一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置与方法

摘要

本发明公开一种微流控和生物医学分析技术中用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置与方法，微流控芯片从培养室外沿直径方向设有隔离且密封的内外两层，内层中设有干粉溶液进样池、血清溶液进样池、癌细胞进样池和一个废水池，外层是一圈外层水道，在微流控芯片的下方布置一个电磁铁和一个连接电磁铁的直流电源，在微流控芯片的上方布置了三个溶液注射针筒，在外层水道与靠近进样池这一端的每个进样通道之间连接多个并列的稀释支路，每个稀释支路上装有一个压电微阀，每个压电盘均串接一个电磁继电器后连接直流电源；采用多个压电微阀控制水通道的数量，达到对培养液浓度稀释的目的，实现多种浓度的稀释。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控技术领域和生物医学分析中的细胞培养技术领域，具体是基于微流控芯片的细胞培养条件优化控制装置。

背景技术

细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。细胞培养技术的应用是直接观察活细胞的形态结构和生命活动，用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究，直接观察细胞的变化可便于摄影，便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况，是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。细胞培养技术易于施用物理、化学生物的实验研究，易于提供大量生物性状相似的实验对象，成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。

目前，对于基于微流控芯片的细胞的培养与鉴定技术，在中国发明专利申请号为201310447486.9的文献中提出了一种用于微量细胞培养的微流控芯片，微流控芯片由细胞进样入口、细胞进样通道、细胞培养小室、侧通道、排液通道、排液出口构成，将包含细胞的培养液从细胞进样入口加入装置，细胞经由细胞进样通道，进入到细胞培养小室中，多余培养液经侧通道进入排液通道后从排液出口流出。但是该装置缺少对培养液的配比处理环节，细胞所需的培养溶液的浓度无法确定，不能对培养液的浓度配比进行记录，也无法比较此培养液是否适宜细胞的存活。此外，在培养环节中，溶液不能重复利用，造成了某种程度上的浪费，从而增加了成本。

发明内容

针对上述现有基于微流控芯片的细胞的培养与鉴定技术中存在的问题,本发明提出一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置与方法，利用压电微阀的通断来达到稀释培养溶液的作用，实现培养溶液浓度的梯度，能确定出适宜细胞培养溶液浓度。

本发明一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置采用的技术方案是：包括圆盘状的微流控芯片，微流控芯片中心处是培养室，培养室正上方设有成像装置，微流控芯片从培养室外沿直径方向设有隔离且密封的内外两层，内层中设有干粉溶液进样池、血清溶液进样池、癌细胞进样池和一个废水池，外层是一圈外层水道，每个所述进样池分别经一个进样通道连接培养室，废水池经废水通道连接培养室，在微流控芯片的下方布置一个电磁铁和一个连接电磁铁的直流电源，在微流控芯片的上方布置了三个溶液注射针筒，每个溶液注射针筒分别经一根软管伸入一个所述进样池内部；微流控芯片外部设有向外层水道内注入水溶剂的水注射针筒，在外层水道与靠近进样池这一端的每个进样通道之间连接多个并列的稀释支路，每个稀释支路上装有一个压电微阀，压电微阀中有压电盘，每个压电盘均串接一个电磁继电器后连接直流电源，每个电磁继电器均串接一个驱动器后连接微控制器。

本发明一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置的实验方法采用的技术方案是：其特征是包括：

A、用溶液注射针筒对干粉溶液进样池和血清溶液进样池进行培养溶液加样处理，加样结束后，通过微控制器对电磁继电器进行控制，对稀释支路上的压电微阀内的压电盘控制，微控制器选取所要控制的电磁继电器的数量，即选取稀释支路上的压电微阀开断的数量，通过电磁继电器控制压电盘的吸合以控制压电阀的开断；

B、稀释所需要的水通过外层水道经过稀释支路到达进样通道，与培养溶液进行过滤和混合后进入培养室，通过排列组合每个稀释支路的开断达到多样的稀释，以设定不同的溶液浓度配比；

C、癌细胞样液从癌细胞进样池单独进样，癌细胞样液进样时不进行稀释，癌细胞样液与干粉、血清培养溶液同时进入培养室。

进一步地，采用成像装置采集培养室的图像，得到细胞培养后的图形，并记录图像，形成多组的图形对比，确定最适宜细胞存活的浓度组合。

本发明与已有方法和技术相比，具有如下优点：

（1）本发明微流控实验装置采用了多个压电微阀，这样可以控制水通道的数量，达到对培养液浓度稀释的目的，能实现多种浓度的稀释，为细胞培养所需的溶液浓度提供了选择性，方便了实验的操作，稀释和培养方法消耗少，节省成本，效率高。

（2）本发明微流控实验装置设置了一个微控制器，通过控制压电微阀的开断，形成培养液的浓度梯度，以供细胞的培养，具有速度快、效果好和选择性好等优点。

（3）本发明微流控实验装置操作简单，用注射针筒就能把培养溶液注入进样池，软塞管内设有溶液的预处理过程，可减少进样的杂质，进而实现溶液的提取工作。

（4）本发明装置采用了过滤技术，提高样品纯度，减小了培养中杂质对细胞生长的影响。

（5）本发明所述微流控实验装置采用卡片式杂质过滤网结构，便于滤网的清洗及更换，从而保证培养液进样通道的洁净。

（6）本发明微流控实验装置在反应区放置了一个磁针，这样在溶液通入培养池时，磁针的扰动能使细胞与培养溶液充分混合。

附图说明

图1本发明所述的一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置的总体结构示意图。

图2是图1所示实验装置去掉成像装置和微控制器30后的微流控芯片6的内部结构和外部连接结构放大示意图；

图3是图2中微流控芯片6内部的进样池、进样通道和培养室的连接结构俯视放大示意图；

图4是图3中过滤网19结构放大示意图；

图5是图3中卡片式过滤器20结构放大示意图；

图6是图3中混合组件21结构放大示意图；

图7是图2中稀释支路和压电微阀的安装位置的俯视放大示意图；

图8是图7中单个压电微阀的结构放大图；

图9是微控制器30与受控部件的连接图；

图10是本发明所述的一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置的实验方法流程图。

附图中各部件的序号和名称：1：计算机，2：目镜，3：图像采集卡，4：CCD摄像机，5：物镜，6：微流控芯片，7：溶液注射针筒，8：软塞管，9：软管,10：外层水道，11：干粉溶液进样池，12：杂质过滤组件，13：培养室，14：磁针，15：血清溶液进样池，16：癌细胞进样池，17：废水池，18：压电微阀，19：过滤网，20：卡片式过滤器，21：混合组件，22：硅膜，23：压电盘，24：玻璃板，25：电磁铁，26：直流电源，27：内肋型微柱，28：微通道，29：杂质过滤器，30：微控制器，31：驱动器，32：电磁继电器，33：水注射针筒。

具体实施方式

参见图1，图1为本发明所述的一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置的总体结构示意图，该微流控实验装置包括成像装置、微流控芯片6和微控制器30。其中成像装置由计算机1、目镜2、图像采集卡3、CCD摄像机4、物镜5组成。物镜5位于微流控芯片6的正上方，且在目镜2的底部，作用是将标本作第一次放大，目镜2将物镜5所放大的物像进一步放大。CCD摄像机4与目镜2的上部连接，位于目镜2上方，CCD摄像机4对所提取的图像进行滤波和边沿检测等算法处理，实现对微米级的微结构形貌、深度和宽度等参数的测量。CCD摄像机4连接图像采集卡3，图像采集卡3与计算机1连接，图像采集卡3自动采非电量或者电量信号并分析和处理。在微流控芯片6的上方布置了三个溶液注射针筒7，在微流控芯片6的下方布置一个电磁铁25和一个直流电源26，两者连接后放置在微流控芯片６的下面，直流电源26连接微控制器30，微控制器30通过直流电源26控制微流控芯片6的旋转。

再参见图2，微流控芯片6是圆盘状，最中心处是培养室13，成像装置中的物镜5在培养室13的正上方。培养室13内部中间镶嵌了磁针14。微流控芯片6从培养室13外沿盘面的直径方向分内外两层，外层与内层之间隔离且密封。内层位于培养室13和外层之间，内层中设有三个进样池和一个废水池17，外层是一圈外层水道10。培养室13分别连接三个进样通道和一个废水通道，每个进样通道连接一个进样池，三个进样池分别是干粉溶液进样池11、血清溶液进样池15和癌细胞进样池16，一个废水通道连接废水池17。在微流控芯片6上方的每个溶液注射针筒7的头部都通过一个软塞8连接一根软管9，每个软管9伸入一个进样池内部，经不同的溶液注射针筒7可向微流控芯片6内的进样池注射不同的溶液，溶液经进样通道进入培养室13中。

在每个溶液注射针筒7和软管9之间连接杂质过滤器29，每个溶液注射针筒7都依次地经杂质过滤器29、软塞8和软管9连接一个进样池，软管9一端连接软塞8，另一端伸入进样池内。三个进样池和一个废水池17沿微流控芯片6的圆周方向均匀布置。在微流控芯片6外部还设有水注射针筒33，通过水注射针筒33向外层水道10内注入水溶剂，水注射针筒33不断地提供水溶剂到外层水道10中。

在每个连接于进样池和培养室13之间的进样通道里面都设有杂质组件12和混合驱动组件21，杂质组件12和混合驱动组件21嵌在进样通道中。杂质组件12位于进样池和混合驱动组件21之间，混合驱动组件21靠近培养室13。再参见图3，杂质组件12由过滤网19和卡片式过滤器20组成。参见图4和图5中的过滤网19和卡片式过滤器20的结构，过滤网19为微滤网，用于滤除微米级及以上的干扰杂质，卡片式过滤器20是可以随时插拔清洗的结构，用于防止过滤过程出现的滤网堵塞。再参见图6，混合驱动组件21由内肋型微柱27和微通道28组成，内肋型微柱27是在进样通道内蚀刻加工而成，在结构上，相邻2个内肋型微柱27对面相互交错布置，在尺寸上，每个内肋型微柱27的高度完全一致,内肋型微柱27布置后在进样通道内部空间形成微通道28，微通道28呈弯曲折叠型，当液体流经微通道28时，实现对液体的折叠混合作用。

参见图7并结合图2，在外层水道10与靠近进样池这一端的每个进样通道之间连接多个并列的稀释支路，稀释支路的数量至少2个以上，图7中显示的4个稀释支路，在每个稀释支路上安装一个压电微阀18，图7中的4个稀释支路上分别安装压电微阀18a、18b、18c、18d。外层水道10内的水通过稀释支路进入进样通道时，由压电微阀18来控制，即外层水空间10内的水是通过稀释支路上的压电微阀18的开断进入到进样通道内，可达到对进样池溶液的稀释目的，而水注射针筒33则不断地提供水溶剂到外层水空间10中。

参见图8所示的压电微阀18的放大结构，压电微阀18由最上方的硅膜22、中间的压电盘23和底部的玻璃板24组成。硅膜22是一个具有弹性的材料，压电盘23镶嵌在硅膜22内。每个压电盘23均连接直流电源26，使压电盘23带电。当压电盘23带电时，直流电源26同时处于工作状态，使电磁铁25导通，此时会在微流控芯片6附近产生一个电磁场，使带电的压电盘23由于电磁力的作用而闭合，即是图8中虚线所表示的状态。这类压电微阀是利用压电材料在加电压时变形的性质进行制动，这种制动方法的优点是制动力大，响应时间短，结构简单，易于操作。

参见图9，电磁铁25连接直流电源26，每个压电盘23均串接一个电磁继电器32后连接直流电源26，同时，每个电磁继电器32均串接一个驱动器31后连接微控制器30。当微流控芯片6不工作时，压电盘23是打开状态，当微流控芯片6进行工作时，直流电源26接通，这时电磁继电器32中的线圈两端则会带有一定的电压，线圈中会留有一定的电流，从而会产生电磁效应，从而带动电磁继电器32内的动触点和静触点吸合，使压电盘23达到带电的效果。当线圈断电后，电磁的吸力也随之小时，动触点与原来的静触点吸合，这样压电盘23就会处于断电状态。再经电磁铁25的共同作用，电磁铁25和直流电源26组合，使微流控芯片6周围产生电磁场，当压电微阀18中的压电盘23由于微控制器30的作用而带电时，磁场会产生一个电磁力使压电盘23达到闭合的目的，压电盘23不带电时候则会断开，即实现了压电微阀18的开断，使压电盘23这样吸合、释放，从而达到了在电路中的导通、切断的目的。同时微控制器30也开始进行工作，根据程序的设置选取哪一个电磁阀继电器32进行工作，进而对压电微阀18进行开合。直流电源26、电磁铁25的组合和微控制器30的控制相比，是处于独立状态的，也即是说它们之间的工作过程是互不影响的，但是它们之间是协调工作的，比如直流电源26是共用的，而对于整个微流控芯片6的培养条件优化过程它们是相辅而成的。例如：对压电微阀18a进行开断，也即使与微控制器30连接的压电微阀18a中的压电盘23带电，直流电源26工作后使电磁铁25带电，进而产生电磁场，而压电微阀18a中的压电盘23由于此磁场产生的电磁力的作用而闭合。直流电源26不仅可以控制一个压电盘23的开断，也可以控制多个压电盘23带电。利用同样的方法，微控制器30可控制多个压电微阀18的压电盘23带电，进而控制多个压电微阀18的开断。

参见图10并结合图1-9，本发明一种用于细胞培养条件优化控制的微流控实验装置工作时，首先，手动用溶液注射针筒7注射培养液，对干粉溶液进样池11和血清溶液进样池15进行培养溶液加样处理，由溶液注射针筒7通过软管9来完成。培养溶液加样结束后，通过微控制器30对电磁继电器32进行控制，对稀释支路上的压电微阀18内的压电盘23进行控制，通过微控制器30的程序选取所要控制的电磁继电器32的数量，进而也是选取稀释支路上的压电微阀18开断的数量，并通过电磁继电器32控制压电盘23的吸合作用以控制压电阀18的开断。因稀释支路上的压电微阀18是多通道并联在一起，所以要控制每个压电微阀18开断的顺序，不仅可以控制开断一个，也可以同时开断几个或全部。微控制器30选择所要打开的压电微阀18的数量，打开几个压电微阀18就是对干粉溶液进行几倍的稀释，稀释所需要的水则会通过外层水道10里面的水经过稀释支路到达进样通道，与溶液进行过滤和混合后抵达培养室13。这样通过排列组合每个稀释支路的开断达到多样的稀释，即对外层水道10与每个进样池之间的压电微阀18进行控制，可设定不同的浓度配比。比如每个进样池只导通一个压电微阀18，即是将每种培养液浓度进行了一倍的稀释，记录实验浓度为a，以此类推将压电微阀18的导通个数增加至两个、三个等，然后将每个进样池的浓度进行排列组合，并用字母进行标记浓度的设置。

由电磁继电器32控制的压电微阀18使每个培养溶液分别与水混合后进样，同时癌细胞单独进样，癌细胞进样时不进行稀释。

干粉培养溶液与水在进样通道中通过混合组件21的作用，实现对液体的折叠混合作用，这样可使溶液充分的完成稀释过程，进而通过微通道28抵达培养室13的中心培养区。同时，血清培养溶液也进入培养室13，它与干粉培养溶液进行混合，但是因为培养的是癌细胞，所以对癌细胞进样池16中的癌细胞样液不进行稀释，也就说不用通过压电微阀18的作用使其稀释，避免对干粉培养溶液和血清培养溶液的干扰，但癌细胞样液与干粉培养溶液和血清培养溶液是同时进入培养室13。为了使干粉培养溶液和血清培养溶液与细胞进行均匀接触混合，在培养室13中心培养区放置磁针14。此外为使观测结果明显，所加的癌细胞在进样前对其进行荧光处理，使其具有荧光特性，这样可以在目镜2下观测到发光的地方即是癌细胞存活的区域。

在培养室13中混合一段时间后，调节目镜2的焦距使屏幕上显示一组清晰的图像并采集，观察细胞的生长状态。混合结束后，调节目镜2的焦距使屏幕上显示一个清晰的图像并采集，由此得到培养后的图形，并记录图像。

实验结束后的培养液，经过水注射针筒33的继续注射水的作用使培养室13的培养区的废液随着水的流动流进废水池17，然后再开始进行下一轮的实验，以此使整个癌细胞培养过程结束。因为是进行的对比性实验，所以采用加样、混合、培养过程，可以得出在不同的浓度下细胞的生存状况，并且在计算机上记录细胞生存的图像，形成多组的图形对比，确定最适宜细胞存活的浓度组合。根据这些图形比较观察哪一种干粉培养液和血清培养液的浓度配比组合是有利于细胞存活，以这些实验数据来设定这两种培养液的浓度配比的梯形图，方便再次查询。同时两种培养溶液的浓度设置之后，会在微控制器30中保存所设置的结果。如果有不同的浓度输入到微控制器30中，微控制器3会根据前面实验所记录的数据进行对比，进而判定此种培养溶液的组合是否适宜细胞的培养。