

选取实验植株为Prunusdulcis(Mill.)DAWebb品种杏树，将完全展开的成 熟叶片作为待标记叶片，用去离子水清洗叶片上表皮和下表皮，再用吸水纸 轻轻吸干备用。

将羊毛脂(Lanolin，Sigma公司)均匀地涂抹在所选待标记叶片的叶柄表面， 并用Teflon膜小心将叶柄包裹完全。

将配置好的稳定性同位素⁶⁸Zn标记液转移至5mL离心管中，用方形玻璃 纤维滤纸蘸取同位素⁶⁸Zn标记液后，贴于所选待标记叶片的特定部位A，如 图1所示，用保鲜膜将滤纸固定于该位置上进行稳定性同位素⁶⁸Zn标记液标 记处理。

3、样品制备

上述实验植株处理7天后，轻轻取下玻璃纤维滤纸，于30天后用刀片切 下整片处理叶片，立即置于液氮中保存待用。

将上述处理过的叶片转移至冷冻干燥机中，于-80℃下冷冻干燥72h；

4、μ-XRF原位分析

冷冻干燥后的叶片样品的μ-XRF原位分析可在上海光源、美国阿贡实验 室、斯坦福大学加速器等同步辐射实验站进行。本实施例以美国能源部斯坦 福大学加速器(SSRL)线站2-3为例说明相关实验参数。

斯坦福正电子加速储存环(SPEAR)中的电子能量为3.0GeV，束流强度 90～100mA，光谱亮度1×1012photons/s/mm2/mrad2/0.1％BW；利用带有谐波 抑制的Si(220)双晶单色仪使得入射光为单色光，利用Kirkpatrick-Baez显微镜 聚集光斑，光斑大小为2μm，样品打点角度为45°，利用单通道涡流Si检测 仪检测荧光信号。

选取处理叶片上的扫描区域B，如图1所示，将扫描光斑步长设为5μm， 每点的扫描时间为200ms。线站可保存每一个像素点的完整XRF光谱数据， 通过扫描感兴趣区域的XRF光谱即可获得该区域不同位点的元素分布信息， 区域B如图3所示。

作为对照，由图2可见，没有经过稳定性同位素⁶⁸Zn标记液处理的叶片 几乎没有锌元素(白色点)；由图3可见，白色虚线框为区域A，经过30天 处理后该区域A有大量锌(白色点)积累，并逐渐向四周未标记区域B扩散。

进行数据分析：植物样品中P、S、Cl、Ar、K、Ca、Mn、Fe、Cu和Zn 的特征峰均可通过μ-XRF微探针检测到，根据特征峰峰值大小可计算出各个 元素的相对含量，通过与标准样品的比对，即可获得各个位点不同元素的绝 对含量。

成像图谱采用SMAK(http://www-ssrl.slac.stanford.edu/～swebb/smak.htm) 等软件处理，对图3所选的区域B进一步细扫，由图4可见，μ-XRF图像原 位呈现了锌(白色点)通过韧皮部迁移转运到其他部位的过程。

对图4所选区域进行进一步细扫(如图5)，扫描光斑步长设为1μm，每 点的扫描时间为200ms；由图5可见，锌和钙呈点状分布于韧皮部中；

将扫描获得的叶片中锌高分辨二维图像与显微组织图片进行对比分析， 获得锌在稳定性同位素锌肥标记叶片中的原位分布特点。

5、LA-ICPMS验证分析

将上述获得的冷冻干燥叶片样品带往北京国家地质测试中心进行 LA-ICPMS定量分析。

LA系统采用Nd:YAG激光器(波长213nm，重复频率10Hz,激光参数设 置为40％)，扫描光斑直径为5μm。

植物叶片样品固定于样品台上，置于样品室内；聚焦激光束按行扫描样 品，行与行之间的间隔设置为10μm，灼烧后的样品物质由载气氦气和氢气混 合气体送入ICP检测离子强度。为了校正水分流失及样品厚度对ICP的影响， 需要同时检测¹³C的离子强度，将¹³C作为内标元素；用Ba和Rh标准样品最 优化ICP-MS参数，并选取美国标准与技术研究院(NIST)的标准参比物作 为参比物质。

将上述获得的μ-XRF数据和LA-ICPMS数据进行归一化、标准定量化， 比较分析两种金属组分布分析技术获得的数据，通过两种方法相互印证，优 势互补，获得稳定性同位素同位素⁶⁸Zn标记液标记叶片中锌元素的二维定量 分布图(如图6)。

实施例2

1、溶液配制

与实施例1中所述一致。

2、标记同位素⁶⁸Zn标记液

与实施例1不同之处在于，将配置好的稳定性同位素⁶⁸Zn标记液转移至 50mL离心管中，将所选待标记叶片浸泡于上述溶液中，如图7所示，特定区 域为区域C，注意将与叶柄连结处的叶片组织露出液面2cm左右，固定好后 将离心管放置于试管架上进行稳定性同位素⁶⁸Zn标记液标记处理。

3、样品制备

上述实验植株处理48h后，轻轻取出待标记叶片，让吸附于叶片表面的 同位素⁶⁸Zn标记液自然风干，一个月后，用刀片割下待标记叶片连结的叶柄 与新生的新叶，小心割开包裹在叶柄表面的Telflon膜，用超纯水冲洗干净待 标记叶片，用吸水纸轻轻吸干备用；

(1)制备切片样品用于μ-XRF原位分析和LA-ICPMS验证分析

切取待标记叶片连结的叶柄中部厚度约2mm的一小段组织，置于涂有 OCT包埋剂的切片机样品托上，并放入-20℃的冷冻切片机(LEICA,CM1850) 中速冻，待包埋剂逐渐凝固时再缓慢添加一层OCT包埋剂，反复多次直至样 品完全浸入包埋剂中。

将样品托和冷冻包埋好的植物组织夹紧于切片机样品头上，调整好样品 头和刀片的角度与距离，使样品表面与刀锋平行，调整好防卷板，以切出完 整、平滑的切片为准，并将切片厚度设置为100μm。

转动手轮进行切片，随后从中选取质量较好的切片，转移至含有Kapton 胶带的特制塑料框中，注意压实切片使其紧密黏贴于胶纸上，避免样品脱落， 上述操作均在-20℃切片机冷冻箱中进行。

将上述切片样品转移至冷冻干燥机中，于-20℃下冷冻干燥72h；将上述 冷冻干燥后的切片样品置于显微镜下观察，挑选出组织结构完整、高质量的 样品，拍摄显微组织图片后备用，如图8所示；

(2)制备液体样品用于ICP-MS定量分析

配制三酸消煮液：5mL浓硝酸，1mL高氯酸和1mL氢氟酸混合。

将剩余叶柄与实验植株新生的新叶分别放入信封，置于烘箱中，65℃下 烘72h；将上述烘干样品转移至磨样机中，磨成能通过0.25mm筛孔的粉末 状样品；称取0.1g粉末样品至聚四氟乙烯消煮管中，加入三酸消煮液，于常 温下消煮2h后，置于130℃消煮炉中消煮5h；将消煮完全的液体样品转移 至125mL塑料广口瓶中，用超纯水定容至50mL。

4、μ-XRF原位分析

与实施例1方法相同，所获得叶柄的冷冻干燥完的切片样品进行μ-XRF 原位分析；由图9可见，ck表示没有经过稳定性同位素⁶⁸Zn标记液处理的对 照组，在韧皮部中没有出现锌元素(白色点)，但是右侧标记组中锌元素(白 色点)主要积累于处理叶叶柄的韧皮部组织中。

5、LA-ICPMS验证分析

与实施例1方法相同，实验材料为叶柄的冷冻干燥完的切片样品。由图 10可见，LA-ICPMS定量化分析证实了⁶⁸Zn主要集中于韧皮部特定区域。

6、ICP-MS定量分析

将消煮完的液体样品，液体样品包括一组叶柄与一组新生的新叶以及对 照组，通过ICP-MS进行锌含量的检测，分析获得叶片中锌往植株其他部位的 转运量与转运特征。由图11可见，ck表示没有经过稳定性同位素⁶⁸Zn标记 液处理的对照组，ICP-MS定量分析结果表明⁶⁸Zn标记处理后显著提高了植株 叶柄中的Zn含量。