一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法

摘要

本发明公开了一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，属于酶工程技术领域。本发明通过脂肪酶体外重塑过程中添加不同的调节因子，获得具有高酯化活性的重构脂肪酶，以满足脂肪酶非水相催化的需要。将不具有酯化活性或者活性较低的各种微生物脂肪酶，包括大肠杆菌工程菌外源表达的脂肪酶以及商品脂肪酶，经8M尿素变性处理，在复性过程中添加从华根霉细胞提取的膜环境复合物WTS，可获得酯化活性显著提高的活性重塑脂肪酶，同时脂肪酶常见的水解活性也发生变化。酯化活性的恢复使脂肪酶更适合工业化应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三酰甘油酯水解酶，是一种广泛存在于动物、植物和多种微生 物中的生物催化剂，最早发现于1901年，其主要催化功能在于可以在水-脂界面水解长链三 脂酰甘油酯。脂肪酶之所以在生物催化中倍受关注，除了其具有催化化合物酯键水解的能力 外，还由于脂肪酶在非水相中可以催化反向的酯化反应和转酯化反应，因而在生物化工领域 受到广泛的重视。脂肪酶能够进行非常特殊的化学转化(生物转化)使得它们在食品，洗涤 剂，化妆品，有机合成和制药工业中日益流行。例如加工食品，治理废水，生物表面活性剂 的合成，处理木材纤维素纸浆纸树脂，手性药物的生物合成等。此外，脂肪酶还具有稳定性 佳，转化效率高等优点，在芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中具有良好的应用价值。

虽然脂肪酶都具有催化各种化合物酯键水解的能力，但是能够催化非水相酯化反应的脂 肪酶种类却非常有限，绝大部分微生物脂肪酶都不表现出明显的催化非水相酯合成的能力。 有些脂肪酶在异源表达之后也只表现出显著的水解活性，相对于其野生型的脂肪酶严重丧失 了催化酯类合成的能力。这一现象严重制约了脂肪酶在工业生产中的应用。

一些蛋白质修饰技术可以用来调节和提高酶的活性，如有机溶剂修饰、固定化技术等， 但这些技术往往无法从本质上改变脂肪酶的催化性能。蛋白质的变性复性技术也可以调整蛋 白质的活性，主要应用于包涵体的复性。许多真菌蛋白在细菌中无法表达或以无活性的包涵 体形式存在。通常使用高浓度的还原剂使包涵体进行可逆变性，通过稀释或透析降低还原剂 的浓度，从而使蛋白在低浓度或无还原剂的情况下重新折叠形成可溶的蛋白溶液。也有学者 通过在包涵体的复性过程中加入有机溶剂、表面活性剂等促进包涵体的溶解。然而大部分包 涵体经过变复性处理后，仍旧达不到理想的活性，通过变性复性处理通常更不会使得蛋白质 催化活性发生转变或得到其他活性重塑。

发明内容

为了解决上述问题，本发明通过添加膜环境复合物，为变性的脂肪酶蛋白肽链提供一个 类似膜的模拟疏水环境，在缓慢复性的过程当中使脂肪酶重新折叠形成适当的高级构象，从 而实现催化酯化反应能力的恢复，对于其他脂肪酶的改造和制备也提供了有价值的方案。

本发明提供了一种改变脂肪酶催化活性的活性重塑方法，利用添加环境因子的结构重塑 方法获得具有高酯化活性的脂肪酶。本发明采用体外重折叠的方法对脂肪酶进行处理，获得 了具有催化酯合成能力的脂肪酶，解决了许多脂肪酶不表现酯化活性以及脂肪酶在工程菌异 源表达后丧失酯合成能力的问题，为拓宽脂肪酶的工业应用奠定了基础。

所述活性重塑方法，是对脂肪酶进行变性和复性处理，在变性或者复性的过程中添加膜 环境复合物，模拟天然细胞环境，使复性的脂肪酶重新恢复合成酯的能力，获得高的酯合成 活性。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为外源表达的华根霉成熟肽脂肪酶(包括包涵 体)、华根霉脂肪酶r27RCL、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M、洋葱假单胞菌脂 肪酶62309或南极假丝酵母脂肪酶CALB。

在本发明的一种实施方式中，所述变性处理是采用常规的变性方法对脂肪酶进行处理。

在本发明的一种实施方式中，所述变性处理，可以是用高浓度尿素、盐酸胍等变性剂处 理，溶解脂肪酶蛋白样品。

在本发明的一种实施方式中，所述变性处理具体是：在脂肪酶的蛋白溶液中缓慢加入尿 素粉末，低温下搅拌，测定水解活性，活性完全丧失即判断三级结构完全打开形成肽链，蛋 白全部变性；离心取上清。

在本发明的一种实施方式中，所述变性处理后的蛋白，调整至蛋白浓度不高于2.5 mg·mL^-1，以保证蛋白能够完全的进行复性。

在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物是指来自华根霉菌体细胞的膜环境复合 物。

在本发明的一种实施方式中，所述华根霉是以下任意一种或者多种：华根霉CCTCC M201021、CCTCCAF93141、CCTCCAF93158、CICC3091、CICC40720(均为已公开或可 购买得到的菌株，不需要提交保藏证明)。

在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，是先从培养好的华根霉菌体上 利用TritonX-100、CHAPS、Tween80、脱氧胆酸等表面活性剂提取膜环境复合物及膜结合蛋 白，然后通过吸附提取液中的表面活性剂使膜结合蛋白沉淀，经离心分离后所得上清液即为 膜环境复合物。

在本发明的一种实施方式中，所述吸附是使用美国bio-rad伯乐公司Bio-BeadsSM-2吸 附剂吸附去除表面活性剂。

在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物的提取，具体是：(1)利用华根霉菌体 经丙酮洗涤制备丙酮粉；(2)将丙酮粉悬浮于磷酸缓冲液中，搅拌、离心、取沉淀、洗涤两 次以上，然后将洗涤后的沉淀重新悬浮于含有0.05-0.15％TritonX-100的磷酸缓冲液中，搅 拌、离心，将得到的沉淀悬浮于1-2％TritonX-100磷酸缓冲液中，振荡4-12小时、离心，得 到的上清液为膜环境复合物及膜结合蛋白；(3)在提取液中加入吸附剂Bio-beads，振荡、 离心，所得上清液即为膜环境复合物WTS。

在本发明的一种实施方式中，所述野生型膜结合脂肪酶RCL提取过程中悬浮或者重悬， 是将固体(比如丙酮粉或者沉淀)按照m/v为1:8-1:12的比例。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为2.5mmol·L^-1pH6.2磷酸缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)或步骤(2)的搅拌、离心，是用磁力搅拌 3-10min、在8000-12000r·min^-1离心12-18min。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)或(3)中的振荡、离心，是在4℃温和振 荡4-12h、于12000-15000r·min^-1下离心15-30min。

在本发明的一种实施方式中，所述膜环境复合物短期内4℃储存备用。

在本发明的一种实施方式中，所述复性是将变性处理得到的蛋白溶液与膜环境复合物混 合，然后装入透析袋中进行透析复性。

在本发明的一种实施方式中，所述蛋白溶液与膜环境复合物是按照体积比1:1混合。

在本发明的一种实施方式中，所述透析复性，是透析袋经6M-4M-2M-0M尿素-PBS 透析液梯度透析，使蛋白充分复性。

在本发明的一种实施方式中，所述透析复性，具体是：先放置于6M尿素的磷酸缓冲液 中，待透析袋内外盐平衡之后，将透析液更换为4M尿素的磷酸缓冲液，然后更换为2M尿 素的磷酸缓冲液，再更换为不含尿素的磷酸缓冲液，透析结束后取出复性蛋白，离心得上清 液即为重折叠的脂肪酶。

在本发明的一种实施方式中，所述活性重塑方法，在变性或复性时单独添加膜环境复合 物，或者同时添加膜环境复合物和表面活性剂。

在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂为CHAPS等两性离子表面活性剂、 DDM、C₁₂E₈、-EM非离子表面活性剂、CTAB阳离子表面活性剂等多种，其中Triton X-100、DiC₆PC或者LPC14效果较好。但不限于上述表面活性剂。

在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂的添加量为0.1～100mM。

在本发明的一种实施方式中，同时添加的表面活性剂后，可以进一步提高华根霉脂肪酶 r27RCL、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M、洋葱假单胞菌脂肪酶62309、南极假丝 酵母脂肪酶CALB等的酯化活性和/或总酯化活性回收率。

本发明的有益效果：

(1)蛋白质的构象及性质与其所处的环境紧密相关，本发明通过添加膜环境复合物，模 拟蛋白折叠所处的细胞膜微环境对脂肪酶进行体外活性重塑改造，实现脂肪酶酯合成能力的 恢复，成功获得恢复了高酯化活性的可溶性脂肪酶。

(2)本发明的方法对E.coli表达的华根霉成熟肽脂肪酶RCL及其包涵体、毕赤酵母Pichia pastoris表达的华根霉脂肪酶r27RCL、商品化黑曲霉脂肪酶A、商品化疏棉状嗜热丝孢菌脂 肪酶LipozymeTL1M、商品化洋葱假单胞菌脂肪酶62309、商品化南极假丝酵母脂肪酶CALB 等多种脂肪酶均可适用，能够使脂肪酶酯化活性从无变有或者提高2.2-260倍、总酯化活性回 收率达105％-299％。

(3)本发明还通过在变性或者复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂，进一步提高 了华根霉脂肪酶r27RCL、疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M、洋葱假单胞菌脂肪酶 62309、南极假丝酵母脂肪酶CALB等脂肪酶酯化活性和/或总酯化活性回收率。

具体实施方式

脂肪酶测定方法：

(1)对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)法测定脂肪酶水解活力：

脂肪酶水解pNPP产生对硝基苯酚和棕榈酸，对硝基苯酚在pH8.0的缓冲中显黄色，且 在410nm波长处有最大的吸收峰，通过测定对硝基苯酚在410nm处的吸收值可测定脂肪酶 的活力。

反应底物：

底物一：0.25g阿拉伯胶+0.52g脱氧胆酸钠用50mmol·L-1的pH＝8.0的磷酸buffer定容 至450mL。底物二：0.015gpNPP溶于5mL异丙醇。底物一和二混合后备用。

终止液(g·L-1)：NaOH40g，EDTA钠盐93.05g。反应终止后加入62μL。

测定方法：

在2.4mL的上述底物中，加入0.1mL适当稀释的酶液(空白对照用稀释的失活酶液代 替)，40℃条件下反应2min后测定410nm处的吸光度。

酶活定义：

40℃条件下每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活单位。

计算公式：

酶活(U·mL^-1)＝(V×A410×106)/(ε×t×V’)

其中：V—反应体积(mL)；ε—摩尔消光系数(mL·mmol-1)；t—反应时间(min)；V’— 酶液体积(mL)

(2)气相色谱法测定脂肪酯化活力：

反应底物：

底物一：取48.5mL正辛酸加入250mL容量瓶，正庚烷定容。

底物二：取17.5mL无水乙醇加入250mL容量瓶，正庚烷定容。

内标：

2-己醇/庚烷(35g·L^-1)

标准样品：

取10g正辛酸乙酯加入1000mL容量瓶，正庚烷定容。

测定方法：

分别取1mL两种反应底物于5mL具塞塑料管中，加入约20mg脂肪酶粉(或冻干粉)， 40℃，150r·min^-1下振荡反应30min。膜过滤或离心除去脂肪酶，取0.4mL滤液或上清液， 加入0.1mL内标2-己醇，混匀，以气相色谱法根据辛酸乙酯标样与内标峰面积之比测定反应 液中辛酸乙酯的含量。

气相色谱仪为Agilent6820，色谱柱为AC20(PEG20000)，配备氢火焰离子检测器，以氮 气为载气。气相色谱分析条件为：色谱柱初始温度90℃，保持1min，10℃·min^-1升温至200 ℃，保持5min，检测器温度250℃，进样器温度250℃。

酶活定义：

在测定条件下，每分钟转化形成1μmol辛酸乙酯所需的酶量定义为1个脂肪酶有机相合 成酶活单位。

计算公式：

A_样—待测样品与内标峰面积之比

A_标—标准标样与内标峰面积之比

S_标—标准样品的浓度(g·L^-1)

V—反应液体积(L)

172—产物(正辛酸乙酯)分子量(g·mol^-1)

30—反应时间(min)

m—反应酶粉质量(mg)

实施例1：膜环境复合物WTS的提取

从培养好的华根霉菌体上利用TritonX-100、CHAPS、Tween80、脱氧胆酸等表面活性剂 提取膜环境复合物及膜结合蛋白，然后通过美国bio-rad伯乐公司Bio-BeadsSM-2吸附剂吸 附提取液中的表面活性剂使膜结合蛋白沉淀，经高速离心分离后所得上清液即为膜环境复合 物。具体方法如下：

华根霉CCTCCM201021在马铃薯－葡萄糖琼脂培养基30℃培养3d，用无菌水洗下孢 子。200μl孢子悬浮液接种到含20mL发酵培养基的摇瓶(250mL三角瓶)中，于30℃、 150r·min^-1条件下培养72h。孢子悬浮液浓度约为10⁷个·ml^-1。菌体培养结束后，沙布过滤收 集菌丝体，以去离子水充分洗涤两次，再以25mmol·L^-1，pH7.5的磷酸缓冲洗涤一次，-70℃ 预冷冻，冷冻干燥机冻干(约24h)，水分含量低于4％。冻干菌体称重作为菌体干重。

将收集得到每克菌体加入10mL丙酮溶剂中，于室温下磁力搅拌30min，抽滤除去溶剂， 真空干燥过夜得到干燥的丙酮粉，于4℃下储存备用。然后将上述方法制得的将丙酮粉每克 悬浮于10倍体积的2.5mmol·L^-1pH6.2磷酸缓冲液中，于室温下磁力搅拌5min，经10000 r·min^-1离心15min，沉淀重复上述步骤洗涤两次。将洗涤后得到的沉淀在悬浮于相同体积含 0.1％TritonX-100的2.5mmol·L^-1pH6.2磷酸缓冲液当中，室温下磁力搅拌5min，10000 r·min^-1离心15min，将所得沉淀悬浮于相同体积含去污剂1.5％TritonX-100的2.5mmol·L^-1pH 6.2的磷酸缓冲液中，于4℃温和振荡4h，于15000r·min^-1下离心15min，得到上清液作为 膜结合脂肪酶粗酶液。在粗酶液中加入过量Bio-beads，4℃温和振荡过夜，12000r·min^-1离 心30min，转移上清到新管中，上清即为膜成分复合体WTS，短期内4℃储存备用。沉淀 WTP用2.5mmol·L^-1pH6.2的磷酸缓冲液洗涤两次，以除去残余的Beads成份，4℃下12000 r·min^-1离心5分钟，弃去上清收集沉淀，-20℃储存备用。

实施例2：活性重塑方法

按以下任意一种方法进行体外重折叠：

方案A：在复性时添加膜环境复合物

(1)蛋白变性：取脂肪酶蛋白溶液或悬浮液，低温震荡下每毫升溶液中缓慢加入0.5g 研磨好的尿素粉末，4℃下磁力搅拌2-4h，每半小时取出100μL进行水解活性的测定，活 性完全丧失即判断三级结构完全打开形成肽链，蛋白全部变性。将变性蛋白12000r·min^-1离 心10min，取上清进行浓度测定，确保蛋白浓度不高于2.5mg·mL^-1，以保证蛋白能够完全 的进行复性。(2)蛋白复性：以1：1的体积比加入过量制备好的膜环境复合物，磁力搅拌 5-10min充分混匀后，将蛋白溶液装入预处理好的透析袋中进行透析复性处理。将先将透析 袋放置于6M尿素2.5mmol·L^-1pH6.2复性透析缓冲液中，4℃下温和磁力搅拌30min到 40min，待透析袋内外盐平衡之后，将透析液更换为4M尿素2.5mmol·L^-1pH6.2复性透析 缓冲液，4℃下温和磁力搅拌60min。待透析袋内外盐平衡后，将透析液更换为2M尿素2.5 mmol·L^-1pH6.2复性透析缓冲液，4℃下温和磁力搅拌60min，待透析袋内外盐平衡后，将 透析液更换为不含尿素的2.5mmol·L^-1pH8.0复性透析缓冲液后(此步可进行若干次重复)， 4℃下温和磁力搅拌过夜透析。

透析结束后将复性蛋白从透析袋中取出，于4℃下12000r·min^-1离心10min，上清液即 为重折叠后的脂肪酶蛋白，4℃下短期保存备用。

方案B：在变性时添加膜环境复合物

以1：1的体积比将制备好的膜环境复合物添加到脂肪酶蛋白溶液或悬浮液中，然后再进 行后续变性处理，而复性时不加膜环境复合物，其他步骤与方案A一致。

方案C：在复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂，其他步骤与方案A一致。

方案D：在添加膜环境复合物的同时添加表面活性剂，其他步骤与方案B一致。

实施例3：大肠杆菌异源表达华根霉成熟肽脂肪酶MP₁活力的恢复

根据华根霉脂肪酶全基因组序列设计引物，PCR扩增获得华根霉成熟肽脂肪酶基因 A06672(华根霉基因组基因编号http://genome.jgi.doe.gov/Rhich1/Rhich1.home.html)连接表 达载体6xHis-MBP₃-TEV-pET15(将pQEH6MBP中N端带有6xHis标签并含有TEV蛋白酶 切位点的MBP融合蛋白基因片段(J.Am.Chem.Soc.2012,134,375–385)插入到pET15构建 而成)，转化E.coliBL21trxB(DE3)，IPTG诱导获得融合蛋白MBP_(His)8-MP₁，HisTrap纯化后 经TEV蛋白酶酶切，再经由HisTrap和DEAE柱纯化得到纯酶MP₁。

按照实施例2的方案B和方案A分别进行变性时添加膜环境复合物和复性时添加膜环境 复合物活性重塑处理，处理后，蛋白溶液直接进行水解活性的测定，并取适量蛋白溶液冻干 为酶粉后进行酯化活性的测定。结果显示，这两个方案都能显著提供酯化活性，其中变性时 添加膜环境复合物进行活性重塑的方案B下，测得酯化活性由0.93U·mg^-1提高到5.26U·mg^-1， 提高了5.6倍，酯化活性总活力回收率达到441％(如表1所示)。

表1活性重塑前后外源表达华根霉成熟肽脂肪酶的酯化活性和水解活性对比

其中，

实施例4：大肠杆菌异源表达华根霉成熟肽脂肪酶MP1包涵体活力的恢复

根据华根霉脂肪酶全基因组序列设计引物，PCR扩增获得华根霉成熟肽脂肪酶基因 A06672(华根霉基因组基因编号http://genome.jgi.doe.gov/Rhich1/Rhich1.home.html)连接表 达载体pET-22b转化E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导后收集菌体，细胞破碎离心后获得外源表 达蛋白MP1包涵体。

将包涵体蛋白悬浮于磷酸缓冲液中，按照实施例2的方案B和方案A分别进行变性时添 加膜环境复合物和复性时添加膜环境复合物活性重塑处理，进行活性重塑处理后，蛋白溶液 直接进行水解活性的测定，并取适量蛋白溶液冻干为酶粉后进行酯化活性的测定。结果如表 2所示，测得酯化活性由0.03U·mg-1分别提高到3.1U·mg^-1和5.1U·mg^-1，提高了近103.3倍 和170倍，变性时添加膜环境复合物处理使酯化活性总活力回收率达到814.3％，复性时添加 膜环境复合物处理使酯化活性总活力回收率达到1028.6％；水解活性由0.9U·mg^-1分别改变为 0.4U·mg^-1和0.5U·mg^-1，略有下降。水解活性总活力回收率分别达到4％和3.5％。

表2活性重塑前后外源表达华根霉成熟肽脂肪酶包涵体的酯化活性和水解活性对比

实施例5：商品化华根霉脂肪酶r27RCL活力的恢复

商品化的华根霉脂肪酶r27RCL购自江苏一鸣生物科技有限公司，具有较高的水解活性， 但不具有合成酯的能力。将该脂肪酶酶粉复溶后取上清进行活性重塑处理，结果如表3所示， 酯化活性由1U·mg^-1提高到18U·mg^-1，总酯化活性回收率达到132.5％，同时水解活性由1328 U·mg^-1降低为735U·mg^-1；若在复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂TritonX-100，则 酯化活性提高到31U·mg^-1，总酯化活性回收率达到225.4％，同时水解活性恢复到1363U·mg^-1。

表3活性重塑前后的华根霉脂肪酶r27RCL的酯化活性和水解活性对比

实施例6：商品化黑曲霉脂肪酶A活力的恢复

商品化的黑曲霉脂肪酶A购买自Amano公司，非固定化酶制剂粉末，复溶后取上清进 行活性重塑处理，结果如表4所示，酯化活性由0U·mg^-1提高到4.2U·mg^-1，总酯化活性回收 率达到257％。

表4活性重塑前后的黑曲霉脂肪酶A的酯化活性和水解活性对比

实施例7：商品化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M活力的恢复

商品化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M购买自Novozymes公司，非固定化酶 制剂粉末，复溶后取上清进行活性重塑处理(复性时单独添加膜环境复合物，或者同时添加 膜环境复合物和表面活性剂)。结果如表5所示，酯化活性由0.8U·mg^-1提高到8.3U·mg^-1， 总酯化活性回收率达到269％。其中添加膜环境复合物和表面活性剂是指在复性过程中同时添 加这两者，表面活性剂的添加量为1.5％(v/v)TritonX-100。

表5活性重塑前后的LipozymeTL1M的酯化活性和水解活性对比

实施例8：商品化洋葱假单胞菌脂肪酶62309活力的恢复

商品化洋葱假单胞菌脂肪酶62309购买自Sigma-Aldrich公司，非固定化酶制剂粉末，复 溶后取上清进行活性重塑处理(复性时单独添加膜环境复合物，或者同时添加膜环境复合物 和表面活性剂)，结果如表6所示，酯化活性由0.3U·mg^-1提高到16U·mg^-1，总酯化活性回 收率达到196％。若在复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂TritonX-100，则酯化活性 提高到78U·mg^-1，总酯化活性回收率达到299％。

表6活性重塑前后的洋葱假单胞菌脂肪酶62309的酯化活性和水解活性对比

实施例9：商品化南极假丝酵母脂肪酶CALB活力的恢复

商品化南极假丝酵母脂肪酶CALB购买自Novozymes公司，非固定化酶制剂粉末，复溶 后取上清进行活性重塑处理(复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂)，结果如表7所 示，在复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂TritonX-100，则酯化活性由23U·mg^-1提 高到73U·mg^-1，总酯化活性回收率达到105％。

表7活性重塑前后的南极假丝酵母脂肪酶CALB的酯化活性和水解活性对比

实施例10：不同表面活性剂对商品化华根霉脂肪酶r27RCL活力恢复的影响

商品化生产的华根霉脂肪酶r27RCL具有较高的水解活性，但不具有合成酯的能力。将 该酶制剂酶粉复溶后取上清酶液采用实施例2的方案A和C进行活性重塑处理，酯化活性由 0.019U·mg^-1提高到1.56U·mg^-1，总酯化活性回收率达到451.6％；若在添加膜环境复合物复 性时，同时添加不同表面活性剂TritonX-100，DiC₆PC和LPC14，，则酯化活性分别可提高 到2.04U·mg^-1，3.19和6.26U·mg^-1，总酯化活性回收率分别达到1068.3％，1035.1％和 1892.2％，表明不同表面活性剂对于该蛋白活性重塑也有一定的影响(表7)。

表8不同表面活性剂对脂肪酶酯化活力恢复的影响

综上，本发明通过模拟蛋白折叠所处的细胞微环境对脂肪酶进行体外活性重塑改造，成 功获得恢复了高酯化活性的可溶性脂肪酶。工程菌大肠杆菌E.coli表达的可溶性华根霉成熟 肽脂肪酶MP₁经重塑后酯化活性由0.93U·mg^-1提高到5.26U·mg^-1，酯化活性总活力回收率达 到441％；而工程菌表达的华根霉成熟肽脂肪酶包涵体，经活性重塑后酯化活性由0.03U·mg^-1提高到3.1～5.1U·mg^-1，提高了103.3～170倍，酯化活性总活力回收率达到814.3～1028.6％； 工程菌巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris表达的带有27个前导肽氨基酸的华根霉脂肪酶r27RCL 经重塑后酯化活性由1U·mg^-1提高到31U·mg^-1，总酯化活性回收率达到225.4％；商品化黑曲 霉脂肪酶A经重塑后酯化活性由0U·mg^-1提高到4.2U·mg^-1，总酯化活性回收率达到257％； 商品化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LipozymeTL1M经重塑后酯化活性由0.8U·mg^-1提高到8.3 U·mg^-1，总酯化活性回收率达到269％；商品化洋葱假单胞菌脂肪酶62309经重塑后酯化活性 由0.3U·mg^-1提高到78U·mg^-1，总酯化活性回收率达到299％；商品化南极假丝酵母脂肪酶 CALB经重塑后酯化活性由23U·mg^-1提高到73U·mg^-1，总合酯化活性回收率达到105％。酯 化活性相对比活力及总活力回收率的共提高，表明体外模拟细胞微环境的活性重塑处理对脂 肪酶的活性恢复产生了积极影响，并且不仅针对华根霉脂肪酶有效，而在一定程度上对多种 脂肪酶具有普遍适用性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。