一种抗生素NVP018中间体的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种抗生素NVP018中间体的分离纯化方法，通过在链霉菌接种至发酵培养基中进行发酵培养24h后,加入底物FS45并分批加入非极性大孔吸附树脂，而后将抗生素NVP018中间体从树脂中解吸出来并浓缩，之后采用硅胶柱层析法进行分离纯化，其中所采用的洗脱液为二氯甲烷-甲醇，并进行梯度洗脱。通过本发明的分离纯化方法，可分离得到纯度达92%以上的HS457，且其纯度在85%以上的收率可达70%，HS457的总回收率可达93%；同时采用该方法还可将HS496分离纯化，得到纯度最高达95%以上的HS496，其纯度在85%以上的收率可达70%，总回收率可达95%，且通过本发明的方法还可得到收率为50%的固体粉末状的HS496。

说明书

技术领域

本发明适用于生物制药和生物化工领域，尤其涉及一种抗生素NVP018中间体的分离纯化方法。

背景技术

免疫抑制剂是一类具有免疫抑制作用的药物，临床主要用于器官移植的排斥反应和自身免疫反应性疾病。目前临床上使用的有环孢菌素A(cyclosporinA,CoA)、肾上腺皮质激素等。这些药物缺乏选择性和特异性，长期使用会降低机体抵抗力而诱发感染或增加肿瘤发生的机率。因此，开发新型免疫抑制剂具有良好的临床前景。

NVP018(式1)是链霉菌产生的一种新型大环内酯类抗生素,用于治疗乙型肝炎和丙型肝炎病毒，目前正在临床试验阶段。与传统的的免疫抑制药物相比,NVP018具有独特的作用机理,不仅能阻断细胞周期G1阶段的T细胞增殖,而且能在不影响B细胞抗体合成的情况下,阻断B细胞增殖。而HS457(式2)和HS496(式3)均是合成NVP018的中间产物。

目前HS457的分离纯化，已知有使用硅胶柱层析，洗脱溶剂为乙酸乙酯-甲醇，此方法中纯度可达到85％以上的HS457收率很低；使用丙酮及环己烷为洗脱溶剂，溶剂使用量大，成本高，总回收率可达到87％，纯度达到80％以上组分的收率仅有29.0％，目前无产业化的分离纯化报道。

而关于HS496的分离纯化方法，目前无报道。

发明内容

本发明的目的是克服了现有技术的不足，提供一种收率高、成本低的抗生素NVP018中间体的分离纯化方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种抗生素NVP018中间体的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)在链霉菌接种至发酵培养基中进行发酵培养24h后，加入底物FS45并分批加入非极性大孔吸附树脂，底物终浓度控制在1.5～2.5mM/L，待发酵结束后，将所述树脂从发酵液中分离；

2)采用pH为2.0～3.0的酸性溶液对所述树脂进行冲洗过滤，去除杂质，而后用等质量的乙腈溶液对所述树脂进行多次洗脱，合并洗脱液并进行浓缩得到第一浓缩液；

3)调节所述第一浓缩液的pH至5.5～6.5，采用等体积的乙酸乙酯对所述第一浓缩液进行萃取、过滤，合并萃取液，减压浓缩得第二浓缩液；

4)硅胶柱层析纯化：

41)将所述第二浓缩液经环己烷处理分层，下层料液通过二氯甲烷溶解，得到上柱样品；

42)将硅胶通过二氯甲烷浸泡过夜后，匀浆湿法装柱，上样后，采用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并洗脱液并浓缩，HPLC检测跟踪，分别收集NVP018中间体HS457、HS496的粗品；

其中，所述的FS45结构式为：

所述的NVP018的结构式为：

所述HS457的结构式为：

所述HS496的结构式为：

优选地，所采用的链霉菌菌种为购自IsomeraseTherapeuticsLtd公司生产的Streptomycessp.BIOT-4746菌种。

进一步优选地，步骤1)的具体实施过程如下：

11)、一级种子培养

将保存在甘油管内的菌种接入灭好菌的摇瓶培养基中，置于摇床，220r/min，27℃培养36～48h，当pH达到5.2～5.4，PMV≥18％时，得到一级种子液；

其中，摇瓶培养基为：甘油40g/L、大豆蛋白胨(A3)10g/L、麦芽提取物21g/L，pH控制在7.0；

12)、二级种子培养

将400～800ml的一级种子液接入灭好菌的1000L二级种子培养基中培养，培养温度24～27℃，溶氧量＞30％，培养36～55h，当pH达到5.2～5.4，PMV≥20％时，得到二级种子液；

其中，二级种子培养基同步骤11)中的摇瓶培养基；

13)、发酵培养

将二级种子液以1～5％的接种量接种于灭菌好的25m³发酵培养基中培养，培养温度23～25℃，pH6.4～6.6，通气量1:0.8～1.0v/v/min，搅拌，溶氧量＞30％，在发酵24h时，加入底物FS45并分批加入非极性大孔吸附树脂，至发酵结束；

其中，发酵培养基组成如下：大豆粉45～55kg/m³，甘油55～65kg/m³，磷酸二氢钾0.8～1.2kg/m³，磷酸氢二钾0.8～1.2kg/m³，L-缬氨酸1.8～2.2kg/m³；

发酵过程中补加甘油，使发酵过程中甘油浓度控制在25g/L～35g/L。

优选地，骤1)中，所述树脂采用分批投加的方式加入到发酵液中，具体地，在发酵液发酵24h时加入50％～65％的所述树脂；在发酵110～120h时加入剩余的所述树脂。

进一步优选地，步骤1)中所述的树脂选自D101、LXT-081、AberliteXAD18树脂中的一种或多种的组合。

优选地，步骤4)中，HPLC检测、收集到HS457的粗品后，经合并、萃取、浓缩得到HS457的固体。

优选地，步骤4)中，HPLC检测、收集到HS496粗品后，还可对其进行二次硅胶柱层析，具体的：将二次硅胶柱层析所需的硅胶通过石油醚浸泡过夜，匀浆湿法装柱，取步骤4)中所得的HS496粗品上样，采用石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，合并洗脱液，并浓缩，HPLC检测跟踪，收集HS496样品，合并、萃取、浓缩得到HS496油状固体。

更进一步优选地，向得到的HS496油状固体中加入甲苯，搅拌离心，离心后再加入环己烷进行打浆、过滤、干燥得到粉末状的HS496固体。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1)本发明的分离提纯方法，在链霉菌发酵过程中，以分批补加的方式加入非极性大孔吸附树脂，使树脂的回收率增加了15～25％，并且HS457的含量提高了14.3％，很大程度上节约了成本；

2)现有技术中使用硅胶柱层析分离HS457，洗脱溶剂为乙酸乙酯-甲醇时HPLC检测纯度大于85％的收率偏低，而使用丙酮-环己烷为洗脱溶剂时HPLC检测纯度大于85％的收率仅有29.0％，总回收率为87％，并且溶剂使用量大，成本高；而本发明中利用硅胶柱层析分离纯化HS457，其洗脱溶剂为二氯甲烷-甲醇，HPLC检测其最高纯度可达到92％以上，纯度在85％以上收率可达到70％，样品总回收率可达到93％；

3)采用本发明的硅胶柱层析在分离纯化HS496时，HPLC检测其最高纯度可达到95％以上，纯度在85％以上的收率可达到70％，样品总回收率可达到95％；

4)经二次硅胶柱层析后，HS496为油状物，HPLC检测纯度大于85％，本发明可将HS496纯化为固体粉末状，收率为50％。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案作进一步的阐述。

实施例1链霉菌菌种培养

菌种：Streptomycessp.BIOT-4746(购自IsomeraseTherapeuticsLtd公司)

A、一级种子培养

将保存在甘油管内的菌种接入灭好菌的摇瓶培养基中，置于摇床，220r/min，27℃培养36～48h，当pH达到5.2～5.4，PMV≥18％时，得到一级种子液；

其中，摇瓶培养基组分：甘油40g/L，大豆蛋白胨(A3)10g/L，麦芽提取物21g/L，pH7.0，121±2℃灭菌30min；

B、二级种子培养

将400～800ml的一级种子液接入灭好菌的1000L二级种子培养基中培养，培养温度27℃，溶氧大于30％，培养36～50h，当pH达到5.2～5.4，PMV≥20％，得到二级种子液；

二级种子培养基同步骤A中的摇瓶培养基；

C、发酵培养

将二级种子液以1～5％的接种量接种于灭菌好的25m³发酵培养基中培养，培养温度24℃，pH6.5，通气量1:0.8～1.0v/v/min，搅拌，得到链霉菌发酵液，溶氧30％以上时，开始发酵；

其中，发酵培养基组成：大豆粉50kg/m³，甘油60kg/m³，磷酸二氢钾1kg/m³，磷酸氢二钾1kg/m³，L-缬氨酸2kg/m³，121±2℃，灭菌30min。

另配制质量百分比为60％的甘油置于储罐中，121℃灭菌30min，通过补加甘油，使发酵过程中甘油浓度控制在25g/L～35g/L。

实施例2

大孔吸附树脂的第一次纯化

在二级种子液接种到发酵培养基中发酵24h后，加入预处理好的10t底物FS45和1600kg非极性大孔吸附树脂，经110～120h培养，加入预处理并灭菌好的非极性大孔吸附树脂900kg，此时HS457含量可达175～185mg/L，继续培养至产物量不再增加，即为发酵结束。

其中，底物FS45提前一天溶解在DMSO中，加入发酵罐后，其终浓度控制在2mM/L；而非极性大孔吸附树脂则提前用甲醇浸泡过夜，水洗去甲醇，121℃灭菌30min再加入发酵罐中。另外，所选用的非极性大孔吸附树脂包括D101、LXT-081、AberliteXAD18树脂，当然也可选用其中的一种或多种的组合。

发酵结束后，将发酵液过50目的机械振动筛，将大孔吸附树脂与菌体分离，得到的树脂用1.5倍重量pH为2.5的酸性水溶液(可以是磷酸、盐酸、硫酸或甲酸)在反应釜中搅拌30分钟，过滤。过滤后的树脂加入等质量的乙腈，28℃搅拌1小时，洗脱三次，合并洗脱液减压浓缩，水浴温度42℃，真空度-0.09Mpa，浓缩至无馏分流出，得到第一浓缩液。

第一浓缩液用质量比为8％的NaOH水溶液调pH至6.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取，搅拌30分钟后过滤，静止分层，萃取两次，合并两次萃取的乙酸乙酯减压浓缩，水浴温度45℃，真空度-0.09MPa，浓缩至无馏分流出，得到第二浓缩液。

实施例3

HS457硅胶柱层析纯化

取4.5kg乙酸乙酯浓缩溶液进行预处理，加入等体积的环己烷搅拌30分钟，静止分层，去除上层环己烷相，量取下层料液相加二氯甲烷溶解后质量为18kg，测得HS457含量为17.11g/kg，待上柱。

装柱与上样：采用湿法装柱，湿法上柱；称取硅胶34kg二氯甲烷浸泡过夜，硅胶为100～200目，将浸泡过夜后的硅胶搅拌成匀浆，缓慢加入玻璃层析柱中，30cm×2m层析柱，多余二氯甲烷洗脱剂流出，上层加入1～2cm的无水硫酸钠，柱床总高度约1.5～1.6m；然后取18kg样品，均匀缓慢的加入到硅胶柱中。

HS457的纯化：用体积配比为100:0、99:1、98:2、97:3、96:4的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，HPLC检测跟踪，将收集到的各部分洗脱液合并浓缩；每个比例的溶剂洗脱时，洗脱到没有成分洗下为止，然后换下一个比例的溶剂；经HPLC检测HS457的最高纯度为92％，其中，将HPLC检测HS457纯度大于83％的样品收集合并，加等体积的水萃取2次，弃水相，保留二氯甲烷相，浓缩二氯甲烷相直至固体，质量为288g，HPLC检测HS457纯度为87％，含量75％(w/w)，计算收率为70％，将纯度低于83％的HS457合并浓缩待下次柱层析。将经多次柱层析得到的HS457的样品进行合并，其总回收率可达93％。

实施例4

HS496一次分离纯化

在实施例3中HS457分离纯化的同时，还可通过HPLC检测到分离产物中含HS496，HPLC检测HS496的最大纯度为95％，将纯度大于70％的组分合并浓缩后可进一步对其进行纯化，而将纯度低于70％的HS496合并后浓缩待下次柱层析。

HS496二次硅胶柱层析：

装柱与上样：采用湿法装柱，湿法上柱；称取硅胶120g石油醚浸泡过夜，硅胶为100～200目，将浸泡过夜后的硅胶搅拌成匀浆，缓慢加入玻璃层析柱中，80cm×4cm层析柱，多余石油醚洗脱剂流出，上层加入1～2cm的无水硫酸钠，柱床总高度约50～60cm；然后取一次分离纯化所得的HS496纯度大于70％组分55g，测得HS496含量为31.07mg/g，均匀缓慢的加入硅胶柱中。

HS496的纯化：用体积配比为1:7的石油醚-乙酸乙酯等度洗脱，HPLC检测跟踪，将各部分洗脱液收集合并浓缩；将HPLC检测HS496纯度大于83％的样品收集合并后，加等体积的水萃取2次，弃水相，保留二氯甲烷相，浓缩萃取至二氯甲烷相呈油状固体，质量为1.6g，HPLC检测HS496的纯度为86％，含量75％(w/w)，计算收率为70.22％；将纯度低于83％的HS496合并后浓缩待下次柱层析，将经多次柱层析得到的HS496的样品进行合并，测得其总回收率可达95％。

实施例5

HS496纯化为固体粉末

取实施例4得到的HS496油状固体1.6g加入2倍质量的甲苯，搅拌2小时后离心，离心得到的固体加入3倍质量的环己烷，打浆，搅拌均匀，过滤后干燥，得到固体粉末状HS4960.8g，计算收率为50％。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。